蛋白纯化工艺调试技师考试试卷及答案

蛋白纯化工艺调试技师考试试卷及答案一、填空题（每题1分，共10分）1.蛋白纯化中最常用的盐析试剂是______。2.离子交换层析中，分离带正电蛋白用______离子交换柱。3.基于考马斯亮蓝结合的蛋白定量法是______法。4.His-tag重组蛋白纯化的亲和配体是______。5.层析柱柱效用______数表示。6.蛋白冻干常用保护剂（举1例）：______。7.细胞破碎物理方法（举1例）：______。8.超滤截留分子量（MWCO）选目标蛋白的______倍左右。9.变性电泳检测蛋白纯度的方法是______。10.疏水层析蛋白结合需______（高/低）盐浓度。二、单项选择题（每题2分，共20分）1.蛋白纯化第一步通常是（）A.层析分离B.样品预处理C.盐析D.透析2.离子交换层析洗脱关键参数是（）A.温度B.流速C.盐浓度/pHD.柱体积3.疏水层析蛋白洗脱需（）A.降低盐浓度B.提高盐浓度C.改变pHD.加变性剂4.蛋白浓缩不包括（）A.超滤B.盐析C.透析D.冻干5.His-tag纯化中咪唑作用是（）A.结合蛋白B.洗脱蛋白C.稳定蛋白D.去杂质6.蛋白纯度高效检测法是（）A.SDSB.反相HPLCC.紫外280nmD.Bradford法7.盐析沉淀顺序取决于（）A.分子量B.等电点C.溶解度D.电荷数8.亲和层析特异性来自（）A.配体-蛋白特异性结合B.柱体积C.流速D.pH9.冻干前需去除的试剂是（）A.蔗糖B.缓冲盐C.甘露醇D.甘油10.超滤回收率低可能因（）A.MWCO过大B.MWCO过小C.流速过慢D.温度过低三、多项选择题（每题2分，共20分，多选/少选/错选不得分）1.样品预处理步骤包括（）A.细胞破碎B.离心除渣C.过滤除菌D.透析脱盐2.蛋白定量方法有（）A.BradfordB.BCAC.LowryD.紫外280nm3.亲和层析应用场景（）A.抗体纯化（ProteinA/G）B.His-tag纯化C.酶-底物纯化D.疏水蛋白纯化4.离子交换层析类型（）A.阴离子（DEAE）B.阳离子（CM）C.疏水交换D.亲和交换5.蛋白降解原因（）A.蛋白酶污染B.温度过高C.pH不适D.机械剪切力6.疏水层析填料基质（）A.琼脂糖B.硅胶C.葡聚糖D.聚苯乙烯7.冻干优点（）A.长期稳定B.去水分C.保留活性D.浓缩蛋白8.层析柱装填要求（）A.无气泡B.均匀紧密C.流速稳定D.柱效高9.蛋白电泳类型（）A.SDSB.琼脂糖电泳C.等电聚焦D.双向电泳10.影响纯化效率的因素（）A.表达量B.蛋白溶解性C.标签效果D.细胞破碎程度四、判断题（每题2分，共20分，√/×）1.盐析只能沉淀蛋白，不能分离不同蛋白。（）2.带负电蛋白用阳离子交换柱。（）3.超滤可同时浓缩和脱盐。（）4.Ni柱配体是共价结合的Ni²⁺。（）5.疏水层析低盐结合、高盐洗脱。（）6.SDS迁移率取决于分子量。（）7.冻干保护剂防止蛋白变性。（）8.层析流速越快分离效果越好。（）9.紫外280nm可定量未知纯度蛋白。（）10.超声功率越大破碎效果越好。（）五、简答题（每题5分，共20分）1.简述蛋白纯化“捕获阶段”的目的和常用技术。答案：捕获阶段核心目的是快速富集目标蛋白，去除大部分杂质（核酸、多糖、杂蛋白），减少后续纯化压力。常用技术：①亲和层析（His-tag、GST标签柱，特异性富集）；②离子交换层析（电荷差异初步分离）；③疏水层析（高盐下结合）；④盐析（硫酸铵沉淀浓缩）。需兼顾回收率和速度，避免蛋白降解。2.离子交换层析如何选择缓冲液pH？答案：①远离目标蛋白等电点（pI）：阴离子柱（负电蛋白）pH＞pI，阳离子柱（正电蛋白）pH＜pI；②缓冲液pKa与目标pH接近（±1），保证缓冲能力。例：pI=6.0的蛋白用阴离子柱，选pH7.0-8.0，缓冲液用Tris-HCl（pKa≈8.1）。3.疏水相互作用层析（HIC）原理？答案：基于蛋白表面疏水区域与填料疏水配体的可逆作用。高盐（1-2M硫酸铵）下，盐破坏水化膜，蛋白疏水区域暴露并结合填料；降低盐浓度时，水化膜重建，蛋白按疏水强弱依次洗脱（弱疏水先洗）。无需变性，保留蛋白活性。4.蛋白纯化中如何减少降解？答案：①低温操作（4℃/冰浴），降低蛋白酶活性；②加蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA）；③快速处理，避免机械剪切；④优化缓冲液（合适pH/离子强度）；⑤去除蛋白酶污染（过滤/离心除细胞碎片）。六、讨论题（每题5分，共10分）1.His-tag蛋白洗脱后纯度低，原因及解决方法？答案：①非特异性结合：平衡缓冲液加20mM咪唑，用线性咪唑梯度（20-500mM）洗脱；②标签包埋：加0.1%TritonX-100促进暴露，或换真核表达系统改善折叠；③蛋白酶降解：加抑制剂，全程低温；④柱效低：重新装填柱或换新Ni填料。2.如何评估蛋白纯化工艺稳定性？答案：①重复性：3-5次纯化，回收率/纯度/活性CV≤5%；②鲁棒性：改变关键参数（流速±20%、pH±0.5），观察指标变化；③批次一致性：不同原料纯化后指标一致；④长期稳定性：储存1个月活性保留≥90%；⑤监控CQA（纯度、内毒素、聚体）。答案汇总一、填空题1.硫酸铵2.阳3.Bradford4.镍离子（Ni²⁺）5.理论塔板6.蔗糖（甘露醇/海藻糖）7.超声破碎（高压匀浆/冻融）8.1/3-1/29.SDS.高二、单选题1.B2.C