Rhpn2基因在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能机制

PAGE1PAGERhpn2基因在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能机制Rhpn2基因在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能机制PAGE11摘要斑马鱼以其体型小、发育迅速、胚胎透明、对外界环境反应灵敏、基因组与人类高度同源等特点，在遗传学、环境毒理学、发育生物学、基础水产学等领域得到广泛应用。Rhpn2基因是一种具有间充质特征的新型驱动基因，通过研究发现对于正常的机体，它的Rhpn2蛋白与RhoA特异结合，其结合形成的复合体激活下游细胞信号通路。Rhpn2调控细胞内肌动蛋白的组装过程和细胞骨架的形成，但是Rhpn2在运动神经元中的作用尚不明确。此研究主要通过使用人工养殖斑马鱼杂交后获得胚胎，进行显微注射吗啡啉（Morpholino,MO）使Rhpn2基因在斑马鱼体内的表达下降,之后观察其表型并与正常组对照。结果表明Rhpn2基因敲低的斑马鱼运动神经元发育异于正常斑马鱼。不同点主要是Rhpn2基因敲低的斑马鱼神经元分支增多，轴突发育不良，甚至有部分不发育，并且轴突排列不整齐。因此，我们推断Rhpn2基因参与斑马鱼运动神经元的发育过程的调控。 关键词：Rhpn2，神经系统，斑马鱼，显微观察

ABSTRACT Zebrafishhasbeenwidelyusedingenetics,environmentaltoxicology,developmentalbiology,basicaquacultureandotherfieldsbecauseofitssmallsize,rapiddevelopment,transparentembryo,sensitiveresponsetoexternalenvironment,highhomologyofgenomeandhuman.Rhpn2geneisanewtypeofmesenchymaldrivinggene.Ithasbeenfoundthatrhpn2proteincanbindtoRhoAspecificallythenformacomplex,andthecomplexcanactivatetherelateddownstreamcellsignalpathway.Rhpn2regulateandcontroltheformationofactinandcytoskeleton.However,thefunctionofRhpn2onthedevelopmentofmotorneuronsisunclear.Inthisstudy,theexpressionofrhpn2geneinzebrafishwasknockdownbymicroinjectionofmorpholino(MO).Thenthephenotypeofthesezebrafihweredetectedandcomparedwiththenormalgroup.Theresultsshowedthedifferencebetweenzebrafishwithrhpn2geneknockdowndevelopedandnormalzebrafish.Thosedifferencesmainlydistributeinincreasingnumbersofbranchesandshorteraxonsofneurons.Meanwhiletheaxonsdevelopedslowlyandarrangedirregularly.Thus,wededucedthatrhpn2geneiscriticalinthedevelopmentofzebrafishmotorneurons.Keywords:rhpn2,nervoussystem,zebrafish,microscopicobservation目录摘要 IABSTRACT II1前言 11.1神经系统和运动神经元 11.2Rhpn2基因的概述 21.3斑马鱼的概述 21.4本研究的意义和目的 32实验材料和方法 42.1实验动物 42.2主要试剂 42.3主要仪器 42.4斑马鱼饲养和杂交 42.5培养基母液（6×）E3的配置 52.6使用已设计的特异性的Morpholions序列 52.7注射针头和注射槽的制备 52.8斑马鱼胚胎的收集 52.9显微注射 62.10荧光共聚焦显微成像技术和实时连续成像技术 62.11数据的统计和分析 63结果 73.1Rhpn2基因敲降前后表型比较 74讨论 9参考文献 10致谢 111前言如今，伴随着迅速的医药学、分子生物学的发展，对于人类和动物共有的基因，通过模式动物基因研究来类比人类的基因，此项技术发展日渐成熟，对于研究的基因种类也逐渐增多。本文就是通过研究模式动物斑马鱼中与人类高度同源的Rhpn2基因对斑马鱼运动神经元发育的作用来对比该基因对人体内运动神经元的作用，这项研究对人类的医药学和神经再生学的发展有着重要的作用。比如现在已探究出Rhpn2对细胞内肌动蛋白和细胞骨架的形成有着至关重要的调控作用[1]，确定其具有增加不同神经胶质瘤细胞模型中肿瘤细胞的迁移和侵袭[2]。1.1神经系统和运动神经元神经系统是由神经组织形成，可以分为两种，一种是中枢神经系统（CNS）而另一种是周围神经系统（PNS），神经系统在身体、生理活动等方面起着十分关键的调节作用。CNS主要是由脑和脊髓形成，是人体神经系统的主要构成部分；而PNS是由脑神经和脊神经组成。作为一种高度分化的细胞—神经元，它是神经系统的结构功能单位，在神经系统中存在着非常多的神经元，这些神经元能够感觉刺激并且传导兴奋的信号，在人类的中枢神经系统中存在约1000亿个神经元，并且仅仅大脑皮层中就存在140亿以上，在大脑里的这些神经系统通过配合能使人完成各种复杂的活动，比如言语、学习、行走、运动等[3]。大脑的功能实现主要通过神经元的数量及其复杂的连接，在神经系统中，神经元是主要的结构功能单位。神经系统中主要存在神经元和神经胶质细胞，这些神经胶质细胞有不同的形态，而神经元在结构上可以分为突起和胞体两大部分，突起又因为轴突的不同分成了树突和轴突，关于树突，顾名思义多呈树状分支，它的作用是接受传递的信号并将这种信号传给胞体；而轴突比较长，像细索一样，它的末端常存在分支，这种分支被称轴突终末（Axon

Terminal），轴突将树突传递的信号再从胞体传递给终末[3]。一个神经元轴突只有一条但树突可以有多条，对于神经元来说胞体越大，它的轴突也就越长。神经元还可以通过作用分为三种类型：包括有输入神经、传出神经以及连体神经[4]。而且各神经元之间能够相互传递它们之间的信息并且通过不同区域的神经元之间的协同合作、相互作用来对这些信息进行整理。神经元中的运动神经元又称为外导神经元，外导神经元主要发挥将脊髓和大脑中获得的信息传递给肌肉以及内分泌腺，从而支配效应器官中神经元的活动。一般成年动物中任一肌梭外横纹肌纤维只受一个运动神经元支配,所以运动神经元是运动功能的统一体，是运动的量子单位[5]。关于神经元最重要的一点也是科学界的一个共识是从神经元发出的动作电位中携带有大量的信息[6]。神经元之间又可以处理它们之间的信息传递，主要通过不同大脑区域的神经元相互合作、相互作用来驱使大脑对信息进行整理并传递[7]。运动神经元拥有非常多的功能，它的主要功能是处理传递的信息和管理着各种辅助器官。1.2Rhpn2基因的概述hophilin-2或Rhpn2是一种蛋白，其表达由甲状腺细胞中的环腺苷酸途径诱导，包含多个蛋白-蛋白相互作用域，包括HR-1、Bro1和PDZ域，并且是RhoB以GTP结合形式的伙伴[8]。研究者第一次是在老鼠体内发现了一种能够与Rho蛋白GTP酶分子结合的蛋白，称其为Rhpn1,后来，有研究者又在人体内发现了另一种与它高度同源，相似结构的Rho结合蛋白，称它为Rhpn2[9]。作为Rho蛋白GTP酶分子的结合蛋白,Rhpn2含有685个氨基酸和3个不同的功能结构域：（1）N端Rho结合区域，该区域的主要功能是和Rho蛋白GTP酶分子结合；（2）中间区域Bro1，该区域的功能目前仍未研究透彻；（3）C端PDZ区域，该区域的功能目前也仍然未了解清楚，目前的研究暂时只发现了Rho结合区域可以和Rho蛋白GTP酶分子结合，和发现Bro1和PDZ区域是Rhpn2发挥生物学功能必不可少的部分[10]。但研究者通过不断的对其鉴定发现Rhpn2是一种具有间充质特征的新型驱动基因，通过研究发现在正常的机体中Rhpn2所表达蛋白能够与RhoA特异结合，其结合形成的复合体激活下游细胞信号通路，并且Rhpn2调控细胞内肌动蛋白的组装过程和细胞骨架的形成，并有研究表明Rhpn2基因高表达是降低卵巢癌总生存的不良预后因素之一，在该项实验中Rhpn2高表达者比Rhpn2高表达者比Rhpn2低表达或表达阴性者生存期和无瘤生存期均明显延长，提示Rhpn2基因表达水平的高低可预测卵巢癌患者的预后[1]。另有研究表明Rhpn2可以增强肺腺癌细胞的增殖能力、和侵袭其他细胞的能力，同时Rhpn2又可以使非肿瘤细胞出现恶性转化，增强恶性生物学行为[9]。Rhpn2的表达除了与细胞的F-肌动蛋白、应力纤维以及细胞骨架有关系，还与其他细胞因子信号通路有关，而这些信号通路的激活与抑制和细胞的增值、生长以及其他生理功能有着密切关系，其中与Rhpn2关系最密切的是Hippo通路，Hippo通路是一条保守的抑制肿瘤的经典信号通路[11]，另有研究发现在某些发育阶段的中枢神经组织和神经内分泌组织中Rhpn2有较高的表达，所以近年来，对于Rhpn2的功能研究主要集中在神经系统以及神经内分泌系统的发育过程中。而本文主要通过斑马鱼这种模式动物来探究Rhpn2在运动神经元发育过程中的作用。1.3斑马鱼的概述斑马鱼（Daniorerio）以从头部直达尾鳍的纵向蓝色条纹而得名，属硬骨鱼类，东印度及孟加拉国的淡水水域为其主要产地，是杂食性的热带淡水鱼类[12]。成鱼多数体长3-5cm，体为纺锤形，寿命通常为2-3年。斑马鱼的适宜生长温度约为20℃到30⁰C。观察胚胎发育的标准养殖温度约为29⁰C。斑马鱼的性成熟期为3个月左右，全年都可以交配产卵，两次产卵间隔仅一周。斑马鱼被引入生物学研究领域的历史并不长，可以称为最年轻的模式动物，但是以斑马鱼为工具的各类研究发展非常迅速，现在已经成为最主要的研究模式动物之一。生物体在发育的基本模式方面通常具有非常大的同一性，但生物复杂性不同，所以利用较低级的物种来研究生物体发育的共同规律是一种简单而有效的研究方式，这些低等生物便被称为模式生物[13]。近年来，斑马鱼这一新兴的模式生物作为脊椎动物模型被广泛应用于遗传学[14]、发育生物学[15]、神经生物学[16]等学科领域。目前，在国际上，斑马鱼作为模式生物正逐步扩展并深入应用于生物体的很多种系统(如心血管系统、神经系统[11]等)的发育及相关疾病的研究中。而我国在对斑马鱼的研究方面，无论在关注度上还是规模上都远逊于国际形势发展的需要。因此，发展和促进斑马鱼在我国科研领域中的广泛应用是非常必要而且重要的。而斑马鱼能够吸引诸多研究者的注意，成为科研界的新星，主要由于其诸多科研优势于一身，主要体现在以下三个方面：（1）斑马鱼个体小，易于饲养，成本低，发育迅速、产卵量大故便于研究过程中大规模饲养；（2）斑马鱼的胚胎因其是在体外进行受精，体外进行发育，并且它的胚体非常透明，多种组织器官都具有再生能力、精子还可以进行冷藏等这些优点，所以可以在显微镜下观察斑马鱼完整的胚胎发育过程，24小时便可形成其主要的器官原基，如眼、心脏、脑室、体节等部位均在体式显微镜下清晰可见，便于进行化合物的胚胎毒性检测[17]；（3）斑马鱼的基因组与人类高度同源，而它们在基因以及蛋白质结构和功能方面与哺乳动物也具有非常大的同源性，因此可以作为一种动物模型很好地用于人类疾病和药物毒理等研究中[18]。1.4本研究的意义和目的本文通过探究Rhpn2在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能从而研究出Rhpn2基因对人体的作用，本课题的研究对于医学和生物学的迅速发展有着重要的意义，特别是医学的发展，对于如今运动神经元病这种未清楚病因的疾病研究有重要的作用，而Rhpn2在人体内有高的表达，通过探究其在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能从而研究Rhpn2在人体运动神经元发育过程中的作用，而通过这些作用功能可以设计不同的药物或者医学方法来治疗和改善相类似的功能缺乏的疾病。所以对Rhpn2在斑马鱼运动神经元发育过程中的功能研究对人类的健康有重要的作用。2实验材料和方法2.1实验动物本次实验使用模式动物斑马鱼，主要通过南通大学获得，对于南通大学的斑马鱼有其完整的养殖系统、包括有适宜的温度、系统水的杀菌工作以及水温的调节等。每日光照时间为上午8:30到晚上10:30。投喂的饵料是孵育的丰年虾，大概每天在上11：00与下午5：00中进行喂食。经过雌雄鱼交配后，将收集的受精卵放于Holtfreter培养液中，28.5℃恒温培养箱中培养，斑马鱼发育一周后开始投喂人工饲料，幼鱼发育到96hpf时开始投放小鱼饲料。2.2主要试剂1）Tricaine麻醉剂2）低熔点的琼脂糖3）培养基母液（E3溶液）4）反义寡核苷酸（MO试剂）2.3主要仪器4)正置及倒置显微镜（Leica公司）5)电子分析天平（SARTORIUS）6)超纯水系统（AIUATECUSA）7)宏观变倍显微镜MVX10（OLYMPUS）8)激光共聚焦显微镜（Leica公司）9)硼硅酸盐玻璃毛细管（美国WPI公司）10)IMAGEPRO图像处理软件11)气压电控式显微注射器（美国WPI公司）12)荧光倒置显微镜（Leica公司）2.4斑马鱼饲养和杂交斑马鱼的养殖需要的水环境是温度28.5℃、硬度6-8以及pH为6.5-7.5，模拟斑马鱼养殖室的13小时光照和11小时黑暗条件，斑马鱼的食性简单，主要喂养丰年虫。一天两次，通常为上午11：00和下午4：30。对于斑马鱼的杂交是使用将要交配的雌雄斑马鱼分开培养一段时间，然后放入杂交缸中并且需要将隔板插入杂交缸中间为使雌雄鱼分离开来过夜。同时要配置新鲜的养殖液，在第二天，将其中的养殖液换成新鲜的，并在灯亮的情况下拿出隔板，隔板去掉后，雌鱼与雄鱼将会互相交配15-20min后便会产生鱼卵。收集受精卵后进行显微注射后放入28.5℃的培养箱中。养殖液要一天更换一次，当幼体达到96h后用幼鱼饵料进行投喂。2.5培养基母液（6×）E3的配置开始先在南通大学的实验室中选取100ml的干净锥形瓶，再在电子天平上分别精确称取15.2mg的Kcl、344mg的Nacl、以及58mg的Cacl2·H2O、98mg的MgSO4·7H2O，并加入到锥形瓶中，最后使用移液枪将60ul的0.01%的甲基蓝溶液加入到锥形瓶中进行混合。并且要把配置好的试剂放入冷藏室保存。2.6使用已设计的特异性的Morpholions序列吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(Morpholino)是由美国GENETOOLS，LLC公司所设计并且合成的。本次实验所用的MO序列如下：AGTAAGTCAAGCACCC每管300nmol，加入300µlddH2O稀释成1mm，都存放于﹣80℃冰箱待用。2.7注射针头和注射槽的制备首先注射针头的制备是需要将内径为1mm的硅酸盐玻璃毛细管装上，然后将左右两侧的夹子夹紧，使它固定住并且需要把硅酸盐玻璃毛细管的中间部位对准加热丝，之后就可以按开始按钮使其启动，如此硅酸盐玻璃毛细管就将会被拉成两个注射所需要的微型注射针头。其次是琼脂糖注射槽的制作，首先要在电子天平上称量出0.5g的琼脂糖，然后加入斑马鱼胚胎培养液中，放到微波炉中进行加热目的是让它能够快速溶解，等琼脂糖完全溶解之后，再加入大约8ml的琼脂糖溶液加入到6cm的塑料培养皿盖中。将注射槽模型轻轻放置于即将凝固的琼脂糖胶面上，然后还需要再加入20ml琼脂糖。等到琼脂糖全部凝固后，应当快速取出注射槽模型，这样便会形成一个琼脂糖平板。最后需要将得到的斑马鱼受精卵整齐的加入到平板中，以方便用来显微注射。另外特别要注意的是仪器在使用前和使用后都必须进行灭菌处理，最后再使用少量的灭菌水，进行低温保存，这样就可以做到重复利用。2.8斑马鱼胚胎的收集当雌雄斑马鱼产卵结束之后，我们需要做的是将斑马鱼的母体捞出，因为雌雄斑马鱼杂交以后，得到的受精卵是没有粘性的，所以当产出受精卵后会四处分散，因此需要在杂交缸的底部铺一层尼龙网板或者铺一些鹅卵石使产出的卵能落在网板上或者底部的小卵石的空隙中。等10h以后，就可以进行观察受精卵是否受精了，颜色为白的是没有受精的，需要用吸管或者针管吸出。2.9显微注射显微注射技术的定义就是在显微镜下，利用显微操作系统，通过控制显微注射针在显微镜视野内移动,然后对其进行早期胚胎操作的一种手段。现在这项技术已经在神经再生研究领域中成为一项非常普遍的操作技术，并且已经成功在鼠类、斑马鱼、牛和猪等动物中。首先将收集到的受精卵取出并用系统水冲洗干净，将其冲洗到干净的培养皿中，然后准备适量的E3幼鱼培养液备用。第一步是将硅酸盐玻璃毛细管是使用拉针仪拉制制作硼硅酸盐玻璃毛细针然后再将硼硅酸玻璃毛细针的前端处用手术刀切开一个45°的断口。第二步需要将1mm的反义寡核苷酸稀释成0.3mm的浓度，并且还要在65℃环境下快速溶解10min。第三步是琼脂糖平板中用挑针挑入得到的斑马鱼胚胎，并且琼脂糖平板的每一个凹槽内放入一个胚胎，这样E3溶液就能将所有胚胎覆盖。第四步需要得到适当的长度硼硅酸盐玻璃毛细针并加入2ul溶解完全溶液。将毛细针固定在显微注射仪上的牢固接口处。这样不仅能精准的注射设计好的反义寡核苷酸，还能够在注射之前将时间按钮与压力按钮调到适宜位置。当显微注射完成后可以通过显微镜来查看反义寡核苷酸是否已经被注射入胚胎中。最后我们还需要用E3将斑马鱼胚胎冲入培养皿中，将其放到28℃的培养箱培养发育即可。需要注意的是在培养的过程中还需要将死亡的胚胎挑出来。并且等到胚胎培养到24hpf后，需要将E3培养液换成具有PTU的E3溶液，这样可以阻止胚胎中黑色素的生成。同时为了防止受精卵被细菌侵入还需要在培养液中加入3-4滴的亚甲基蓝。当胚胎24hpf后，就可以进行胚胎剥膜了，当剥膜之后才能够通过显微镜观察它的表型现状。2.10荧光共聚焦显微成像技术和实时连续成像技术将Rhpn2基因下调组的斑马鱼胚胎和正常组的斑马鱼胚胎使用麻醉剂进行麻醉，然后加入到低熔点的琼脂糖上包埋，在这里我们使用的是LeicaTCS-SP5LSM共聚焦显微镜和IMAGEPRO图像处理软件。2.11数据的统计和分析开始，通过在荧光倒置显微镜和荧光共聚焦显微镜的观察下得到两组表型清楚的斑马鱼之后再使用IMAGEPRO图像处理软件对其进行拍照并且保存，最后通过两组表型分析神经元发育状况。3结果3.1Rhpn2基因敲降前后表型比较本次实验主要通过利用模式动物斑马鱼体内Rhpn2基因与人类同源度高的条件，然后探究Rhpn2基因在斑马鱼的运动神经元的发育过程中发挥着怎样的作用同时来类比其在人体内的作用。首先我们是先在杂交箱放入将要交配的雌雄斑马鱼并使它们产卵，之后需要将得到的受精卵加入到琼脂糖平板中，为得到我们需要的斑马鱼Rhpn2下降的胚胎，要对其进行显微注射已设计好的反义寡核苷酸，并且为方便我们得到准确的结果还需要另外添加一组在相同条件下的Rhpn2基因正常的对照组。然后同时将下调组和正常组斑马鱼胚胎放入培养箱中进行培养并且对于其中的培养液要定期更换还要把死亡胚胎挑出，等到下调组和对照组发育到24hpf和48hpf时把它们放到荧光显微镜下观察，比较下调组的斑马鱼与对照组斑马鱼的运动神经元的表型特征，然后通过图像处理软件进行拍照并保存分析。通过图片结果分析我们观察到在24hpf时，如图1所示，对于下调组斑马鱼，即Rhpn2基因被抑制表达的斑马鱼，它的运动神经元的轴突大部分还没有生长，只能依稀观察到存在个别异常短小的轴突，但是Rhpn2基因正常表达的对照组斑马鱼的运动神经元轴突发育速度正常且整齐还没有不发育的情况。所以很明显Rhpn2基因影响斑马鱼的轴突发育速度，或者使其不能发育。图124hpf时，下调组斑马鱼和正常组运动神经元发育状况在48hpf时，如图2所示，Rhpn2基因表达抑制的斑马鱼轴突依然短小甚至有些地方没有出现，并且轴突的排列都比较不规则，相比之下Rhpn2基因表达正常的斑马鱼的轴突发育就很好，轴突长且排列整齐，最关键的一点是轴突主干背部已经发育的相当粗壮了。图248hpf时，Rhpn2下调组和正常组斑马鱼运动神经元发育状况4讨论神经系统在生物体的生理调节过程中起着关键作用，而神经元作为其构成单位，在经过分化后在机体的不同部位承担着不同的作用和功能。不同种类的神经胶质细胞和神经元共同形成一个了异常复杂的回路来使神经系统正常工作。选择斑马鱼作为模式动物的原因有很多，主要是因为斑马鱼的受精卵是体外发育并且身体透明，所以可以在显微镜下更加方便进行观察到斑马鱼活体内神经系统中运动神经元的发育过程。本次实验采取了显微注射的方法。通过敲低Rhpn2基因观测斑马鱼运动神经元的变化来验证Rhpn2基因参与斑马鱼的运动神经元发育的过程的调控，并且其调控过程对斑马鱼运动神经元的发育至关重要。本次实验首先将MO试剂通过显微注射到达斑马鱼胚胎细胞中敲低Rhpn2基因，敲低的Rhpn2基因表达的Rhpn2蛋白含量在斑马鱼胚胎细胞中显著下降。之后将其与Hb9对照组斑马鱼置于相同的条件培养。最后观察Rhpn2基因敲低组与对照组的运动神经元的不同。在荧光显微镜下观察可得Rhpn2基因表达受到抑制后的斑马鱼的运动神经元发生以下变化：1、其轴突与对照组斑马鱼的轴突不同之处主要体现在大小、整齐度方面，此外轴突数量和轴突发育速度也有明显差异。在大小方面Rhpn2基因敲低组斑马鱼运动神经元轴突明显小于对照组，甚至出现无轴突形态的运动神经元细胞。2、在整齐度方面Rhpn2基因敲低组运动神经元轴突杂乱，轴突明显比较短甚至没有，比较杂乱无序。表明其运动神经元是无法正常发育。3、在发育速度方面：相比于对照组Rhpn2基因敲低组轴突的发育速度缓慢。对比观察处于24hpf和48hpf时间段的Rhpn2基因敲低组和对照组可清晰发现Rhpn2基因的表达下降势必会对斑马鱼运动神经元的发育大小、轴突的发育速度、整齐度、形状、和数量产生异常严重的影响。

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