CN119432744A 使神经细胞分化的方法及相关组合物和使用方法 （艾斯本神经科学公司）

202180020647.92021.01.13使神经细胞分化的方法及相关组合物和使向多巴胺(DA)神经元祖细胞和/或DA神经元的方退行性疾病和病状，包括帕金森病的组合物用2(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干(i)TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂，其中所述TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制是SHH或嘌吗啡胺；或者其中所述至少一种SHH信号传导激活剂包含选自SHH和嘌吗啡胺的(iii)骨形态发生蛋白(BMP)信号传导抑制剂，其中所述BMP信号传导抑制剂是(iv)糖原合酶激酶3β(GSK3β)信号传导抑制剂，其中所述GSK3β信号传导抑制剂是其中第0天对应于所述第一次温育的启动，并且其中从第0天开始至第6天，包括每一(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条件下4.根据权利要求1_3中任一项所述的方法，其中在使所述细胞神经分化的条件下培养Notch信号传导抑制剂。3述收获在第18天至第25天之间进行，和/或其中所述收获在第18天或约在第18天或约在第7.根据权利要求1_6中任一项所述的方法，其中所述神经分化细胞是定向多巴胺能神10.根据权利要求1_9中任一项所述的方法，其中所述第一次温育和/或所述第二次温或第20天暴露于Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号传导抑制剂，任选地其中所述ROCK抑制剂是12.根据权利要求1_11中任一项所述的方法，其中每天或每隔一天或每三天更换所述13.根据权利要求5_12中任一项所述的方法，其还包括用低温保护剂配制所收获的细其中所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是自体的或者对于待用所任选地其中所述多能干细胞经工程改造以(a)去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分配制包含分化细胞的治疗组合物，任选地其中所述组合物的细胞表达EN且所述组合物中总细胞少于10％表达TH，和/或其中所述组合物包含源自多能干细胞的多(a)大于约2x10_5的每百万计数(CPM)N45和使用方法(METHODOFDIFFERENTIATINGNEURALCELLSANDRELATEDCOMPOSITIONS[0005]考虑到使多能干细胞分化成谱系特异性细胞群的各种方法和所得的细胞组合物[0007]在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂直6[0009]在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述BMP信号传导抑制剂直至第11天当天或[0010]在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述GSK3β信号传导抑制剂直至第13天当天或之前的一天。在一些实施方案中，所述细胞暴露于所述GSK3β信号传导抑制剂直到第12括将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(BDNF)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)；(iv)二丁酰环AMP(dbcAMP)；(v)转化生长因子β_3(TGFβ3)(统称为BAGCT和Notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于BAGCT和7[0017]在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2、约0.1x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2、约0.1x106个细胞/c0.8x106个细胞/cm2、约0.1x106个细胞/cm2至cm2至约0.4x106个细胞/cm2、约0.1x106个细胞/cm2至约0.2x106个细胞/cm2、约0.2x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2、约0.2x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2、约0.2x106个细胞/cm2至约0.8x106个细胞/cm2、约0.2x106个细胞/cm2至约0.6x106个细胞/cm2、约0.2x106个细胞/cm2至约0.4x106个细胞/cm2、约0.4x106个细胞/cm2至约2x106个细个细胞/cm2、约0.4x106个细胞/cm2至约0.6x106个细胞/cm2、约0.x106个细胞/cm2、约0.6x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2、约0.6x106个细胞/cm2至约0.8x106个细胞/cm2、约0.8x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2、约0.8x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2或约1.0x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.1x106个细胞/cm2至约0.8x106个细6个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养多能干细胞的培养包括约0.2x106个细胞/cm2至约0.4x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约0.4x106个细胞/cm2至约0.8x106个细胞/cm28约0.8x106个细胞/cm2至约1x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括约1.0x106个细胞/cm2至约2x106个细胞/cm2。第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1x106个多能干细胞/孔至约20x106个干细胞/孔至约10x106个多能干细胞/孔、约1x106个多能干细胞/孔至约5x106个多能干细胞/孔、约5x106个多能干细胞/孔至约20x106个多能干细胞/孔、约5x106个多能干细胞/孔至约15x106个多能干细胞/孔、约5x106个多能干细胞/孔至约10x106个多能干细胞/孔、约10x106个多能干细胞/孔至约20x106个多能干细胞/孔、约10x106个多能干细胞/孔至约15x106个多能干细胞/孔或约15x106个多能干细胞/孔至约20x106个多能干细能干细胞/孔至约20x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1x106个多能干细胞/孔至约15x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约1x106个多能干细胞/孔至约10x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约5x106个多能干细胞/孔至约20x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约5x的培养在6孔板中进行并且包括约5x106个多能干细胞/孔至约10x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约10x106个多能干板中进行并且包括约10x106个多能干细胞/孔至约15x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在6孔板中进行并且包括约15x106个多能干细胞/孔至约[0019]在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1x105个多能干细胞/孔至约5x106个多能干细胞/孔、约1x105个多能干细胞/孔至约1x10多能干细胞/孔至约5x105个多能干细胞/孔、约5x105个多能干细胞/孔至约5x106个多能干细胞/孔、约5x105个多能干细胞/孔至约1x106个多能干细胞/孔或约1x106个多能干细中进行并且包括约1x105个多能干细胞/孔至约5x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约1x105个多能干细胞/孔至约1x括约1x105个多能干细胞/孔至约5x105干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约5x105个多能干细胞/孔至约5x106个多能干细胞/孔。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养在24孔板中进行并且包括约5x105个9在24孔板中进行并且包括约1×106个多能干细胞/孔至约5×106实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约1,000个0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约2,000个细胞的球体。在一些实施方案中，第0天多能干细胞的培养包括的细胞数目足以在约第7天产生具有约3,方案中，所述细胞暴露于浓度为约1μM至约20μM、约5μM至约15μM或约8μM至约12μM的[0024]在一些实施方案中，所述至少一种SHH信号传导激活剂是SHH蛋白或嘌吗啡胺少一种SHH信号传导激活剂包括选自SHH蛋白和嘌吗啡胺的两种SHH信号传导激活剂。在一些实施方案中，所述至少一种SHH信号传导激活剂是选自SHH蛋白和嘌吗啡胺的两种SHH信露于浓度为约20ng/mL至400ng/mL的SHH。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约[0026]在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约100ng/mL的SHH和浓度为约10μM的细胞暴露于浓度为约10nM至500nM、约20nM至约400nM、约50nM至约200nM或约75nM至约150nM的LDN193189。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10nM至500nM的一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约0.1μM至约5μM的CHI于浓度为约5ng/mL至约80ng/mL的GDNF。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/mL至约60ng/mL的GDNF。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约15ng/mL至约于浓度为约5ng/mL至约80ng/mL的BDNF。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约10ng/mL至约60ng/mL的BDNF。在一些实施方案中，所述细胞暴露于浓度为约15ng/mL至约约3ng/mL的TGFβ3。在一些实施方案中所述细胞暴露于浓度为约0[0035]在所提供的任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一次温育和/或所述第二在一些实施方案中，在第一次温育和第二次温育期间每隔一天更换培养基的至少约50％。×106个细胞/cm2至约0.6×106个细胞/cm2、约0.2×106个细胞/cm2至约0.4×106个细胞/cm2胞/cm2至约2×106个细胞/cm2、约0.8×106个细胞/cm2至约1×106个细胞/cm2或约1.0×106个细受试者疑似患有帕金森病。在一些实施方案中，待治疗的受试者患有帕金森综合征所述多能干细胞经工程改造以(a)去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子中的一种方案中，所述多能干细胞经工程改造以去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子的基因。在一些实施方案中，所述多能干细胞经工程改造以向AAVS1安全港基因座中提供编码态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子的基因并且向AAVS1安全港基因座中提供编码PD_L1、[0047]在一些实施方案中，该治疗组合物的细胞表达EN1和/或CORIN。在一些实施方案组合物中总细胞的至少约30％表达EN1。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约合物中总细胞的至少约50％表达CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约细胞的至少约70％表达CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约75％表达约45％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约50％表达EN1和总细胞的至少约65％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约70％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞的至少约75％表达EN1和神经元祖细胞(DDPC)，其中该组合物的细胞表达EN1并且该组合物中总细胞少于10％表达神经元祖细胞(DDPC)，其中该组合物的细胞表达CORIN并且该组合物中总细胞少于10％表神经元祖细胞(DDPC)，其中该组合物的细胞表达EN1和CORIN并且该组合物中总细胞少于神经元祖细胞(DDPC)，其中该治疗组合物表现出小于约2.5×10_2的每百万计数(CPM)TH与每百万计数(CPM)NEUROG1与CPMGAPDH的比率；(b)大于约5×10_4的CPMEDN3与CPMGAPDH大于约3×10_3的CPMCEP55与CPMGAPDH的比率；(i)大于约2×10_2的CPMKIF20A与CPM×10_1的CPMMAPT与CPMGAPDH的比率；(n)小于约5×10_2的CPMCAMK2B与CPMGAPDH的比CPMGAPDH的比率；(q)小于约5×10_3的CPM于约2×10_2的CPMSNAP25与CPMG3×10_310_3在一些实施方案中，CPMRET与CPMGAPDH的比率小于约5×10_3。在一些实施方案中，CPM该治疗组合物表现出大于约1×10一4的CPMEN1与CPMGAPDH的比率和大于约2×10一2的CPMCORIN与CPMGAPDH的比率。在一些实施方案中，CPMEN1与CPMGAPDH的比率介于约1.5×数(CPM)TH与CPMGAPDH的比率。在一些实施方案中，CPMTH与CPMGAPDH的比率介于约1x组合物中细胞的至少约40％表达EN1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约细胞的至少约60％表达EN1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达胞的至少约45％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约50％表达胞的至少约65％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约70％表达些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达TH，并且该治疗组合物中细胞的至少约物中细胞的至少约65％表达CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达中，该组合物中总细胞少于10％表达TH，并且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达细胞的至少约55％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约65％表达EN1和组合物中细胞的至少约80％表达EN1和合物中总细胞少于10％表达TH，并且该治疗组合物中细胞的至少约45％表达EN1和CORIN。神经退行性疾病或病状包括在黑质(SN)中的多巴胺能神经元的损失。在一些实施方案中，该神经退行性疾病或病状包括在SN致密部(SNc)中的多巴胺能神经元的损失。在一些实施[0084]在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.25×106个细胞至约20×0.25×106个细胞至约15×106个细胞、约0.25×106个细胞至约10×106个细个细胞至约5×106个细胞、约5×106个×106个细胞至约15×106个细胞或约15×106个细胞至约20×106个细胞。在一些实施方案[0086]在一些实施方案中，以约50,000个细胞/微升至约150,000个细胞/微升的浓度向在一些实施方案中，以约75,000个细胞/微升的浓度向受试者施用细胞。在一些实施方案物的细胞经工程改造以去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子的基因。在一些实施施方案中，该治疗组合物的细胞经工程改造以向AAVS1安全港基因座中提供编码PD_L1、[0092]本文还提供了如本文所述的用于配制用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受[0093]本文还提供了用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者的如本文所述的任些实施方案中，该受试者已损失任选地在黑质(SN)，任选地在SN致密部(SNc)中的至少[0096]图1.示出了用于使多能干细胞分化成定向多巴胺(DA)神经元祖细胞或DA神经元[0098]图3.示出了第10天在有血清替代物或无血清的情况下生长的分化细胞的FOXA2、[0099]图4.示出了用于使多能干细胞分化成定向多巴胺(DA)神经元祖细胞或DA神经元[0100]图5.示出了第25天源自示例性贴壁方法或示例性非贴壁方法的分化细胞的[0101]图6.示出了通过示例性非贴壁方法分化的细胞在第18天和第25天的酪氨酸羟化[0103]图8A.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的FOXA2和[0104]图8B.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的EN1和[0105]图8C.示出了在不同的分化天数通过示例性非贴壁方法分化的细胞中的PAX6和语学旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了方便参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的那些具有实质性差格式的描述仅仅是为了方便和简洁而不应当解释为对所要求保护的主题的范围的僵化限相同条件下用同种型匹配的对照进行同样程序所检测到的染色，和/或其水平基本上类似于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或其水平基本上高于已知对于该标记同条件下用对照进行同样程序所检测到的水平，和/或其水平基本上类似于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或其水平基本上高于已知对于该标记物而言为阴性的相同条件下用同种型匹配的对照进行同样程序所检测到的水平，和/或以基本上低于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或以与已知对于该标记物而言为阴性的细胞它相同条件下用对照进行同样程序所检测到的水平，和/或以基本上低于已知对于该标记物而言为阳性的细胞的水平，和/或以与已知对于该标记物而言为阴性的细胞相比基本上译产物。DNA分子在细胞中的表达水平可以基于细胞内存在的相应mRNA的量或由细胞产生的该DNA编码的蛋白质的量来测定(Sambrook等人，1989，MolecularCloning:A能干细胞可以表达来自以下非限制性列表的标记物中的至少一些，任选地全部：SSEA_3、离体)维持在适于存活的条件下的细胞。允许培养的细胞存活，并且培养可以引起细胞生[0126]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成[0129]本公开涉及多能干细胞(PSC)，诸如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的向多巴胺(DA)神经元祖细胞(DDPC)和/或多巴胺(DA)神经元的方法。使用本文提供的方法[0130]本文提供了使多能干细胞(PSC)诸如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干细胞(iPSC)谱系特异性分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(DA)神经元祖细胞和/或多巴胺(DA)神经元脑多巴胺(mDA)神经元的选择性变性。因为PD症状主要是由于中脑腹侧黑质中DA神经元的适当细胞来源长达数十年，并且已经提出了许多用于DA神经元替代的潜在来源。Kriks,ProtocolsforgeneratingEScell_deriveddopamineneuronsinDevelopmentandengineeringofdopamineneurons(编辑Pasterkamp,R.J.,Smidt和Burbach)Landes[0133]另一种方法是移植胎儿中脑DA神经元，诸如在全世界300多名患者中进行移植。(2010)120:29_40。在这些患者中使用人胎儿组织的疗法证明了在一些患者中移植后长达[0134]干细胞来源的细胞，诸如多能干细胞(PSC)，被考虑为再生医学中应用的细胞来限期地维持并在体外以其多能状态扩增。Romito和Cobellis,StemCellsInt.(2016)年代使用小鼠ES细胞的早期研究证明了在体外从多能细胞(包括神经元)得到特定谱系的未产生含有高百分比中脑DA神经元或能够在体内恢复神经元功能的细胞的细胞群。另外，所得到的群体还含有除了中脑DA神经元之外的细胞类型元通常表现出了较差的体内性能，不能补偿神经元功能的内源性损失。Tabar等人Nature要产生大量标准化细胞，诸如用于自体干细胞移植的新方法。Lindvall和Kokaia,J.Clin.Invest(2010)120:2[0139]目前正在进行一项研究，其中人iPSC分化成DA神经元前体并移植到人的纹状体动作为非贴壁细胞的PSC培养，以生成球体，接着在底物涂覆的板上进一步温育球体的细提供的方法分化并且在第18天或约第18天收获例如，本文所述的非贴壁培养方法所允许的细胞间接触的增加可上调细胞间蛋白质网络，(例如形态发生素)梯度是不希望的，因为球体的不[0146]在一些方面，将本文所述的方法的非贴壁培养组成部分限于约7天也有助于确保[0149]本文的发现还证明，在第18天收获的细胞似乎会表达DA神经元前体的许多标记物，但是它们的遗传表达表明它们可能比在第25天收获的细胞更少定型为DA神经元命运。相比，可表现出植入其它细胞和/或使其它细胞受神经支配的能力提高。在一些实施方案非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在第一次温育开始时使所述细胞神经分化的条件下培养所述球体温育中，iPSC然后分化成中脑底板前体，并在非贴壁培养中从第0天开始通过暴露于小分共同表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类[0162]在一些实施方案中，多能干细胞是从非多能细胞人工获得的诱导多能干细胞通过称为重编程的过程生成，其中通过将非多能细胞工程改造成表达诸如OCT4、SOX2和[0163]生成iPSC的方法是已知的。例如，2006年(Takahashi和Yamanaka)报告了小鼠细胞，可将成纤维细胞重编程为iPSC(例如，参见，Yu等人，ScienceDOI:10.1126/定向DA神经元祖细胞和/或DA神经元之前重编程成为iPSC，诸如通过使用非整合仙台病毒[0165]在提供的任何实施方案中，本文所述的PSC(例如同种异体细胞)可以进行遗传工和HLAII类分子表达并将免疫调节因子PD_L1、HLA_G和CD47引入分化细胞中的AAVS1安全的PSC经工程改造以使高度多态的HLA_A/_B/_C基因缺失并将免疫调节因子，诸如PD_L1、HLA_G和/或CD47引入AAVS1安全港以诱导它们分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(DA)神经元祖细胞和/或多巴胺(DA)神经第一次温育PSC以产生球体，在一些方面中所述分子可以提高产生用于植入的生理相关细细胞暴露于(i)TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(SHH)信号传约0.2×106个细胞/cm2至约0.8×106个细胞/cm2胞/孔至约20×106个多能干细胞/孔、约1×105个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细孔至约5×106个多能干细胞/孔、约1×105个多能干细胞/孔至约1×106个多能干细胞/孔、×106个多能干细胞/孔、约5×105个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔、约5×10×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔或约15×106个多能干细胞/孔至约[0177]在一些实施方案中，在该方法第0天在6孔板中平板接种的PSC的数目为约1×106干细胞/孔至约5×106个多能干细胞/孔、约5×106个多能干细胞/孔至约20×106个多能干细胞/孔、约5×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔、约5×106个多能干细胞/孔至约10×106个多能干细胞/孔、约10×106个多能干细胞/孔至约20×106个多能干细胞/孔、约10×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔或约15×106个多能干细细胞/孔至约5×106个多能干细胞/孔、约5×105个多能干细胞/孔至约1×106个多能干细胞/孔或约1×106个多能干细胞/孔至约5×106个多能[0179]在一些天中，在该方法第0天平板接第0天平板接种的PSC的数目是足以产生含有约1,000至约5,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些天中，在该方法第0天平板接种的PSC的数的PSC的数目是足以产生含有约3,000个细胞的细胞球体的细胞数目。在一些实施方案中，[0183]在一些实施方案中，在细胞传代时的一天或多天，培养基补充Rho相关蛋白激酶约12μM的ROCK抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μM至约20μM的ROCK抑制Nodal信号传导抑制剂。于浓度为约10μM的TGF_β/激活素N案中，TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂能够降低或阻断转化生长因子β(TGFβ)/激活素ALK7或它们的组合。在一些实施方案中，TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂抑制ALK4、中，TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂是SB431542(例如，CASC22H18N4O3且名称为4_[4_(1,3_苯并二氧杂环戊烯_5_基)_5_(2_吡啶基)_1H_咪唑_2_[0198]在一些实施方案中，所述至少一种SHH信号传导激活剂是刺猬因子受体平一些实施方案中，所述至少一种SHH信号传导激活剂是嘌吗啡胺(例如CAS483367_10_8)，Smad1、Smad5和Smad8的SMAD磷酸化。在一些实施方案中，该BMP信号传导抑制剂是M至约4μM或约2μM至约3μM(包括每个端值在内)的GSK3β信号传导抑制剂。在一些实施方案导抑制剂。些实施方案中，第一次温育包括从约第0天到约第6天在基础诱导培养基中培养多能干细胞会诱导它们分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(DA)神经元祖细胞和/或多巴胺(DA)神[0225]在一些实施方案中，底物涂覆的培养器皿是具有细胞可以附着的表面的培养器至少一些细胞在约第25天之前或在约第25天时是106个细胞/cm2至约0.8×106个细胞/cm2、约0.1×106个细胞/c约0.1×106个细胞/cm2至约0.4×106个细胞/cm20.8×106个细胞/cm2至约1×106个细胞/cm2或约1.0×106个细胞/cm2至约2×106个细胞/cm2[0235]在一些实施方案中，在细胞传代时的一天或多天，培养基补充Rho相关蛋白激酶约12μM的ROCK抑制剂。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1μM至约20μM的ROCK抑制些实施方案中，ROCK抑制剂选择性抑制p160ROCK。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y_于浓度为约10μM的Y_27632。在一些实施方案中，细胞在第20天暴露于浓度为约10μM的Y_号传导抑制剂是LDN193189或K02288。在一些实施方案中，该BMP信号传导抑制剂能够抑制M至约4μM或约2μM至约3μM(包括每个端值在内)的GSK3β信号传导抑制剂。在一些实施方案号传导抑制剂。是无翼/整合(Wnt)信号传导激动剂。在一些实施方案中，该GSK3β信号传导抑制剂针对人中，培养基从约第11天开始补充BDNF。在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充[0254]在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约1ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约0.2mM至约1mM(包括每个端值在内)的dbcAMP。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.1mM至约3mM(包括每个端值在内)的dbcAMP。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约0.2mM至约1mM(包括每个端值在内)的dbcAMP。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约5ng/mL或约1.0ng/mL至约2.0ng/mL的TGFβ3。在一些实施方案中，细胞暴露于浓度为约第18天补充Notch信号传导抑制剂。在一些实施方案中，培养基从约第11天到第25天补充Notch信号传导抑制剂。[0269]在一些实施方案中，培养基从约第11天开始补充约10μMDAPT。在一些实施方案[0270]在一些实施方案中，从约第11天开始，培养基补充约20ng/mLBDNF、约20ng/mL[0274]在一些实施方案中，第二次温育包括从约第7天到约第10天在基础诱导培养基中细胞以产生定向多巴胺(DA)神经元祖细胞或[0286]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成法是已知的。示例性的方法在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)和阿扑吗啡[0292]在一些实施方案中，配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有暴露于(i)TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(SHH)信号传导激[0302]在一些实施方案中，在诱导细胞神经分化的条件下培养细胞包括将细胞暴露于露于(i)TGF_β/激活素Nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(SHH)信号传导激活细胞神经分化的条件下培养细胞包括将细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(BDNF)；(ii)细胞从第0天到约第7天(例如，第6天或第7天)，暴露于所述至少一种SHH信号传导激活剂 中，细胞从第0天到约第13天(例如，第1胞源性神经营养因子(GDNF)。在一些实施方案中，细胞从第11天开始暴露于二丁酰环AMP11天到第18天暴露于BAGCT/DAPT。在一些实施方案中，细胞从第11天到第25天暴露于率)的基础诱导培养基中培养，该基础诱导培养基补充有N2、B27、非必需氨基酸(NEAA)、[0310]在一些实施方案中，培养基补充有如上所述的小分子，包括SB、SHH/PUR、LDN、用或施用于受试者，例如患有神经退行性疾病或病状(诸如帕金森病)的人类患者之前解文所述的任何方法生成的细胞的组合物施用于帕金森组合物中细胞的至少约65％表达EN1。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约[0322]在一些实施方案中，定向多巴胺(DA)神经元祖细胞表达CORIN。在一些实施方案或至少约80％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达胞的至少约35％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约40％表达胞的至少约55％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约60％表达胞的至少约75％表达CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约80％表达75％或至少约80％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约20％表达EN1和CORIN。在一些实施方案中，该治疗组合物中细胞的至少约25％表达EN1和[0325]在一些实施方案中，该治疗组合物表现出(a)大于约1×10_4的每百万计数(CPM)GAPDH的比率介于约5×10_2至5细胞表达EN1和CORIN且少于10％的细胞[0328]在一些实施方案中该治疗组合物表现出小于约3×10_2的每百万计数(CPM)TH与些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达TH，并且该治疗组合物中细胞的至少约物中细胞的至少约70％表达CORIN。在一些实施方案中，该组合物中总细胞少于10％表达合物中总细胞少于10％表达TH，并且该治疗组合物中细胞的至少约50％表达EN1和CORIN。且该治疗组合物中细胞的至少约80％表达EN1和大于约8x10_3的PSRC1与CPMGAPDH的比率；(e)大于约2x10_3的NEK6与CPMGAPDH的比率；(f)大于约1x10_2的IQGAP3与CPMGAPDH的比率；(g)大于约8x10_4的USP44与CPMGAPDH的比率；(h)大于约3x10_3的CEP55与CPMGAPDH的比率；(i)大于约2x10_2的KIF20A与CPMCPMGAPDH的比率；(l)小于约1x10_3的GLRA2与CPMGAPDH的比率；(m)小于约1x10_1的MAPT与CPMGAPDH的比率；(n)小于约5x10_2的CAMK2B与CPMGAPDH的比率；(o)小于约1x于约5×10_2的NSG2与CPMGAPDH的比率；和(t)小于约2×10_2的SNAP25与CPMGAPDH的比[0334]在一些实施方案中，(a)CPMNEUROG1与CPMGAPDH的比率介于约5×10_5至约5×CPMGAPDH的比率介于约5×10_3至约5×10_2之间；(d)CPMPSRC1与CPMGAPDH的比率介于约1×10_2至约5×10_2之间；(e)CPMNEK6与CPMGAPDH的比率介于约2×10_2至约5×10_1之GAPDH的比率介于约5×10_3至约5×10_2之间；(10_3至约5×10_2之间；(i)CPMKIF20A与CPMGAPDH的比率介于约2.5×10_2至约2×10_1之间；(j)CPMAURKA与CPMGAPDH的比率介于约2.6×1CPMGAPDH的比率介于约1×10_5至约1×10_3之间；(l)CPMGLRA2与CPMGAPDH的比率介于约1×10_6至约1×10_3之间；(m)CPMMAPT与CPMGAPDH的比率介于约5×10_3至约1×10_1之间；(n)CPMCAMK2B与CPMGAPDH的比率介于约1×10_3至约5×10_2之间；(o)CPMSYT13与CPMGAPDH的比率介于约1×10_3至约1×10_2之间；约1×10_4至约1×10_3之间；(q)CPMRET与CPMGAPDH的比率介于约1×10_4至约4×10_3之间；(r)CPMKCND3与CPMGAPDH的比率介于约1×1GAPDH的比率介于约1×10_3至约2.4×10_2之间；和/或(t)CPMSNAP25与CPMGAPDH的比率在特定实施方案中，基因产物编码局限和/或暴露于细胞表面的蛋白质。在一些实施方案蛋白质(即非抗体)阵列)进行检测。在一些实应，例如通过检测抗体或抗原结合抗体片段与基因产物的结合检测蛋白质的方法或测定LIGHTUPTM、SCORPIONTILLUMINA8/SOLEXA⃞、ABISOLiD8和POLONATOR测序等特定平台。在特定实合的靶核酸区域之间的探针——商业上称为TAQMAN8测定法。多种基因产物(例如，多核苷酸基因产物)的表达序平台[HiSeq系统(Illumina)、454基因组测序仪FLX系统(Roche)、AppliedBiosystems的模板。PacBioRS平台上直接RNA测序的原理验证也已得到证明(PacificBioscience)。[0344]在一些实施方案中，从每个样品中获得RNA，将其片段化并用于生成互补DNA[0345]在一些实施方案中，从每个样品中获得RNA，将其片段化并用于生成互补DNA[0346]在一些实施方案中，通过比较靶基因的CPM与管家基因的CPM来测量相对基因表[0349]“药学上可接受的载体”是指药物配制物中除活性成分以外的对受试者无毒的成法是已知的。示例性的方法在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,[0352]该配制物或组合物还可以含有一种以上可用于正在用所述细胞或药剂预防或治[0353]该配制物或组合物还可以与可用于正在用所述细胞或药剂预防或治疗的特定适如神经退行性病症)的症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量注射形式[0362]本文提供了使用所提供的任何组合物治疗有此需要的受试者的疾病或病状的方药物组合物在此类方法和治疗中的用途，以及在制备药物以便实施此类治疗方法中的用[0363]本公开涉及多能干细胞(PSC)，包括胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞(iPSC)的受试者表现出帕金森病相关模式(PDRP)的[18F]_DG_[0370]在一些实施方案中，该细胞剂量包括每半球刚好或半球刚好或约500万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约1000万个细胞至每半球刚好或约1500万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约球刚好或约1000万个细胞、每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约500万个细100万个细胞、每半球刚好或约500,000个细胞至每半球刚好或约100万个细胞或每半球刚好或约250,000个细胞至每半球刚好或约500,0[0371]在一些实施方案中，该细胞剂量为每半球刚好或约100万个细胞至每半球刚好或[0373]在一些实施方案中，向受试者施用的细胞的数目为约0.25×106总细胞至约20×0.25×106总细胞至约15×106总细胞、约0.25×106总细胞至约10×106总细[0374]在某些实施方案中，以每半球约500万个细胞至每半球约2000万个细胞的范围或先前治疗的反应，例如疾病分期和/或受试者发展不良结果(例如运动障碍)的可能性或发应，例如疾病类型和/或分期和/或受试者发展毒性结果(例如运动障碍)的可能性或发生和/或多巴胺(DA)神经元的一种或多种试剂；和(ii)使用所述一种或多种试剂进行本文所[0393]在任何此类实施方案中的一些实施方案中，用于分化的试剂是或包括能够抑制材料和在所述一个或多个容器和/或包装上或随附所述一个或多个容器和/或包装的标签指定方法用于在接受细胞疗法之前评估受试者是否可能或疑似可能在施用表达重组受体[0402](a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)TGF_β/激活素[0403](b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条[0413]11.根据实施方案1_10中任一项所下培养所述细胞包括将所述细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(BDNF)；(ii)抗坏血酸；[0414]12.根据实施方案1_11中任一项所述的方法[0415]13.根据实施方案1_12中任一项所述的方[0417](a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多[0424]15.根据实施方案1_14中任一项所[0426]17.根据实施方案15或实施方案[0430]21.根据实施方案1_20中任一[0431]22.根据实施方案21所述的方法，其[0433]24.根据实施方案23所述的方法，其中所述解离[0435]26.根据实施方案1_25中[0442]33.根据实施方案29_32中任一项所述的方包含约0.1×106个细胞/cm2至约2×106个细胞胞/cm20.4×106个细胞/cm2至约0.8×106个细胞/cm2、约0.4×106个细胞/cm2至约0.6×106个细[0443]34.根据实施方案29_33中任一项所述的在6孔板中进行并且包含约1×106个多能干细胞/孔至约20×106个多能干细胞/孔、约1×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔、约1×106个多能干细胞/孔至约10×[0444]/孔至约15×106个多能干细胞/孔或约15×106个多能干细胞/孔至约20×106个多[0445]35.根据实施方案29_34中任一项所述的方[0446]孔至约5×106个多能干细胞/孔、约1×105个多能干细胞/孔至约1×106个多能干约1×106个多能干细胞/孔至约5×106[0447]36.根据实施方案29_35中任一项所述的方包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约1,000个细胞至约5,000个细胞或约2,000个细[0448]37.根据实施方案29_36中任一项所述的[0449]38.根据实施方案29_36中任一项所述的方法[0450]39.根据实施方案1_38中任一项所述的方[0451]40.根据39所述的方法，其中所述处[0454]43.根据实施方案1_42中任一项所述的[0455]44.根据实施方案1_43中任一项所述[0457]46.根据实施方案1_45中任一[0467]54.根据实施方案52或实施方案53所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约[0468]55.根据实施方案52_5[0469]56.根据实施方案1_55中任一项所述的方法，其中所述BMP信号传导抑制剂为[0471]58.根据实施方案1_57中任一项所述的方法，其中所述GSK3β信号传导抑制剂为mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL或约15ng/mL至约30ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL或约15ng/mL至约30ng/[0479]63.根据实施方案11_62中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约[0480]64.根据实施方案11_63中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约[0481]65.根据实施方案11_64中任一项所述的方法[0482]66.根据实施方案11_6[0484]68.根据实施方案1_67中任一项所述的温育中的所述培养在包含血清或血清替代物的[0492]76.根据实施方案1_66中任一项所天和/或第20天暴露于Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号传天和第20天暴露于Rho相关激酶蛋白(ROCK)信号传[0496]80.根据实施方案77_7[0497]81.根据实施方案1_80中任一项所[0498]82.根据实施方案23_81中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解[0499]83.根据实施方案23_82中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解[0500]84.根据实施方案23_83中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解[0501]85.根据实施方案1_84中任一项所述×106个细胞/cm2至约1×106个细胞/cm2、约0.2×106个细胞/c×106个细胞/cm2或约1.0×106个细胞/cm2至约2×[0503]86.根据实施方案1_85中任一项所述的培养器皿中转移约0.4×106个细胞/cm2[0507]90.根据实施方案88或实施方案89所述[0510]93.根据实施方案1_92中任一项所述的[0511]94.根据实施方案1_91中任一项所述的[0512]95.根据实施方案1_91和94中任一项[0513]96.根据实施方案1_95中任一项[0514]97.根据实施方案1_95中任一[0515]98.根据实施方案1_97中任一项所述[0519]101.根据实施方案100所述的治疗组合物，其中所述组合物的细胞表达EN1和包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(DDPC)，其中所述组合物中的细胞表达祖细胞(DDPC)，其中所述治疗组合物表现出小于约2.5×10_2的每百万计数(CPM)TH与CPM[0571]109.根据实施方案100_108中任一或[0579]112.根据实施方案100_111中任一[0580]113.根据实施方案100_112中任[0581]115.根据实施方案100_114中任[0582]116.根据实施方案100_115中任一项[0583]117.根据实施方案100_116中任一[0584][0584]118.根据实施方案1001[0585]119.根据实施方案100_118中任一项或约2500万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约1.5亿总细[0586]120.根据实施方案100_119中任一[0587]121.根据实施方案100_120中[0588]122.根据实施方案100_121中任一项[0589]123.根据实施方案100_122中任一[0590]124.根据实施方案100_123中任一项所[0591]125.根据实施方案100_124中任一[0592]126.根据实施方案125所[0593]127.根据实施方案100_126中任一[0594]128.根据实施方案100_127中任一项所述的治[0595]129.根据实施方案128所述的治疗组合[0596]130.根据实施方案128所述的治疗组[0598]132.根据实施方案131所述的方法，其中向所述受试者施用的细胞的数目为约约20×106个细胞、约10×106个细胞至约15×106个细胞或约15×106个细胞至约20×106个[0600]134.根据实施方案131_133中任一项所述的[0601]135.根据实施方案131_134中任[0602]136.根据131_135中任一项所述的方[0603]137.根据实施方案131_135中任一项所述[0604]138.根据实施方案131_137中任一项所[0605]139.根据实施方案131_138中任一项[0607]141.根据实施方案131_140中任一[0608]142.根据实施方案131_141中任一项所述[0609]143.根据实施方案131_142中任一项所[0610]144.根据实施方案143所述的方法，以(a)去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码PD_L1、HLA_G和CD47中的一种或多种的基因，任选地提供到AAVS1安全港基因座中。145.根据实施方案100_130中任一项所述的组合物用于配制用于治疗患有神经退行性疾病[0611]146.根据实施方案100_115中任一项[0613]148.根据实施方案145_147中任一项所述的[0614]149.根据实施方案145_148中任一项所述[0615]150.根据实施方案145_148中任一项所[0616]151.根据实施方案145_150中任一[0617]152.根据实施方案145_150中任一项所述[0618]153.根据实施方案145_152中任一项所[0619]154.根据实施方案153所述的用途物的所述细胞经工程改造以(a)去除编码多态性HLA_A/_B/_C和HLAII类分子中的一种或[0624]通过在GeltrexTM涂覆的6孔板中以200,000个细胞/cm2平板接种来维持来自人类[0626]将收集的iPSC重悬于“基础诱导培养基”中(参见下文)，并使用6孔或24孔以单层的形式以600,000个细胞/cm2的浓度平板接种在底物涂覆的6孔板(GeltrexTM)上进[0627]图1和表E1中示出了示例性非贴壁分化方案的示意图，该示意图描绘了在分化方养，该基础诱导培养基配制成含有1:1比率的NeurobasalTM培养基和DMEM/F12培养基(且具补充物、非必需氨基酸(NEAA)和GlutaMAPUR：嘌吗啡胺；CHIR：CHI99021；ROCKi：Y_27632；BDNF：重组人脑源性神经营养因子MSB、0.1μg/mLSHH、2μMPUR、2μM的GSK3βδ抑制剂CHIR99021和10μM的ROCK抑制剂Y_ROCK抑制剂外。从第2天到第6天，每天提供与第1天相同浓度的小分子化合物，但是交换[0634]从第11天开始，将培养基换成成熟培养基，该成熟培养配制成含有：20ng/mL后)用成熟培养基更换培养基，该成熟培养基配制成含有与第11天和第12天相同浓度的和酪氨酸羟化酶(TH)，或者通过酶促解离收获分化细胞并冷冻供下游使用或分析。通过[0638]为了比较存在血清替代物和不存在任何血清的情况下进行的分化，使细胞从第0清替代物的情况下生长的细胞表现出降低的活力和较低的TH+频率，如通过染色所确定的的条件通过添加成纤维细胞生长因子8(FGF8)和不同浓度的CHIR得以修改。培养基配制物[0642]比较由上述示例性非贴壁方法生成的细胞与通过不同方法生成的细胞之间的神经元分化标记物的表达水平，其中最初在第0天将细胞平板接种在GeltrexTM涂覆的6孔板[0643]在分化的第25天收获来自贴壁方法和非贴壁方法的细胞，并评估FOXA2+TH+神经[0645]比较通过以上在实施例1中描述的非贴壁方法生成的细胞之间的酪氨酸羟化酶的特定时间点的样品的归一化计数的平均值或中值从来自该时间点的每个样品的归一化计[0649]通过实施例1中描述的非贴壁分化方案使细胞分化，并在分化的不同天数收集细多巴胺能神经元命运)的观察结果一致。第18天和第25天细胞之间的差异与第18天细胞分分化方法的第18天收获的细胞与第25天收获的细胞之间的差异性基因表达。使用<0.错误发现率(FDR)和>0的对数2一倍数变化来鉴定和生成与第18天相比在第25天上调(“上[0652]将差异性表达基因的上调列表与公开可用的神经突生长相关基因列表(可在天相比在第25天上调的基因。当鉴定的差异性表达的神经突生长相关基因按显著性排序108个基因被鉴定为在第18天至第25天之间差异性表达的有丝分裂相关基因，尤其是与第18天相比在第25天下调的基因。当鉴定的差异性表达的有丝分裂相关基因按显著性排序[0654]通过相对于GAPDH表达测量来自第18天和第25天的每一天的六个不同分化样品中复相同分析。对于前10个上调和下调的差异性表达基因(按显著性排序)，以及对于EN1、[0655]第18天至第25天之间最显著的差异性表达基因中的一者或多者可以作为遗传表我更新状态向更加定向的细胞类型转变，而神经突生长相关基因从第18天至第25天增加，[0663](a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(SHH)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白[0664](b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条[0675]11.根据项目1_10中任一项所述[0680](a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多[0685]17.根据项目15或项目16所述的方法[0689]21.根据项目1_20中任一项所述[0690]22.根据项目21所述的方法，其中所述[0692]24.根据项目23所述的方法，其中所述解离[0694]26.根据项目1_25中任一项所述的[0701]33.根据项目29_32中任一项所述的约0.1×106个细胞/cm2至约2×106个细胞/cm2、约0.1×106个细胞/cm2至约1×cm2×106个细胞/cm2至约0.8×106个细胞/cm2、约0.4×106个细胞/cm2至约0.6×106个细胞/cm20.8×106个细胞/cm2至约1×106个细胞/cm2或约1.0×106个细胞/cm2至约2胞/孔至约20×106个多能干细胞/孔、约5×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细孔至约20×106个多能干细胞/孔、约10×106个多能干细胞/孔至约15×106个多能干细胞/孔或约15×106个多能干细胞/孔至约20×106个[0703]35.根据项目29_34中任一项所述的方法孔板中进行并且包含约1×105个多能干细胞/孔至约5×106个多能干细胞/孔、约1×105个胞/孔至约1×106个多能干细胞/孔或约1×106个多能干细胞/孔至约5×106个多能干细胞/[0704]36.根据项目29_35中任一项所述的的细胞数目足以在约第7天产生包含约1,000个细胞至约5,000个细胞或约2,000个细胞至[0705]37.根据项目29_36中任一项所述的[0706]38.根据项目29_36中任一项所述的方法[0707]39.根据项目