SEM表征和降解率的测定

II1绪论1.1木质素简介绿色植物占地球陆地总生物量的95%，木质纤维素作为所有陆生植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的生物质资源，其组分主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中木质素对于植物生长和生存起着重要作用，是细胞壁强度的支持成分，保护植物细胞免受微生物攻击和各种氧化作用[1]。木质素是一种芳香杂聚物，主要由香豆醇（H,lignin）、芥子醇（S,lignin）、松柏醇（G,lignin）三种单体构成，其单体分子结构图如图1-1所示。从植物学观点出发，木质素是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的，并使这些细胞具有特定显色反应的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中，在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则较为少见。图1-1木质素结构图1.2木质素降解的研究背景能源是支撑人类社会科技发展的核心动力，能源问题一直是人类社会的重大问题之一。近几年可持续发展技术已成为社会日益关注的焦点，充分利用自然资源实现其经济最大化和环境可持续发展已成为经济发展必须考虑的问题。木质素作为自然界中含量丰富的三大生物质之一，全球的木质素年产量可达1500亿t，但是，大量的木质素被作为造纸行业的副产物被排放，不仅浪费资源，而且污染环境。因此木质素作为一种可再生资源，研究其降解和合成各种高附加值生化产物的途径，对环境、能源等社会问题有着重要的意义。从化学结构来看，天然木质素是通过多种键合方式将其基本结构单元一苯基丙烷类化合物连接而成的一种水不溶性、无规则、高度分支的高分子聚合物，其复杂的化学结构和特殊的理化性质使其成为自然界所有天然产物中最难转化的物质之一[2]。木质素是由对羟苯基、愈创木基和紫丁香基三者所组成的异聚物，这三种单体通过β-O-4、β-5、β-β、5-5、4-O-5和β-1共价键连接形成了自然界中各种各样的木质素。这些无规律的异聚物不透水，也没有旋光性，所有这些特性使木质素的降解非常困难[3]；近年来，对于木质素的降解技术已经进行了广泛的研究，主要分为非生物降解（物理方法、化学方法、物理-化学联用方法）和生物降解方法。研究者期望利用这些方法能够打断或破坏木质素网络结构，使生物质中的纤维素、半纤维素和木质素能够得到充分利用[4]。非生物预处理方法虽然有许多优点，但是总体而言存在氧化剂及催化剂价格高、用量大，较难回收等问题[5]。生物降解方法主要利用真菌分泌的多种木质素降解酶降解生物质中的木质素，虽然生物降解方法对菌种的培养条件较高，且降解过程较慢，但是生物降解方法可以把木质素彻底降解为二氧化碳和水，具有无污染、选择性好等优点，能用于治理污染和环境保护。1.3生物法降解木质素现阶段，普遍认为分解木质素的菌类有白腐菌，褐腐菌和软腐菌。其中白腐菌有较强的降解木质素的能力，能分泌胞外氧化酶独立降解木质素[6,7]，褐腐真菌和软腐真菌也能分泌一些降解木质素的酶类，但它们分解木质素的能力不是很强，研究报道较少[8,9,10]。因此白腐菌被认为是最主要的木质素降解微生物。目前研究比较多的白腐菌有:黄孢原毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、彩绒草盖菌(Coridusversicolor)、变色栓菌(Thametesversicolor)、射脉菌(Phlebiaradiata)、凤尾菇(Pleurotuspulmononanus)、朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)[6,7,11]等。在木质素降解微生物中，研究得最多最彻底和最具应用前景的是黄孢原毛平革菌。这种微生物的特点是无性繁殖迅速，菌丝生长快且分泌木质素降解酶能力强，它已经成为研究白腐真菌的一种模式微生物它的培养条件、代谢调控、分子生物学和遗传学及其在生产实践上的应用等均已被深入研究[11,12,13,14]。木质素生物降解的突破始于20世纪80年代初Kirk和Gold领导的两个小组，他们分别从黄孢原毛平革菌中发现了木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，加上后来发现的漆酶，共同构成了白腐菌种的木质素降解酶[15]。木质素降解酶系是一个非常复杂的体系，目前认为最重要的木质素降解酶有三种：木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。除此之外，还有芳醇氧化酶（Aryl-alcoholoxidaseAAO）、乙二醇氧化酶（GyoxaloxidaseGLOX）、葡萄糖氧化酶（Gucosel-oxidase）、酚氧化酶和过氧化氢酶等也能在一定程度上降解木质素[16]。漆酶是一种多酚氧化酶，1883年漆酶在漆树的分泌物中被首次发现发现，一百多年来，人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于多种植物、菌类的分泌物中甚至存在于昆虫体内。由于漆酶是一种氧化还原酶，其主要作用是催化氧化还原作用。植物中的漆酶主要作用是催化木质素的聚合过程，使木质素沉积。而真菌产生的漆酶会使木质素降解[17]。也就是说，不同来源的漆酶氧化降解木质素的能力差距很大，漆酶的结构决定了漆酶的特性。锰过氧化物酶是带有糖基的胞外过氧化物酶,因含有血红素,又称血红素过氧化物酶[18]。锰过氧化物酶是一种依赖锰离子的含血红素的过氧化物酶，经检测在已知的所有的木质素降解真菌的胞外液中都有MnP，可以从多种白腐菌中分离纯化得到锰过氧化物酶，其中对黄孢原毛平革菌的研究最多。由于一些可降解木质素的菌类不分泌木质素过氧化物酶，且黄孢原毛平革菌的LiP缺陷株以可以降解木质素，因此锰过氧化物酶在木质素的降解中起着非常重要的作用[19]。木质素过氧化物酶是第一个从黄孢原毛平革菌中发现的木质素降解酶。Kent和Ming等于1983年首次在黄孢原毛平革菌的限制性培养基中发现了LiP，他们认为LiP属于氧化还原酶，是真菌分泌的一种含铁血红素的糖基化细胞外蛋白过氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亚铁血红素蛋白质通常以多种复合的形式产生，在H2O2存在时，LiP能氧化分解芳香环多聚体，被认为是木质素降解的关键酶之一[20]。在木质素的降解过程中，漆酶（Lac）、木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)在细胞中被合成后被分泌到细胞外，依靠氧化还原反应降解各种结构各异的木质素组分。虽然整个酶系对底物的氧化是高度非特异性的，但不同酶对不同结构底物的降解能力存在差异。单一一种酶在木质素降解中的降解能力十分有限，如Lac和MnP单独存在时都不能很好的降解木质素，而两种酶同时存在时,木质素却能得到很好降解。而且当体系中一些条件变化时,体系中的两种或几种木质素降解酶还会发生相互抑制的现象[18]。最新研究表明，不同降解酶系成分之间的比例将直接影响木质素降解效果[21]。各种酶系具体如何分工协作降解木质素,尚不清楚,这将是今后研究的一个热点。1.4木质素降解技术的应用目前，将木质素降解成功应用到生产实践的案例尚不多见，但在某些方面的研究已经显现出广阔的前景。首先，目前的造纸工业主要采取硫酸盐或亚硫酸盐法除去原料中的木质素，使纤维素中释放出来，但这种方法污染大、能耗消耗高、原料利用率低。利用木质素的生物降解技术可克服这些弊端。木质素生物降解技术在造纸工业的应用主要有：生物化学制浆、纸浆生物漂白、造纸废水生物处理。生物化学制浆是利用微生物的作用先于化学制浆之前降解造纸原料中的木质素，从而有利于纤维素的分离。在化学试剂用量不变的情况下，采用此技术可降低纸浆的硬度;而在纸浆硬度不变的前提下，采用此技术可降低化学试剂的用量和能耗，且提高纸浆白度[22]。纸浆生物漂白是利用微生物或其分泌的酶处理纸浆，实现脱除木质素、改善纸浆可漂性或提高纸浆白度的目的。造纸废水的高色度和难降解性主要源于制浆、漂白等工艺过程中产生的以木质素为主的化学物质，白腐菌及其分泌的酶系可以有效地降解这些物质，降低其对环境的污染，具有很高的应用价值[23]。其次，在饲料工业方面，农作物秸秆中蕴藏着丰富的能量，是生产牲畜饲料的重要资源。然而，由于其中木质素的存在，导致纤维素的消化受阻。利用木质素降解菌或降解酶的生物处理技术可明显提高动物对秸秆的消化率，具有很高的商业价值。在发酵与食品工业方面，木质纤维素中木质素的优先降解是制约纤维素进一步糖化和转化的关键，已有很多实验尝试使用秸秆进行酒精发酵或有机酸发酵，但效果甚微，在食品工业如啤酒的生产中，可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除，使酒类得到澄清。在生物肥料方面，传统上使用高温堆肥的办法来使秸秆转化为有机肥料。但这种方法劳动强度大，近年来不为农民所欢迎，最近，秸秆转化为有机肥料的最简单、有效的方法是秸秆就地还田，但是，还田秸秆在田间降解迟缓并带来了一系列的耕作问题，而解决这些问题的关键是加速秸秆的腐熟过程。因此，以白腐菌为代表的木质素降解微生物为这种快速腐熟提供了理论上的可能性。在国内，已有几家科研单位在进行相关的研究与探索。最后，在环境保护方面，鉴于木质素降解菌和它们产生的相关酶类对多种有机化合物的降解能力，因此它们也是化工废水处理研究最为活跃的领域之一，这方面已不乏成功的范例。在国外,P.Chrysospium已成功用于修复有机氯农药污染的土壤,漆酶用于染料工业污水的处理[24]。1.5本文的研究方向在之前研究的基础上，本文主要研究复合菌群共生降解木质素发酵工艺的优化，主要探究四种菌种（FS、PC、LB、TV）通过分泌3种木质素降解酶（Lac、MnP、LiP）作用于木质素，进而实现木质素的降解和转化，最后通过表征技术去评价微生物降解木质素能力的大小。2实验材料与方法2实验材料与方法为探讨复合菌群共生降解木质素发酵工艺的优化，本文通过分别培养单一菌种和混合菌种，并在培养过程实时监测木质素降解酶的酶活力的变化，并以酶活为标准筛选出最优组合，进一步探究最优组合对木质素的降解效果。本章主要介绍了实验材料与设备和实验方法。2.1实验材料与设备2.1.1微生物菌株本实验选取的4种白腐真菌均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,

CGMCC)，分别为桦革裥菌（Lenzitesbeyulina）、变色栓菌（Trametesversicolor）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）和腐皮镰孢（Fusariumsolani）。2.1.2微生物培养基4种微生物均采用相同的培养基配方:平板培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）含有马铃薯浸粉3.0g/L、葡萄糖20.0g/L和琼脂14.0g/L，pH5.6。液体培养基（MM）：葡萄糖(20g/L)、蛋白胨(5g/L)、酵母粉(2g/L)、KH2PO4(2g/L)、MgSO4·7H2O（0.5g/L）、CaCl2·2H2O（0.1g/L）、琥珀酸（1.18g/L）、酒石酸铵（1.84g/L）、MnSO4（0.0755g/L）、VB1（10mL/L）、微量元素（70mL/L）和吐温80（0.5mL/L），pH4.5。其中微量元素包括：MgSO4·7H2O（3g/L）、MnSO4·H2O（0.5g/L）、NaCl（1.0g/L）、FeSO4·7H2O（0.1g/L）、CoCl2·6H2O（0.1g/L）、ZnSO4·7H2O（0.1g/L）、CuSO4·5H2O（0.1g/L）、KAl(SO4)2·12H2O（10mg/L）、H3BO3（10mg/L）和NaMO4·2H2O（10mg/L）。上述平板培养基和液体培养基均需要进行高温高压灭菌处理，灭菌条件为115℃，15分钟，待灭菌结束且培养基冷却到室温后方可使用。2.1.3主要试剂酵母浸粉和蛋白胨购于北京奥博星生物技术有限责任公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、琥珀酸、酒石酸铵、MnSO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、KAl(SO4)2·12H2O、H3BO3、NaMO4·2H2O、2.3-二甲氧基苯酚（2.6-DMP）和维生素A（VA）均购于国药集团化学试剂有限公司。2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）购于Sigma公司。2.1.4主要仪器设备本实验用到的仪器如表2-1所示表2-1实验用主要仪器仪器名称生产厂商及型号振荡培养箱上海知楚仪器，ZQZY-7OCS立式压力蒸汽灭菌锅LDZF-75KB-IIIPH计赛多利斯科学仪器（北京），PB-10台式高速冷冻离心机湖南湘仪，H1650W高速离心机湖南赫西仪器装备，HR/T20M冷冻干燥机北京松源华兴，LGJ-10T生物安全柜美国BioXII级A2型生物安全柜电子天平德国SatoriusBSA2202S、223S型控温磁力搅拌机CrystalSilentShakeMagneticStirrer紫外可见分光光度计北京普析，TU1810真空泵西安禾普，SHB-ⅢA马弗炉合肥科晶，KSL-1200X4℃冰箱海尔，SC-412-80℃冰箱海尔，DW-86L388(J)扫描电镜美国MAIA3LMH2.2实验方法2.2.1微生物培养（1）菌种活化：将菌种从保藏状态恢复到室温状态，在无菌状态下，用接种环将斜面培养基中的LB、TV、FS、和PC转移到PDA平板上，并做好标记，之后置于30℃的恒温培养箱中培养，待平板上长出成型的菌落，再次用接种环挑到一个新平板中培养，重复此步骤3次，从而得到生长良好的菌落进行下一步实验。（2）种子液的制备：用接种环将LB、TV、FS、和PC分别转移至PDA平板中，置于30℃恒温培养箱中培养，待平板中布满菌落后在生物安全柜中转移至摇瓶培养，用接种环挑取1环菌丝转移至含有100ml混合培养基的250ml三角摇瓶中，每隔24h测量一次3种木质素降解酶的酶活。每个摇瓶中含有50颗，直径5mm的已灭菌玻璃珠，用于打碎真菌在培养过程中出现的菌丝球。LB、TV和PC连续培养9天左右达到种子液的对数生长期末期，而FS2天左右达到对数成长期。（2）单一菌种培养：在LB、TV、FS、和PC种子液的对数生长期末期，按10%的体积比（种子液：培养体积）接种，之后每隔24h测量一次木质素降解酶的酶活，实验结束后保留培养液。（3）混合菌种共培养：将LB、TV、PC和FS进行排列组合，共得到11种组合方法。在种子液的对数生长期末期，按10%的体积比接种于实验组，每隔24h测量一次木质素降解酶的酶活，实验结束后保留培养液。选取酶活数值最大的实验组进行下一步木质素降解实验。（4）木质素降解实验：将上步实验中筛选出来的组合再次培养，并添加木质素（1g/L），探究混合共培养微生物对木质素的降解。在种子液的对数生长期末期，按10%的体积比接种于样品组，之后每隔24h测量一次木质素降解酶的酶活，并在实验结束后进行扫描电镜（scanningelectronmicroscope,SEM）和木质素降解率（degradationrate,DR）的测定。2.2.2酶活的测定由于木质素降解酶在细胞内分泌后会转移到细胞外，所以可以通过离心去除生物质固体，使木质素降解酶保留在上清液中，为保证离心机正常运行，应在离心机中的对立槽位中放置质量相近的样品，且两个样品的质量差不超过0.05g。离心条件设置为转速8000rpm，时间为10分钟，温度为室温。离心后取出上清液进行下一步酶活的测量。本实验主要研究Lac、MnP和LiP三种酶，所以需要分别采用ABTS法、2,6-DMP法和VA法测定相应的酶活大小，测试体系总体积为1mL。Lac（ABTS法）待测液成分0.7mL50mM的pH4.5丙二酸钠缓冲溶液、0.2mL0.5mM的ABTS、和0.1mL待测样品上清液。实验步骤将紫外分光可见光度计调至时间扫描模式，设置波长为420nm，单次测量，时间为60秒，时间间隔为1秒，在一号槽位放置空白对照样品（将酶上清液替换为等量的纯水），校零后定位到待测样品槽，待测样品组成为：0.2mL0.5mMABTS和0.7mL50mM的pH4.5丙二酸钠缓冲溶液，加入酶上清液启动反应。计算公式（2-1）OD1：测量开始时的吸光度OD2：测量结束时的吸光度V1：测试溶液总体积V2：测试溶液中酶液体积ε：底物的消光系数ε420=36000M-1cm-1b：测量光程，1cmMnP（2,6-DMP法）待测液成分0.8mL50mM的pH4.5丙二酸钠缓冲溶液、0.05mL10mM2.6-DMP、0.05mL10mMMnSO4、0.05mL10MH2O2和0.05mL待测样品上清液。实验步骤将紫外分光可见光度计调至时间扫描，设置波长为470nm，单次测量，时间为60秒，时间间隔为1秒，在一号槽位放置空白对照样品（将酶上清液替换为等量的纯水），校零后定位到待测样品槽，待测样品组成为0.8mL50mM的pH4.5丙二酸钠缓冲溶液、0.05mL10mM2.6-DMP、0.05mL10mMMnSO4和0.05mL酶上清液，加入0.1mL10mMH2O2启动反应。计算公式（2-2）OD1：测量开始时的吸光度OD2：测量结束时的吸光度V1：测试溶液总体积V2：测试溶液中酶液体积ε：底物的消光系数ε470=49600M-1cm-1b：测量光程，1cmLiP（VA法）待测液成分0.6mL250mM的pH3酒石酸钠缓冲溶液、0.2mL10mMVA、0.1mL10MH2O2和0.1mL待测样品上清液实验步骤将紫外分光可见光度计调至时间扫描，设置波长为310nm，单次测量，时间为60秒，时间间隔为1秒，在一号槽位放置空白对照样品（将酶上清液替换为等量的纯水），校零后定位到待测样品槽，待测样品组成为：0.6mLpH为3.0的酒石酸钠缓冲溶液、0.1mLVA和0.1mL上清液。加入0.1mL10mMH2O2启动反应。计算公式（2-3）OD1：测量开始时的吸光度OD2：测量结束时的吸光度V1：测试溶液总体积V2：测试溶液中酶液体积ε：底物的消光系数ε310=9300M-1cm-1b：测量光程，1cm测试仪器：电子天平、高速离心机、紫外分光可见光度计2.2.3扫描电子显微镜（SEM）表征取一定体积的不同样品组和不同时间的微生物培养液，经过离心（8000rpm,10min）和冷冻干燥（48h）处理，称重，研磨成粉，并进行喷金处理，之后用扫描电镜观察样品的形貌特征。2.2.4降解率的测定在测定木质素含量之前需要对培养液中的微生物和木质素进行分离，碱溶酸析法提取微生物培养液中的木质素方法如下：提取木质素的方法取10mL的培养液进行离心和冷冻干燥处理，处理后对样品称重并标记为W0，向样品中加入2mol/L的NaOH调节溶液pH值至12.0，在30℃的水浴中加热24小时，每隔1小时进行振荡，24小时后对样品进行离心处理，离心条件设置为5000转、5分钟，离心后收集固体，经过冷冻干燥处理，称重并标记为W1，取出上清液，向溶液中加入2mol/L的H2SO4调节pH值至3.0，在30℃的水浴加热24小时，期间每隔1小时进行振荡，后对样品进行离心，离心条件为5000转、5分钟，离心后对沉淀物进行冷冻干燥处理，最后称重并记为W2。测定木质素降解率的方法向质量为W2的提取木质素中加入3mL浓度为72%的H2SO4使样品水解，并在30℃的水浴中加热2小时，使样品完全浸湿后加入纯水84ml，将H2SO4浓度稀释至4%，然后在121℃下保持1小时，之后样品进行冷却并真空过滤，把过滤后的滤液收集起来，并在6小时内用紫外分光可见光度计测定295nm处的吸光度值，通过标准曲线换算为酸可溶性木质素，记为W3，把过滤后的残渣和滤纸放入坩埚，在105℃的烘箱中加热4个小时，待冷却至室温后称重并记录为W4，再通过马弗炉灼烧4个小时，温度程序设置如下：室温加热到105℃，加热速率10℃/min；105℃保持12min；105℃加热到250℃，加热速率10℃/min；250℃保持30min；250℃加热到575℃，加热速率20℃/min；575℃保持240min；降温冷却至室温称重，记为W5；酸可溶性木质素标准曲线的建立：称取0.01、0.03、0.05、0.07g木质素，经过上述相同的步骤，在295nm处测定标样的酸可溶性木质素的吸光度值并绘制曲线。木质素降解率的计算方法（2-4）（2-5）（2-6）W4：105℃的过滤样品的干燥质量W5：在575℃马弗炉中燃烧后的质量W’：空白样品前后质量差n：培养液体积/mLA2：标准曲线的截距A3：标准曲线的斜率3结果与讨论3结果与讨论根据第二章中所述的实验方法进行实验，对实验结果进行了分析与讨论。实验主要分为两个阶段，第一阶段实验主要为培养单一菌种和复合菌群，并进行酶活测量，通过对酶活数据对比分析，选择出酶活较高即对木质素降解效果较好的几组菌种组合。第二阶段主要为木质素降解实验，把第一阶段筛选出高酶活的菌种组合进行再次培养，并向培养基中加入0.1g的木质素，实时监测木质素降解酶的酶活变化，并在实验结束后进行SEM表征和木质素降解率的测定，最后对结果进行讨论与分析，并得出结论。3.1单一微生物培养对四种单一菌种（LB、TV、FS和PC）进行培养和酶活测定。在检测到菌种酶活达到最大值呈现下降趋势后，结束实验。3.1.1单一培养LB在MM中培养LB的酶活数据如图3-1所示。图3-1在MM中培养LB的酶活性曲线由图3-1可知，LB在混合培养基中的前3天基本没有酶活数值，从第4天开始酶活数值逐渐增大。Lac酶活在第10天之后进入稳定期，之后酶活数值变化不大，最终酶活最大值为1061.11U/L；MnP在5天之后进入稳定期，10天之后酶活数值开始有下降趋势，酶活最大值为1143.15U/L。此外在LB培养过程中未检测到LiP酶活，说明LB不分泌LiP。3.1.2单一培养TV在MM中培养TV的酶活数据如图3-2所示。图3-2在MM中培养LB的酶活性曲线由图3-2可知，TV在混合培养基中的前4天基本没有酶活数值，从第5天开始酶活数值逐渐增大，且增长速度幅度很大。Lac酶活在第9天之后进入稳定期，之后酶活数值变化不大，最终酶活最大值为2178.47U/L；MnP在9天之后进入稳定期，13天之后酶活数值开始有下降趋势，酶活最大值为2282.259U/L。此外在TV培养过程中未检测到LiP酶活，说明TV不分泌LiP。3.1.3单一培养FS在MM中培养FS的酶活数据如图3-3所示。图3-3在MM中培养FS的酶活性曲线由图3-3可知，FS在混合培养基中的前2天基本没有酶活数值，从第3天开始酶活数值逐渐增大。Lac酶活在第5天之后进入稳定期，之后酶活数值变化不大，最终酶活最大值为93.4U/L；MnP在8天之后酶活数值开始有下降趋势，酶活最大值为94.457U/L；LiP酶活在第三天有明显升高并进入稳定期，在6天之后酶活数值开始有下降趋势，酶活最大值为158.602U/L。3.1.4单一培养PC在MM中培养PC的酶活数据如图3-4所示。图3-4在MM中培养PC的酶活性曲线由图3-4可知，PC在混合培养基中基本没有酶活数值。Lac和MnP的酶活数值始终没有超过0U/L，说明PC不分泌Lac和MnP；LiP酶活始终上下起伏，但总体呈现上升趋势，酶活最大值为10.752U/L。3.1.5结论从上述实验结果可以得出四种单一菌种的最大酶活，如下表3-1所示。由结果可以看出，在MM中培养的单一菌种中TV对Lac和MnP的分泌效果最好，FS对LiP的分泌效果最好。表3-1单一菌种的最大酶活数值Lac(U*L-1)MnP(U*L-1)LiP(U*L-1)LB1061.111143.15--TV2178.472282.26--FS92.0194.46158.60PC----10.7523.2混合微生物培养（无木质素加入）对4种单一菌种进行排列组合，共有11种组合方法，如下表3-2所示。表3-2混合菌种的实验编号编号混合共培养组合编号混合共培养组合1TV+LB7TV+LB+FS2TV+FS8TV+LB+PC3TV+PC9TV+FS+PC4LB+FS10LB+FS+PC5LB+PC11TV+LB+FS+PC6FS+PC为探究混合共培养微生物对酶活的影响，因此对这11种组合进行培养和酶活的测量。3.2.1混合共培养LB和TV在MM中混合共培养LB和TV的酶活数据如图3-5所示。图3-5在MM中培养TV+LB的酶活性曲线由图3-5可知，混合共培养TV和LB在混合培养基中的前10天酶活处于上升趋势，在9-10天后酶活进入稳定期。Lac酶活在第10天之后进入稳定期，之后酶活数值变化不大，最终酶活最大值为2769.44U/L；MnP酶活在第9天之后进入稳定期，之后酶活数值变化不大，酶活最大值为2528.226U/L；在TV和LB混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养TV和LB不分泌LiP。3.2.2混合共培养LB和FS在MM中混合共培养LB和FS的酶活数据如图3-6所示。图3-6在MM中培养LB+FS的酶活性曲线由图3-6可知，混合共培养LB和FS在混合培养基中的酶活数值先上升后下降。Lac酶活在前两天上升且在第二天达到酶活最大值，第3天之后酶活开始下降，最终酶活最大值为1530.55U/L；MnP酶活在前两天上升且在第二天达到酶活最大值，第3天之后酶活开始下降，酶活最大值为2081.653U/L；LiP酶活在第3天达到最大值，第三天之后酶活呈现下降趋势，酶活最大值为134.407U/L。3.2.3混合共培养LB和PC在MM中混合共培养LB和PC的酶活数据如图3-7所示。图3-7在MM中培养LB+PC的酶活性曲线由图3-7可知，混合共培养LB和PC在混合培养基中的前2天基本没有酶活数值第3-6天开始大幅上升，第7天之后进入稳定期。Lac酶活在第7天达到最大值，第7天之后呈现下降趋势，最终酶活最大值为3555.556U/L；MnP酶活在第6天达到最大值，之后进入稳定期，酶活最大值为4096.774U/L；在LB和PC混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养LB和PC不分泌LiP。3.2.4混合共培养TV和FS在MM中混合共培养TV和FS的酶活数据如图3-8所示。图3-8在MM中培养TV+FS的酶活性曲线由图3-8可知，混合共培养TV和FS在混合培养基中的酶活数值先上升后下降。Lac酶活在前两天上升且在第二天达到酶活最大值，第3天之后酶活开始下降，并在第4天进入稳定期，最终酶活最大值为360.4165U/L；MnP酶活在前两天大幅上升且在第二天达到酶活最大值，第3天酶活大幅下降，在第4天后缓慢下降，酶活最大值为548.686U/L；LiP酶活在第2天大幅上升并在第3天达到最大值，第5天之后酶活进入稳定期，酶活最大值为219.086U/L。3.2.5混合共培养TV和PC在MM中混合共培养TV和PC的酶活数据如图3-9所示。图3-9在MM中培养TV+PC的酶活性曲线由图3-9可知，混合共培养TV和PC在混合培养基中的酶活数值在0-4天较稳定，第4天开始上升。Lac酶活在第0-10天持续上升，从第6天开始上升幅度变大并在第10天达到最大值，酶活最大值为1545.83U/L；MnP酶活在第5-7天大幅上升，在第8天后开始下降，酶活最大值为2798.387U/L；在TV和PC混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养TV和PC不分泌LiP。3.2.6混合共培养FS和PC在MM中混合共培养FS和PC的酶活数据如图3-10所示。图3-10在MM中培养FS+PC的酶活性曲线由图3-10可知，混合共培养FS和PC在混合培养基中的酶活数值总体呈现上升趋势。Lac酶活在第4天开始大幅上升并在第6天达到最大值，第6天之后进入稳定期，酶活最大值为159.824U/L；MnP酶活在前8天始终处于上升状态，在第9-10天下降，酶活最大值为120.9666U/L；LiP酶活在第2天大幅上升，第3天之后呈现下降趋势，酶活最大值为204.301U/L。3.2.7混合共培养LB、TV和FS在MM中混合共培养LB、TV和FS的酶活数据如图3-11所示。图3-11在MM中培养TV+LB+FS的酶活性曲线由图3-11可知，混合共培养TV+LB+FS在混合培养基中的酶活数值总体呈现先上升后下降的趋势。Lac酶活在0-2天上升，在3-10天下降，酶活最大值为1694.44U/L；MnP酶活在0-2天上升，在3-10天下降，酶活最大值为2080.645U/L；LiP酶活在0-10天始终处于上下起伏状态，酶活在第6天达到最大值，酶活最大值为107.5262U/L。3.2.8混合共培养LB、TV和PC在MM中混合共培养LB、TV和PC的酶活数据如图3-12所示。图3-12在MM中培养LB+TV+PC的酶活性曲线由图3-12可知，混合共培养LB+TV+PC在混合培养基中的酶活数值先上升后下降。Lac酶活在第0-6天总体呈现上升趋势，在第7-10天呈现下降趋势，酶活最大值为1491.66U/L；MnP酶活在第0-6天总体呈现上升趋势，在第7-10天呈现下降趋势，酶活最大值为2524.193U/L；在LB+TV+PC混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养LB+TV+PC不分泌LiP。3.2.9混合共培养LB、FS和PC在MM中混合共培养LB、FS和PC的酶活数据如图3-13所示。图3-13在MM中培养LB+FS+PC的酶活性曲线由图3-13可知，混合共培养LB+FS+PC在混合培养基中的酶活数值总体呈现先上升后下降的趋势。Lac酶活在0-2天上升，在3-10天下降，酶活最大值为299.3055U/L；MnP酶活在0-2天上升，在3-10天下降，酶活最大值为387.09U/L；LiP酶活在0-10天处于上下起伏状态，酶活在第3天达到最大值，酶活最大值为182.795U/L。3.2.10混合共培养TV、FS和PC在MM中混合共培养TV、FS和PC的酶活数据如图3-14所示。图3-14在MM中培养TV+FS+PC的酶活性曲线由图3-14可知，混合共培养TV+FS+PC在混合培养基中的酶活数值总体较低且没有明显趋势。Lac酶活在0-10天上下起伏，酶活在第6天达到最大值，酶活最大值为144.444U/L；MnP酶活在第1天异常上升达到最大值，在第2-10天较稳定，酶活最大值为161.29U/L；LiP酶活在2-3天上升，在4-10天进入稳定期，酶活在第3天达到最大值，酶活最大值为215.054U/L。3.2.11混合共培养LB、TV、FS和PC在MM中混合共培养LB、TV、FS和PC的酶活数据如图3-15所示。图3-15在MM中培养TV+LB+FS+PC的酶活性曲线由图3-15可知，混合共培养LB+TV+FS+PC在混合培养基中的酶活数值总体呈现先上升后下降的趋势。Lac酶活在0-3天上升，在4-10天下降，酶活在第3天达到最大值，酶活最大值为1326.389U/L；MnP酶活在0-3天上升，在4-10天下降，酶活在第3天达到最大值，酶活最大值为1496.975U/L；LiP酶活在第1天下降，在第2-3天上升，在第4-10天呈现下降趋势，酶活最大值为112.9025U/L。3.2.12结论11种组合混合培养微生物的最大酶活数值如下表3-3所示。从表中可以看出混合菌种LB+PC是分泌Lac和MnP效果最好的组合，但是其不分泌LiP，混合菌种LB+FS+PC是分泌LiP效果最好的组合，但是其分泌Lac和MnP的效果一般，所以通过分析，最后可得出结论：混合菌种TV+LB、LB+FS、LB+PC和TV+LB+FS四种组合对三种酶的整体分泌效果最好。故选择这四种混合菌种组合进行下一步降解木质素的实验。表3-3混合组合菌种的最大酶活数值Lac(U*L-1)MnP(U*L-1)LiP(U*L-1)LB+TV2769.442528.23--LB+FS1530.552081.65134.41LB+PC3555.5564096.774--TV+FS360.42548.39219.09TV+PC1545.832798.39--FS+PC159.82120.97204.30LB+TV+FS1694.442080.65107.53LB+TV+PC1491.662524.19--LB+FS+PC182.79217.74299.31TV+FS+PC144.44161.29215.05TV+LB+FS+PC1326.391496.97112.903.3复合菌群降解木质素通过上一节的实验结果，选择出四组混合菌种进行降解木质素的实验，首先对四种混合菌种各加入0.1g木质素并进行重新培养，培养体积为100ml，之后测量木质素降解酶酶活，测定所选混合菌种降解木质素的降解率以及进行SEM表征，最后根据结果进行分析得出结论。3.3.1酶活的测定（加入0.1g木质素）TV+LB+木质素的实验结果如图3-16所示。图3-16TV+LB+木质素的酶活性曲线由图3-16可知，TV+LB+木质素的酶活数值总体呈现上升趋势。Lac酶活在0-6天较稳定，在第7-13天上升，酶活最大值为2769.44U/L；MnP酶活在0-4天较稳定，在第5-13天总体呈现上升趋势上升，并在第13天达到最大值，酶活最大值为2399.193U/L；在TV+LB+木质素混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养TV+LB+木质素不分泌LiP。LB+FS+木质素的实验结果见图3-17图3-17LB+FS+木质素的酶活性曲线由图3-17可知，LB+FS+木质素的酶活数值总体呈现先上升后下降的趋势。Lac酶活在0-2天上升，在3-14天下降，酶活在第2天达到最大值，酶活最大值为529.167U/L；MnP酶活在0-2天上升，在3-14天下降，酶活在第2天达到最大值，酶活最大值为677.419U/L；LiP酶活总体呈现先上升后下降的趋势，在第3天达到最大值，酶活最大值为263.4405U/L。LB+PC+木质素的实验结果见图3-18图3-18LB+PC+木质素的酶活性曲线由图3-18可知，LB+PC+木质素的酶活数值总体呈现上升趋势。Lac酶活在0-4天较稳定，在第5-8天上升，在第8天之后进入稳定期，酶活最大值为2959.72U/L；MnP酶活在0-4天较稳定，在第5-8天上升，在第8天后进去稳定期，酶活最大值为3096.774U/L；在LB+PC+木质素混合共培养过程中未检测到LiP酶活，说明混合共培养LB+PC+木质素不分泌LiP。TV+LB+FS+木质素的实验结果见图3-19图3-19TV+LB+FS+木质素的酶活性曲线由图3-1可知，TV+LB+FS+木质素的酶活数值总体呈现先上升后下降的趋势。Lac酶活在0-2天上升，在3-14天下降，酶活在第2天达到最大值，酶活最大值为471.528U/L；MnP酶活在0-2天上升，在3-14天下降，酶活在第2天达到最大值，酶活最大值为604.838U/L；LiP酶活总体呈现先上升后下降的趋势，在第3天达到最大值，酶活最大值为400.537U/L。结果讨论对上述混合菌种组合的最大酶活数值进行汇总，如下表3-4所示。表3-4不同微生物组合共培养的最大酶活数值微生物组合Lac(U/L)MnP(U/L)LiP(U/L)LB+TV-木质素3056.662782.26--LB+FS-木质素529.16677.42263.44LB+PC-木质素2959.723096.77--LB+TV+FS-木质素471.53604.84400.54对比表3-4和表3-3可知，复合菌群的酶活情况要普遍较好于单一菌种，但是并不是复合菌群中微生物的种类越多，酶活情况越好，只有特定的组合才具有较高的酶活，从接下来进行的降解率的测量可以更直观地证明这一结论。3.3.2SEM对降解后的木质素通过SEM进行形貌分析，进一步证明木质素被混合培养微生物所降解。初始木质素样品的形态和粒度如图3.20a所示，该结果表明，对照样品的表面光滑，粒径分布在4μm和20μm之间，木质素颗粒呈分散状态，分子间具有一定的空间。在混合培养基（没有任何微生物）中加入的0.1g木质素的第14天样品的SEM如图3.20b所示，可以看出，木质素的颗粒尺寸已经减小并且样品的表面变得不均匀。这是由于在搅拌过程中木质素被加入培养物中的玻璃珠破碎成较小颗粒的分子，然而，物理力并没有打破木质素结构中存在的化学键。与3-20b相比，共培养真菌LB和PC（图3.20c）和共培养真菌LB、TV和FS（图3.20d）发酵后的木质素存在显著差异。首先，木质素的粒径进一步减小，其尺寸大都在4μm以内，共培养物处理的木质素与没有任何微生物的样品相比具有更小的粒度。此外，木质素的表面变得更粗糙和不均匀，并且木质素分子之间的间隔几乎消失。木质素分子变得更密集而不是分散。（a）未经处理的木质素的对照组样品（b）在无微生物的混合培养基中振荡14天的木质素（c）在复合菌群LB+PC中培养14天的木质素（d）在复合菌群LB+TV+FS中培养14天的木质素图3-20木质素SEM图3.3.3降解率的测定根据实验方法章节2.2.5，酸可溶性木质素的标准曲线如图3-21所示，酸可溶性木质素在295nm下与吸光度呈良好的线性关系y=6.1434x+0.0277，R2=0.9601。根据标准曲线可以将样品组的吸光度值转化为溶液中残留的酸可溶性木质素的浓度，从而进一步计算出木质素的降解率。图3-21酸可溶性木质素标准曲线通过测定样品组中残留的酸可溶性和酸不可溶性木质素浓度，通过公式2-4、2-5、和2-6计算出样品组的木质素降解率，不同微生物组合共培养对木质素的降解率如下表3-5所示，表3-5不同微生物组合共培养对木质素的降解率微生物组合LB+TV-木质素LB+FS-木质素LB+PC-木质素LB+TV+FS-木质素降解率70%50%75%60%由表3-5可知，选择出的四种复合菌种中LB和PC的菌种组合对木质素的降解率最高，达到75%，LB和FS的菌种组合对木质素的降解率最低，为50%。4结论与展望本文通过大量实验研究复合菌群共生降解木质素发酵工艺的优化。通过对四种菌种（黄孢原毛平革菌、腐皮镰孢、桦革裥菌、变色栓菌）进行微生物培养、酶活的测定、SEM表征和降解率的测定等一系列实验，测定出单一菌种及复合菌群组合对三种酶（木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶）的分泌情况，并找到对木质素降解效果最好的复合菌群组合。通过单一菌种的实验发现，在四种单一菌种中TV对Lac和锰MnP的分泌效果最好，酶活数值分别是2178.47和2282.26U/L；FS对LiP的分泌效果最好，酶活数值为158.60U/L。通过复合菌群的实验发现，复合菌群的酶活情况要普遍较好于单一菌种，但是并不是复合菌群种类越多，酶活数值越高，混合菌群TV+LB、LB+FS、LB+PC和TV+LB+FS四种组合对三种酶的整体分泌效果最好，其中LB+PC对Lac和MnP的分泌效果最好，其中Lac酶活最大值为3241.67U/L，MnP酶活最大值为4532.26U/L；LB+FS+PC对LiP分泌效果最好，酶活最大值为299.31U/L。本文继续通过降解率的测定实验，测定出四种混合菌种组合LB+TV、LB+FS、LB+PC和LB+TV+FS对木质素的降解率分别为：70%、50%、75%和60%。得出结论：桦革裥菌（LB）和黄孢原毛平革菌（FS）的复合菌群对木质素的降解效果最好，降解率可达到75%。此次研究的结果对木质素的降解研究以及目前的能源和环境问题均有一定帮助。木质素作为一种结构复杂且极其丰富的可再生能源，木质素资源的合理有效利用在造纸工业、环境保护、饲料工业和生物肥料等领域都有着相当广阔的应用前景。如何更高效地降解利用木质素成为关键的问题，本文所得出的结论为今后研究提供了新的思路及帮助。对于本次研究，还存在很多需要完善的地方。如本次研究的实验是在室温环境下进行的，并没有考虑到温度对菌种酶活的影响，需要在未来进行更多更全面的实验来进行改进。另外，对于木质素的降解，或许单纯地使用生物技术降解并不能达到满意的降解效果，在未来的研究中，可以尝试生物、化学、物理方法相结合来降解木质素。致谢致谢缺乏致谢缺乏致谢参考文献参考文献Fernández-FueyoE,Ruiz-DueñasFJ,MikiY,etal.Lignin-degradingperoxidasesfromgenomeofselectiveligninolyticfungusCeriporiopsissubvermispora[J].TheJournalofBiologicalChemistry,2012,287(20):16903-16916.李海涛,姚开,何强,等.木质素的生物降解及其应用[J].皮革科学与工程,2010,20(6):27-31.HendriksAT,ZeemanG.Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass[J].BioresourceTechnology,2009,100(1):10-18.董秀琴,袁红莉,高同国.木质素降解酶及相关基因研究进展[J].生物技术通报,2014(11):62-72.张盼.