CN119432989A 对多核苷酸进行测序的方法 （青岛华大智造科技有限责任公司）

201880095214.82018.10.11提供一种用于确定靶单链多核苷酸的序列其中每个掺入的核苷酸通过检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发2(2)将所述核苷酸各自附接至引发不同发光动力学或发光类型的化学发光标记物，其(3)检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发光类型来鉴别每6.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光所述化学发光标记物选自引发不同发光动力学的生物化学发光标记物及其任意组合，或所述化学发光标记物是引发不同发光动力学的两种荧光素7.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光所述化学发光标记物是引发不同发光类型的两种荧光素其中与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物连接的成员是抗地高辛抗体，3或其中与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物其中，所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物，与学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物不同的发光化学发光标记物，第三种核苷酸附接至第一化学发光标记物和第二化学发光标记物两者，13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含4[0002]本发明涉及通过监测用化学发光标记物标记的核苷酸的依次掺入来对多核苷酸[0004]在过去10多年，第二代基因测序技术已经逐步从新兴技术发展为主流的测序手本小型化测序仪的开发逐渐成为了测序领域的发展趋势。作为二代测序技术的经典手段，目前市场上基于单色通道的产品主要包括iontorrent系列的测序仪、454测序仪以及illumina公司最新推出的Iseq[0005]目前基于单通道的测序技术中，iontorrent系列的仪器因多聚物结构测序错误发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发光类型来光反应的发光动力学和随后除去所述化学发光标记物来5反应的发光类型和随后除去所述化学发光标记物核苷酸所附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光序列。6添加每一个核苷酸之后或在添加所有四种核核苷酸所附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光列。[0037]在具体的实施方案中，检测(b)的核苷酸的化学发光标记物包括使所述化学发光7添加每一个核苷酸之后或在添加所有四种核种核苷酸附接至第二荧光素酶，第三种核苷酸附接至第一荧光素酶和第二荧光素酶两者，酸附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物8苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸9底物可以是氢氧化钠和H2O2的混合物等。关于化学发光标记物及其相应底物的详细描述可参见例如LarryJ.Kricka，ChemiluminescentandBioluminescentTechniques，CLIN.CHEM.37/9,1472_1481(1991)和Tsuji,A.等人编辑(2005)Bioluminescenceandchemiluminescence:Progressandperspectives.WorldScientific:[s.l.].ISBN978_981_256_118_3.596pp.。和Tsuji,A.等人编辑(2005)Bioluminescenceandchemiluminescence:Progressandperspectives.WorldScientific:[s.l.].ISBN978_981_256_118_3.596pp.。以下文献(均通过引用并入本文)中的相关描述：Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring物素亲和素(例如链霉亲和素)相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。在另一个实施相互作用将所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物附接可以将核苷酸同时连接至地高辛和生物素，并将第一化学发光标记物连接至抗地高辛抗一化学发光标记物连接至抗地高辛抗体，和将第相互作用将所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记互作用和第二亲和相互作用将化学发光标记物附接可以是本领域已知的任何适合形式的连接。这样的连接可以包括例如直接连接或间接连[0085]本发明涉及通过检测化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学来检测何标记，从而可以通过检测所述化学发光标记物各自的发光动力学来鉴别所述四种核苷动力学的化学发光标记物的组合将引发与该组合中的每个化学发光标记物所引发的发光发与所述第一发光动力学和第二发光动力学不同的发光应的发光类型来检测被所述化学发光标记物发光标记物和第二化学发光标记物双重标记第三核苷酸，以及第四核苷酸不进行任何标所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物的双重标记可以引发与所述第一发光类引发的发光类型介于所述第一发光类型(例如闪光类型)和第二发光类型(例如辉光类型)[0103]本发明的用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记的核苷酸以及用引发不用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记的核苷酸以及用引发不同发光类型的化学[0104]此外核酸测序方法还可以用本文所述的核苷酸进行公开于美国专利号5302509中[0108]可以通过多种方法将所述多核苷酸连接在所述固体支持物上，[0109]进行聚合的必须条件对本领域技术人员来说是熟知的。为了进行所述聚合酶反[0115]本发明的经标记的核苷酸的使用并不局限于DNA测序技术，还可用本发明的核苷核苷酸掺入到正在合成的多核苷酸链上的)在将含有该基团的核苷酸掺入到正在合成的多至多核苷酸链中且同时在不破坏该多核苷酸链的情况下易于从核苷酸的糖部分除去。此硝基和四氢呋喃醚。Metzker等人(NucleicAcidsResearch,22(20):4259_426如WO2014139596的图1A中示例的那些保护基团和权利要求书中限定的那些3’羟基保护基(即保护基团)，和例如WO2004/018497的图3和4中示例的那些保护基团和权利要求书中限[0119]本领域技术人员将会理解如何将合适的保护基团连接在核糖环上，以便阻断与于连续链合成的可用的3'_OH位点。如本文所用的可从经修饰的核苷酸上除去保护基团的基苄醚作为核糖核苷的2'_羟基官能性的保护基团是已知且被证明的(Ohtsuka等，1978)；[0121]可从3'阻断的核苷酸上除去保护基团的其它试剂包括例如膦(例如三(羟甲基)膦去保护基团的其它试剂还包括例如如WO2004/018497的说明书中第114_116页描述的用于除去作为3’OH保护基团的3’烯丙基、3,4_二甲氧基苄氧基甲基或氟甲氧甲基的相应试[0125]在另外的实施方案中，化学发光标记物和/或连接基团可以具有足以发挥阻断其团连接在核苷酸碱基和化学发光标记物上。连接基团可以连接在核苷酸碱基的任何位置胸腺嘧啶和尿嘧啶上的5号位置和胞苷上的N_4位置二甲基硅烷(TBDMS)的基团中的硅氧键。可光解的连接基团在糖化学中被广泛使用。优选的胺，然后所述胺被环化以使分子中其他位置的酯裂解(Burgess等人,J.Org.Chem.62:基的基团的碱催化的消除以及烯丙基系统的钯催化[0133]如本文所用的可从经修饰的核苷酸上除去化学发光标记物的试剂在很大程度上[0143](1)设计如下DNA序列：GATATCTGCAGGCATAGAATGAATATTATTGAATCAATAATTAAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAACTAGTACGTCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTACAACTACGATAATGGGCTGGATACATGGAATGATTATAGATATATTAAGGAATAATGTTAATTAATGCCTA[0144](2)培养适合量的含有已知文库的大肠杆菌，并提取质粒，设计如下一对引物：(ATGCCTGCAGATATCGATATCACAGGCTGA)按照BGIseq_500SE50环化建库试剂盒及流程进行环修饰的引物(RCA)GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG与其中一个孔常温孵育30min，去掉反应液℃与上述生物素修饰的引物进行引物杂交5min后，加入40ulBGISEQ_500测序试剂盒中的4