植物组织培养教材

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第一章植物组织培养的应用

植物组织培养可应用于以下几个方面：

1.挽救濒于灭绝的植物；

2.快速繁殖稀有植物或有较大经济价值的植物；

3、生产脱毒苗；

4、利用组织培养的材料作为植物生物反应器；多种中草药资源匮乏，产量

不足，甚至濒于灭绝。利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产；可不再依

附于自然环境，不仅互以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细

胞系，来提高其药用价值。如用培养的人参悬浮细胞来生产人参皂甘。利用培

养的植物细胞和组织作为生物反应器，也可生产某些蛋白质、氨基酸、抗生

素、疫苗等。

5、组织培养结合超低温可经济有效地保存植物种质资源

6、组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分；

7、作物育种

（1）单倍体育种：采用花药培养可缩短杂合体纯化所需的时间，节省土

地，假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同，通过花药培养，在

理论上只要有2n个F1代花粉植株，就有可能得到一个所需要的基因组合，而

传统育种方法，则至少要有4n个F1植株才能得到一个所需要的基因组合。

（2）在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障

碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造

出细胞质杂种。

（3）通过细胞培养，在细胞水平上进行突变体选择，可在一定程度上使高

等植物的育种程序微生物化，从而提高选择效率，节省时间和土地面积。

（4）体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源。

8、用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为稀有和珍贵物种的繁殖提供

了一种高效的手段。

9、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、胚胎学、基因工程、植物发育

等的基础研究。

10、试管花

第二章植物组织培养的发展简史

一、探索阶段（20世纪初至20世纪30年代中）

20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织

可不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的

潜力。Haberlandt首次进行了离体细胞培养的实验，在1902年发表的“植物

离体细胞培养实验”报告中，提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法

等科学的预见。

1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这

些胚在离体条件下长到成熟。

Laibach（1925,1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的胚剖出，在人工

培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；

1922年，美国的Robbins和德国的Kottc分别报道培养离体根尖获得其些

成功。

1934年，White成功离体培养了番茄的根尖。

二、奠基阶段（20世纪30年代中至50年代末）

1、White（1934年）在番茄根培养实验中使用的培养基包含无机盐、酵母

浸出液和蔗糖。他后来（1937）用3种B族维生素（毗哆醇、硫胺素和烟酸），

取代酵母浸出液获得成功。认识了B族维生素对植物生长的重要意义。

2、Gauthcrct（1934）在山毛柳等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡

萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织可以不断增殖几个月，但只有在

培养基中加入了B族维生素和IAA以后，形成层组织的生长才能显著增加。

1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟

草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织

培养物。因此，GautheretAWhite和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠

基人。

3、Skoog（1944）以及Skoog和崔激等（1951）发现，腺噂吟或腺昔不但可以

促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作

用，诱导芽的形成，从而确定了腺喋吟与生长素的比例是控制芽和根形成的主

要条件之一。

4、1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖离体培养，可以由已受

病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。

5、1953T954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。把万寿菊和烟草的

愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，形成了由单细胞和细胞聚集

体组成的细胞悬浮液。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组

织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细

胞发生了分裂。

6、1955年，Miller等由鳞鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞

分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。

7、1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出

在烟草髓蛆织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数。

8、1958年，Steward等以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了

Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为了植物组织培养研究历史中的一个里

程碑。

9、19589959年,Reinert和Steward分别充道,在胡萝卜愈伤组织培养

中形成了体细胞胚。

三、迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）

1、基础研究：1965年，Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培

养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株，进一步证实了植物细

胞的全能性。

2、原生质体培养取得重大突破:

1960年Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。

1971年，Takebe等首次获得了烟草原生质体再生植株。

1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一

个体细胞杂种。

3、花药培养取得显著成绩：

1964年,Guha和Maheshwari报道,在毛曼陀罗中通过离体花药培养由小

抱子直接发育成胚。

1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。

4、微繁技术得到广泛应用

I960年，Morel建立了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由

于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花

工业”。

第三章植物组织培养有关的基本概念

一、植物细胞全能性（totipotency）

细胞全能性:指一个活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会

有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分

裂、分化再生成一个完整植株。

从理论上讲，只要是一个活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但

实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相

关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，所以应尽量选取幼嫩的植物组

织作为培养的实验材料。

二、细胞分化、脱分化与再分化

细胞分化一一分生性细胞在形态结构和功能上发生永久性（不可逆转性:适

度变化的过程。

脱分化一一由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无

分化的细胞团（即愈伤组织）的过程。

再分化一一由无分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构，执行一定

生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的过程。

三、器官发生

器官发生一一由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽（或根），再在另一种培

养基上产生根（或芽），形成一个完整植株。

第四章植物组织培养所需的基本设备与条件

一个理想的植物组织培养室应包括：1、化学药品室；2、培养基配制室；

3、灭菌室；4、接种室；5、培养室；6、培养物的检测和观察记录室。

一、化学药品室

应配置几个药品橱、实验台、万分之一和百分之一的电子天平。室内还应

放一台大容量的冰箱，用来分门别类地保存激素、抗生素和各种需低温保存的

物品。

组织培养所需主要药品的存放要求如下：

1、可室温存放的药品：无机物、蔗糖、盐酸、氢氧化钠，95%酒精，琼

脂。

2、宜于零上低温存放的化学药品：

有机物、激素

3、应当在一20℃下保存的药品：

液体抗生素等。

二、培养基配制室

需要大干401n2的一个房间或更大些，为了方便起见可将房间分为两个区:

一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥区：

二是培养基配制区：应有大型实验台若干个，还应配备常温冰箱一台，电

炉（1000W,2000W）,微波炉，放置移液管、微量移液器的架子,酸度计等。

三、灭菌室

灭菌室面积可小一些，其内除放灭菌锅外，最好还有临时存放培养基、培

养器皿的架子，也应有自来水装置灭菌室可根据灭菌锅的多少，工作量大小

来确定面积，要求房间能有较好的通风散热条件，且要配备专门的电源线路，

因为电热灭菌锅的耗电量很大。

四、接种室

接种室是对培养的植物材料进行无菌操作的地方，应有超净工作台、放置

培养容器的架子等。整个房间最好设有缓冲间和双层门窗，以防灰尘和微生

物。房间内最好装有紫外灯或经常喷洒杀菌剂，以抑制过多微生物生长。工作

人员在进入接种室之前在缓冲间内更换衣服、鞋帽、穿好工作服，戴上口罩、

防尘帽，换上拖鞋才能进入接种区，进入接种区之后随手把活动门关上。

五、培养室

培养室最重要的是要恒温、恒湿，无尘且空气流通。温度应维持在

(25±3)℃,相对湿度应在50%〜60机培养室内有规律地安放培养架或摇床。

培养室内所有光照和黑暗应由定时器自动控制。整个培养室内还应装有一

个或多个紫外灯，以便能定时对整个房间进行杀菌处理，特别是在夏天潮湿、

霉雨季节，最好每天在晚上用紫外灯杀菌30min以上。培养室内的地面、墙

壁、培养架及所有器物的表面都应经常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋

生。

六、培养物的检测与观察记录室

对培养物进行及时的检测和观察记录是研究植物组织培养的重成部分之

一，如不及时观察记录或对培养物的形态、结构、生理变化以及培养基变化等

进行及时检测，就不可能获得准确有效一手资料，也就不能及时地发现和找出

问题，提出解决问题的方法和改进培养的方案。检测与观察记录室最好单独设

立一个房里面摆放实体解剖镜、普通光学显微镜、显微照相和记录设备。

第五章植物组织培养常用培养基成分及培养基配制

目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过

分析综合和改进而成的。例如，White培养基是Uspcnski和Uspcnskaia(1925)

的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养：Gautherut培养基是建立在

Knop营养液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在White和Gautheret培

养基的基础上改进而成。

一、培养基的成分

(一)、无机营养成分(包括大量元素，微量元素和铁盐)

1、大量元素：一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元素。

氮：常以硝态氮(N03)或氨态氮(NH4),或两者相互配合的形式存在。缺氮

时愈伤组织会出现花色素昔的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。

磷：常以NaH2P04-1120.KH2P04或(NH4)H2P04的形式提供。

钾：常以KC1、KN03或KH2P04形式。

钙：常以CaC12・2H20、Ca(N03)2o

镁：常以MgS04-7H20的形式，既提供了镁也提供了硫。

缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤

组织表现出极其蓬松状态。

2.微量元素:指小于0.5mmol/L的元素。

主要包括铁括e)、镒(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(Cl)、硼(B)和铜(M。)等。

铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe的特殊性质，即很不

稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe

盐单独配制，且常以整合物的形式，把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠

(Na2EDTA)先分别配成溶液，再相互混合使形成整合铁，以防止沉淀和帮助被植

物吸收。

(二)、有机营养成分

维生素：除维生素B1、维生素B6、烟酸之外，在部分培养基中还添加维

生素C(抗坏血酸)、维生素H(生物素)等。

甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(环己六醇)：肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的

形式参与由Ca介导的信号转导。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有

水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母

浸出物等。

（三）、碳水化合物

用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或葡萄糖，用量通常为2%〜4%,高者

可达5%,亦可用市售的白糖所代替。

几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织

在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、甘

露糖、山梨醇和乳糖作为碳源的。

（四）、植物生长调节物质

在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两

大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等。

1.生长素：主要被用于诱导刺激细胞分裂和根的分化。

常用的生长素有:NAA（常乙酸）,IAA（口引用乙酸）,IBA（口引用丁酸）,NOA（蔡

氧乙酸），2,4一D（2,4一二氯苯氧乙酸），2,4,5—T（2,4,5—三氯苯氧

乙酸）。

对愈伤组织增殖最有效的是2,4-1）,特别是对单子叶植物。但2,4-D

是一-种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。

2.细胞分裂素

使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和

茎长高，抑制根的生长。

常用的天然CTK主要有：玉米素，玉米素核甘，二氢玉米素。

常用的人工合成CTK主要有：激动素（KT）、6-苇基腺喋吟（6-BA）、2ip；异

戊烯氨基嚓吟）、和TDZ（thidiazuron,口塞二噗苯基服）等0

3.赤霉素：主要是GA3。用时需过滤灭菌；促进试管苗伸长。

（五）、琼脂或其他支持物

除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固体或半固体的培养基上，以

防止培养物沉人液体培养基，因缺氧而死亡。琼脂是一种极为理想的支持物。

它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培养基中的必需成分，只是作为一种

凝固剂使培养基变成固体或半固体状态。

（六）、其他添加物：酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，渗

透调节剂、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。

1.活性炭：能从培养基中吸附许多有机物和无机物分子，可清除培养中植

物组织在代谢过程中产生的、对培养物有不良或毒副作用的物质，也可以调节

激素的供应。

活性炭还有刺激胚胎发生（如烟草花药培养）或组织生长和形态发生的作

用。

2.渗透调节剂：常选用一些代谢微弱的糖来充当，如甘露（糖）醇、山梨醇

和聚乙二醇等，这些糖基本上不被培养的植物组织所吸收，而只存留在培养基

中，起到调节渗透的作用。

3.抗生素：培养的植物组织内部携带有病原物，表面消毒不解决问题时，

可在配置培养基时添加抗生素，如加200〜300U的庆大霉素可使细菌污染受到

很好的控制。

二、培养基的选择

1.选择合适的培养基

基本培养基：MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合于

许多单子叶植物，White培养基适于根的培养

激素浓度和相对比例的确定

先参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或

失败的试验，如果有则直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每

一种拟使用的激素选择3〜5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方

案。

三、培养基的配制

（一）、配制母液

（二）、配制培养基

（三）、配制培养基时应注意的有关问题

1,高温灭菌的基木过程

检查灭菌锅内有无足够量的水，最好用蒸储水或去离子水，因为自来水含

有较多的矿物质，容易使锅内形成水垢，影响锅的使用寿命。将需要灭菌的器

皿、培养基等放入锅内，不要装得太满，以不超过锅的容量3/4为宜。

2、高温下培养基成分的降解

经高温火菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。

NAA、2,4一D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。

蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产

生抑制培养的植物组织生长的物质。

高温可使碳水化合物和氨基酸发生反应。

维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的pH值高于5.5,则维生

素B1会被迅速降解。

第六章无菌操作技术与设备

一、干热灭菌

干热灭菌就是在180℃的烘箱内对器皿进行杀菌处理，是一-种彻底杀死微

生物的方法。适合于干热灭菌的潜皿和物品有：①玻璃器皿，如三角瓶、烧

杯、量筒等；②金属物品，如镜子、解剖刀、剪刀等；③可以高温灭菌的塑料

制品。

二、湿热灭菌

湿热灭菌就是人们平时所说的蒸汽灭菌。灭菌的温度为121C,压力为

103.4kPa,灭菌时间除液体外要求在121℃下维持15min以上。液体灭菌时

间可依据体积而定，体积越大，需要时间越长，如2.5L需20min,10L需

28min,25L需31min。

湿热灭菌时应注意以下问题：

1、不能随意延长灭菌时间，因为延长时间会使一些化合物过多分解，冷别

是蔗糖会分解为单糖，使培养基pH降低，琼脂不能很好的凝固；

2、如果灭菌锅没有吹干程序，从锅内取出的纸制品、纱布等最好立即转到

60℃的温箱中吹干;

3、由于锡箔纸不透气，推荐使用牛皮纸或报纸等包装物品，以利于水分快

速蒸发；

4、灭菌锅所装蒸镭水或去离子水应经常更换，以防止微生物污染和水中杂

质过多，给灭菌锅和要灭菌的物品带来不利影响；

三、微过滤灭菌

是使需要灭菌的液体通过一个微孔滤膜，以除去液体中的微生物、微颗粒

等，过滤的范围是0.025〜10阿。这种方法对于高温灭菌容易引起分解的物质

最为适宜，如容易分解的维生素、激素、植物组织提取物、抗生素等。

微过滤灭菌的关键部分是微孔滤膜，如要彻底清除细菌、酵母等微生物，

最好使用0.22内n的滤膜。如要获得原生质体，则可使用0.45阿的滤膜。

四、化学药物灭菌

1、银子、解剖刀等器具的灭菌：

将准备使用的锻子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精

浸泡。使用时取出镶子或解剖刀，放在酒精灯上加热至酒精完全除去为止，用

完后再放回75%泗精中。

2、外植体的灭菌：

将植物材料先用自来水加洗洁精少许浸泡lOmin以上，浸泡期间要轻轻搅

动几次，以便使植物材料与溶液充分接触，然后用自来水冲洗10min左右。

在超净工作台上，将材料在70%酒精中进行表面预消毒30秒，倒掉酒

精，再用0.1%升汞(HgC12)进行消毒8分钟左右，或用1%次氯酸钠(NaOCI)或

次氯酸钙Ca(0Cl)2消港20min左右，具体时间要根据材料而定。然后用无菌

水冲洗3〜4次，每次2min左右。次氯酸盐在pH6.0左右时活性较高，高于

8.0时几乎无活性；通常往消毒液中添加几滴吐温20或吐温80等表面活性

剂，以提高灭菌效果。

五、抗生素灭菌

首先必须弄清楚要杀死的是真菌、细菌还是病毒，是哪类真菌、哪类细菌

或病毒；其次应知道使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响；最后要

确定抗生素的使用浓度、使用时期和处理时间的长短。

抗生素的使用只能是用作预防微生物污染的方法，而不能用于杀死微生

物，因此在使用时最好加在培养基当中，而不宜作为一种杀菌剂单独使用。

因为农杆菌介导法已成为植物基因转移的一个主要方法，在转基因过程中

的除菌和抑菌都离不开抗生素，所以使用抗生素已逐渐成为植物组织培养中的

灭菌技术之一。

六、无菌操作中其他应注意的问题

注意防止紫外线的危害

植物组织培养室和超净工作台上的紫外灯开放时间不可太长，最好在

30min之内。超净工作台上的紫外灯关闭以后不要立即走近工作台，最好让无

菌风吹2〜3min后再开始操作。

第七章离体快速繁殖方法

微繁一一在无菌条件下进行植物的无性繁殖。I960年，Morel提出了一个

离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。使微繁技术真正实用化。

一、无菌培养物的建立

1、外植体的选择：茎段、茎尖、叶片、嫩芽、鳞茎的鳞片、花器官等。

注意：（1）、在生长季节开始时由活跃生长的枝条上切取的外植体，通常

能产生最好的效果。（2）、对于需要低温、高温或特殊的光周期才能打破休眠

的鳞茎、球茎、块茎和其他器官，应当在取芽之前进行必要的处理。

2、消毒

二、茎芽的增殖

（一）茎芽增殖的类型

1、器官型（organtype）

以芽增殖芽的方法，其遗传性状稳定，成为目前快速繁殖中采用的主要方

法。

2、器官发生型(organogenesistype)

外植体先脱分化形成愈伤组织，再分化出器官的方式。

胚状体发生型;embryoidtype)

体细胞增殖发育的顺序与受精卵发育极为相似，经过原胚一球形胚一心形

胚一鱼雷胚一子叶胚5个时期，最后发育成完整的植株。胚状体可从愈伤组织

形成，也可不经过脱分化直接从子叶、卜胚轴和花药培养形成。通过胚状体的

培养可以获得大量的植株，大大提高繁殖率

4、原球茎型(protoeombtype)

目前兰花的快速繁殖主要靠原球茎的分化方式。

5^球茎芽型(globosestembudtype)

观叶海棠的叶柄表面可产生一个个圆球形的小突起(球形茎)，小突起的

一端产生芽和叶片，另一端长出根，最后形成完整的小植株。

6块茎型(tubertype)

花叶芋的叶片或叶柄上，先形成类似愈伤组织的小硬粒突起，并逐渐形成

粒状的芋块。随后粒状芋块上分化出新的1〜4个小突起。由小突起上分化出芽

原基。随着小芋块的增大，分化出的芽也越密集并形成许多小苗，在小苗基部

与芋块交界处分化出白色的根。

7鳞茎型(bulbtype)

百合的鳞茎切块基部近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎。如卷丹鳞片

的顶部、中部和基部均能诱导分化出小鳞茎。郁金香鳞茎旁又会分化出小鳞

茎。

(二)器官发生型

1愈伤组织形成的条件

诱导愈伤组织常用的生长素是2,4—D,IAA和NAA,常用的细胞分裂素

是KT和6-BA。在禾谷类植物中，只用2,4—D就能成功地诱导愈伤组织。多

数情况下诱导愈伤组织既需要生长素，也需要细胞分裂素工

黑暗条件下有利于愈伤组织的形成，光照对组织的愈伤化有抑制作用。

2愈伤组织状态的调控

优良愈伤组织须具备的特性：

（1）高度的胚性或再分化能力，以便得到再生植株；

（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系；

（3）旺盛的自我增殖能力，以便建立大规模的愈伤组织无性系。

（4）经过长期继弋保存不丧失胚性，以便衣它们进行各种遗传操作。

愈伤组织状况调整的策略

（1）选择适当的基因型和外植体。如禾谷类植物愈伤组织培养的成功，是

由于选择了未成熟胚和幼穰作为外植体，它们的根和幼叶虽然也能形成愈伤组

织，但都是非胚性的。

（2）选择正确的培养基，特别是正确的植物激素种类和浓度，及二者之间

正确的配比。

（3）采用某些特殊的理化因素，改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。如

在玉米幼胚愈伤组织培养中，通过在培养基中添加5mg/L或10mg/L

AgNO3,抑制组织内乙烯的作用。

（4）还原态氮具行促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作

用。增加培养基中的氨态氮（或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有机形式的还

原态氮）可明显促进细胞分裂；增加培养基中的硝态氮或减少还原态氮，可显著

抑制细胞分裂。

3影响茎芽分化的因素

化学因素

（1）细胞分裂素/生长素

在茎芽诱导中，2:p在通常情况下是最为有效的。

（2）生长素能抑制芽的形成：

在烟草中，浓度低到5umol/L的IAA即足以完全抑制茎芽的自发分化。

当与激动素或腺噂吟结合使用时，生长素可以抵消它们促进茎芽形成的作用。

（3）赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用：

在烟草中，若把正在分化的愈伤组织在黑暗条件下以GA3处理，时间即使

短至30〜60min,也会减少芽的分化，而且在处理之后48h,所有的拟分生组织

或茎芽全都不复存在。

物理因素

（1）琼脂浓度：在培养烟草薄层组织时，当琼脂为1%时'只能形成

花；随着琼脂浓度的下降，花的形成频率减少，营养芽的分化出现。在液体培

养基中，则只能愈伤化和分化营养芽：

（2）渗透压：在由马铃薯叶肉原生质体获得的愈伤组织中，只有在培

养基里加入0.2〜0.3mol/L甘露醇以使渗透压保持在200到400毫渗透压摩

尔时，才可能出现茎芽的分化。

（3）光照：高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用。天竺葵愈伤组

织只有在光照和黑暗周期交替（15〜16h光照最好）条件下才能分化茎芽，培养

在连续光照下的愈伤组织总是白色的，不表现器官发生。

光质对器官分化也有影响。在烟草中蓝光促进茎芽分化，红光刺激生根。

（4）温度：Skoog（1944）在5〜33c的范围内研究了温度对烟草愈伤组织

生长和分化的影响，发现直到33℃时愈伤组织的生长都随温度的上升而增加，

但只有在18℃时最适合茎芽的分化，在33c时不能形成茎芽。

其他因子：

培养材料的染色体组，供体植株和外植体的生理状态，外植体的细胞发育

状态，培养物的历史以及内生激素水平。

（三）影响茎芽增殖的因素

1、无机盐水平

对有些植物来说，MS培养基中的无机盐水平或有毒或太高。如乌饭树的茎

芽在只含1/4强度MS无机盐的培养基中能长得很好，无机盐水平再高或是有

毒或是并没什么好效果。

2、激素

CTK为了获得健壮的茎芽应适当降低细胞分裂素浓度。细胞分裂素使用的

浓度范围是（）.5~5mg/L,大多数适当的浓度是1~2mg/Lo

GA为促使茎的伸长，有时加入GA；

生长素在进行茎芽繁殖时，TAA、NAA使用的浓度范围是0.1〜lmg/L。

3、琼脂微繁所用的培养基通常都用0.68%的琼脂固化。但在

卡特兰和大多数凤梨科植物中，只有在液体培养基中才能把培养建立起来。应

用液体振荡培养的一个特殊优点是茎芽一边增殖一边彼此离散，不必用人工把

成簇的茎芽切开。

4、光照和温度

光的作用只是满足某些形态发生过程的需要，因此1000〜5000lx的光强

即已足够"光周期严格地说也是不重要的。每天16h光照/8h黑暗交替照

明，即可产生令人满意的效果。

培养室的温度一般恒定在25℃左右。

三、离体枝条的生根

1、试管内生根

1）生根培养基应降低盐的浓度，减少到1/2Ms或1/4MS.

2）诱导生根需要有适当的生长素，最常用的是NAA和IBA,浓度一般为

0.1〜10.0mg/Lo

3）对于难生根的植物，可尝试把它们的下端浸在高浓度生长素溶液中若干

时间（由几秒到几小时）之后，再插于无激素培养基中。

4）在生根培养基中减少蔗糖浓度（如减到1%）和增加光照强度，能刺激小

植株通过光合作用制造食物的能力，以便由异养型过渡到自养型。

5）枝条在离体条件下生根所需的时间由10d到15d不等。根长15nlm左右

时移栽最为方便，更长的根在移栽时易断，会降低植株的成活率。

2、试管外生根

在有些植物中，可以把在离体条件下形成的枝条当做微插条处理，使它们

在土中生根。在这种情况下，须把插条的基部切口先用标准的生根粉或混在滑

石粉中的IBA处理；

有些植物如月季，则可先在试管内诱导枝条形成根原基，然后再移栽土

中，遮荫保湿，待其生根。试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤，因而可

降低成本。

无根苗的嫁接

试管内嫁接(微体嫁接)：即以试管苗的0.1〜0.2nmi长的茎尖为接穗，以

在试管内预先培养出来的带根无菌苗为砧木，在无菌条件下借助显微镜进行嫁

接，之后继续在试管内培养，愈合后成为完整植株再移入土中。

试管外嫁接：无籽西瓜试管苗嫁接到瓠子上后，在温度为25〜30C,相对

湿度基本饱和的条件下，3d后伤口长出愈伤组织，1周后成活并长出新叶。

四、壮苗、炼苗和移栽

需壮苗、炼苗的原因：试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营

养供应的条件下，虽有叶绿素，但营异养生活，在形态解剖和生理特性上都有

很大脆弱性，如无角质层或蜡质层，气孔开张过大且不具备关闭功能等。这样

的试管苗若未经充分锻炼，一旦被移出试管，投入到一个变温、低湿、强光、

有菌和缺少完全营养的条件下，必定要被剧变的环境所吞噬。

壮苗：是移栽成活的首要条件，在培养基中加入一定数量的生长延缓剂如

多效II坐(PP333),B9或矮壮素(CCC)等，在很多种植物中都是培育壮苗的一项有

效措施。

炼苗：壮苗之后则须开瓶，降低瓶中湿度，增强光照强度，以便促使叶表

面逐渐形成角质，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能

等。

移栽：先要轻轻地、彻底地洗掉沾在根上的琼脂培养基，以免栽后发霉。

要选用排水性和透气性良好的移栽介质，例如蛭石、河沙、珍珠岩、腐植土

等。移栽后，最初10〜15d要通过喷雾或罩上透明塑料以保持很高的湿度

(90%〜100%]

五、微繁中存在的一些问题

1、物种的局限性

很多难于用传统方法繁殖的重要树木，包括若干裸子植物，离体繁殖技术

还未过关。

2、无性系变异

在商业性微繁当中，一旦无菌培养已经建立，人们就禁不住以此为起点连

续繁殖若干世代，结果就有可能使培养早期发生的变异（芽变或偶然变异）累积

起来。如果是通过愈伤组织进行微繁的话，经过长期继代培养之后，再生植株

中出现变异的可能性更大。

3、培养物污染

在植物大规模微繁期间，即使外植体在一开始进行了严格的表面消毒，某

些慢速生长的病原菌（特别是内生菌）可能依然存在，但只有在培养物经过多次

继代之后，这些污染物才表现出来并被人们所发现。

4、玻璃化

玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，多数

发生在植物茎尖培养和离体快繁中。玻璃苗生长繁殖速度下降，最后甚至死

亡。

玻璃化的诱因

外植体类型、培养基成分和培养条件等各种内外因素都可能是玻璃化现象

出现的原因，其中比较重要的如琼脂用量太低或细胞分裂素浓度过高，培养温

度过高，光照不足以及乙烯合成增加等。

5、培养基的褐变

褐变的原因：由外植体的切口表面渗出的酚类物质氧化后成为酸类物

质，使培养基变成暗褐色，从而对组织产生毒害作用。

克服培养基褐变的措施

1、以几天的时间间隔将外植体转到新鲜培养基上2〜3次，在这段时间内

外植体的切口愈合，酚类物质外渗停止。

2、把由亲本植株上直接采集的茎芽，先在一种液体培养基上培养3d,然

后再在半固体培养基上培养。或于接种的第一个星期之内，每天更换一次液体

培养基。

3、在培养基中加入一些抗氧化物，如盐酸半胱氨酸(100mg/L)、抗坏血酸

(50~100mg/L)或者是柠檬酸(150mg/L)。

4、使用能够吸收酚类化合物的聚乙烯毗喀烷酮(PVP,用量一般为

0.01%)、活性炭(0.1%〜0.5%)o

5、由于光能促进酚的氧化，开始时把培养物置于暗处也可能有助于减轻褐

变的问题。

6、适当降低培养温度。

第八章体细胞胚胎发生

一、体细胞胚(sonaticembryo)或胚状体(enbryoid)的概念

指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过

程形成的具有双极性的胚状结构。

胚状体的特点：

1、不是两性细胞融合的产物；

2、不同于孤雌胚或孤雄胚，不是无融合生殖的产物；

3、不同于器官发生途径形成的茎芽和根，它的形成须经历与合子胚相似的

发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。

二、体细胞胚发生研究的历史

离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中由Reinert(1958)

和Steward等(1958)发现的。

迄今已在分属于40余科(包括裸子植物)的100多个种植物中有过关于体

细胞胚胎发生的报道。

能产生体细胞胚胎的外植体有：单倍体的小抱子；二倍体组织如茎段、子

叶、茎尖、叶柄、贮藏根的韧皮部和木质部等；三倍体的胚乳。

三、体细胞胚胎发生的方式

1、从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈

伤组织阶段，如石龙芮再生植株茎表面长出不定胚。

2、外植体先愈伤比，然后由愈伤组织细胞分化成胚，如石龙芮花器愈伤组

织成胚，从愈伤组织产生胚状体最为常见。

A、由外植体外层细胞直接产生体细胞胚

B、由外植体组织内的细胞产生体细胞胚

C、愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚

D,E、多个或单个细胞形成体细胞胚

四、体细胞胚胎发生及植株再生研究的意义

（1）植物细胞分叱、全能性表达过程和机理等重大理论问题的研究提供了

理想的实验体系：

（2）人工种子的制作，是促进离体快速繁殖、实现田间和温室栽培的重要

途径；

（3）胚性愈伤组织可在适宜的条件下长期保存，为解决濒危植物挽救等问

题提供了可能：

（4）胚性愈伤组织具有遗传稳定、再生频率高的特点，对于基因工程非常

适用；

（5）体胚发生过程中众多体细胞无性系变异为突变体的筛选提供了新的来

源；

（6）以胚性细胞为材料制备原生质体，为细胞分化和植株再生等奠定了基

础。

五、影响植物体细胞胚发生及植株再生的因素

1、基因型的影响

2、外植体种类：外植体的类型、所处发育和生理状态以及取材部位等因素

均影响体胚发生。甚至外植体形态学部位也是影响因素之」幼嫩的生殖器官

较容易由外植体直接产生体细胞胚胎。而幼嫩的营养器官则一般需经愈伤组织

途径产生体细胞胚胎。

3、预处理：在一些植物体胚诱导中，如预先低温(4℃〜8℃)储藏1—2个

月。

4、培养基种类及其成分

培养基种类体胚诱导中70%采用MS培养基。MS培养基中含较高水平的

NH4N03和螯合铁。对体胚发生有促进作用。

氮源

在胡萝卜叶柄节段培养物中，只有当培养基里含有一定数量的还原态氮

时，才能出现胚胎发生过程。在以KN03为唯一氮源的培养基上建立起来的愈伤

组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而，若在含有55nlmol/LKN03的培养基

中加入少量(5mmol/UN1I4C1形态的氮，胚胎发育过程就会出现。

碳源

作为外植体的渗透压调节物和体胚发育的能源物质，碳源对体胚发生有重

要影响。在柑橘体胚发生中，适当浓度的甘油大大刺激了愈伤组织的生长和胚

胎发生，而且能获得同步控制。苹果离体叶片培养时，在保证碳源供应的前提

下，降低蔗糖浓度有利于直接体胚发生。

高浓度的钾

在野生胡萝卜中，高浓度的钾(20mniol/L)是胚胎发生所必需的。

培养基中溶解氧

在培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值4.5mg/L),否则将有利于生

根，而不利于成胚。这是因为低水平的溶解氧在细胞内会导致高水平的ATP。

如果加入ATP,则有可能取代对低水平溶解氧的帚要。

活性炭

在培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。

酵母提取物

在培养基中加入醉母提取物能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。

植物激素

生长素类：多数植物诱导胚性愈伤组织需用2.4—D,特别是单子叶植

物。而且胚性细胞发育时还必须及时降低或去掉2,4-Do但低浓度的生长素

是大多数植物诱导体胚发生所必需的。

细胞分裂素类：许多植物体胚发生的诱导必须加入外源生长素和细胞分裂

素，CTK在裸子植物中起着比生长素更重要的作月。

（3）脱落酸：外源ABA可促进枸杞、石刁柏等胚性愈伤组织的形成和体胚

的发生。保持釉稻愈伤组织的胚性结构，并使其绿苗分化率明显提高。

（4）乙烯及多胺：低浓度的乙烯利显著刺激胚胎发生，高浓度则抑制胚胎

发生。

外源多胺或其前体可使人参体胚发生数增加4倍；外源Put使茄子体胚发

生数增加6倍，并伴随内源Put增加，而抑制多胺合成和降解则使体胚发生数

减少。

（5）赤霉素：抑制许多植物胚状体的发生，但对胚状体的进一步发育成熟

及胚的萌发效果很好

5、培养条件

喑培养对体胚发生过程中的胚性愈伤组织的诱导及胚状体的发生、发育和

成熟十分关键。

六、体细胞胚发生过程中的生理生化变化

1、ATP酶活性提高，且早期的胚性细胞中A?P酶反应产物主要沉积于质膜

和液泡膜上，后期ATP酶活性转入细胞内、液泡和细胞核中。

2、在多数植物的SE发生中过氧化物酶（POD；的活性较高，同，酶的种类较

多。在大麦中POD、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的结合应用可以作为SE发生的标

志酶。

3、胚性愈伤组织中的可溶性蛋白质含量远高于非胚性愈伤组织；而非胚性

细胞的游离氨基酸高于胚性细胞。

4、胚性愈伤组织中都存在45KD至55KD的胚胎发生特异性蛋白质的合成。

5、体细胞胚发生与发育过程中，不仅RNA合成速率远高于非胚性愈伤组

织，且RNA种类丰富。随着体细胞胚发育的进程，DNA合成量明显增加，至球

形胚时DNA的合成量达到峰值。

6、内源激素含量的变化

内源TAA含量上升并维持在较高水平是胚性细胞出现的一个共同标志；

在肺发生早期，较高水平的内源CTK对体肺发生似乎是必须或有益的；

内源ABA有利于体胚发育和成熟。

低水平乙烯有利于胚性能力的启动或表达，高水平乙烯抑制体胚发生。

高水平多胺促进体胚发生。

在皇冠草体细胞胚胎发生中，GA3的变化趋势和细胞分裂素基本相同。

七、人工种子

Murashige于1978年在国际园艺植物学术讨论会上首先提出人工种子的概

念。

指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织

（芽、愈伤组织等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适

宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。完整的人工种子包括体胚、人工胚乳和人工

种皮。

Kill。等用聚氯乙烯包裹胡萝卜胚状体于1981年首次制成了人工种子。我

国于1995年首次制成了特种稻的人工种子。我国将其列入国家863计划。经过

20余年的研究，人工种子的研究取得了很大进展，已能在有菌条件下发芽成苗

或用于大田和温室生产。

（一）研制人工种子的意义

1、快速繁殖遗传工程植物、自交不亲合植物、稀有珍贵物种或远缘杂种

等；

2、在人工种子的制作过程中还可加入多种生长调节剂、有益微生物、农

药、除草剂等以提高品种的抗逆境能力;

3、人工种子还具有节约种源、不占用土地，一年四季均可工厂化生产的特

点。

（二）人工种子的研究现状

早期的人工种子研究仅限于胡萝卜、苜蓿、芹菜等模式作物，当时包埋的

材料仅胚状体；

血H前研究范围匚转向水稻、甘薯、棉花等具重要经济价值的粮食作物；

包埋材料除用胚状体外还有胚类似物，即用芽、短技、愈伤组织、花粉

胚。用这类材料包埋的人工种子变异小、萌发率和成苗率高。如以腋芽为材料

进行人工种子研究的作物有烟草和花叶芋，也有用毛状根为培养物制作人工种

子的研窕。

（三）人工种子的包埋

Redenhaugh于1984年首次筛选出透水性好的海藻酸钠作为胚状体和不定

芽的包埋剂。

海藻酸钠（2%〜3.2%,W/V）在室温下为液体。当体细胞胚与藻酸钠混合

以后，再滴入到硝酸钙或氯化钙溶液（100nunol/L）中，30min内表面即可完

全络合，形成一层持久的种皮（图8.4）。此外，在种皮基质中还可加入一些对

体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀

虫剂，以及用于旱地播种的亲水性化合物等，作为人工胚乳。

第九章植物脱毒技术

脱毒的重要性

有许多优良的传统品种，由于长期栽培，尤其是保护地栽培面积不断扩

大，植物周年生长，寄主与病原媒介密度增加，导致病害日益严重。其中以病

毒病最难控制，成为当前生产上的严重问题。

病毒的侵染，抑制植株生长，使形态畸变，产生皱缩、花叶、杂斑、条斑

等多种症状，产量下降，品质变劣。对无性繁殖作物危害更甚，如薯类、大

蒜、生姜、芋头、草莓和花卉等。受病毒侵染的植株，可经无性繁殖滞官传至

下一代。病毒随繁殖代数增加而绵延不绝，日益增殖，结果导致植物种性退

化，甚至使一些珍稀品种濒临绝灭。

植物脱毒技术的历史

第一株植物脱毒苗是1952年由法国人Morel等经过大丽花茎尖组织培养获

得的。1955年他们又获得了马铃薯脱毒苗。20世纪70年代，几乎所有生产马

铃薯的国家都在生产中使用这一技术。

病毒传染的途径

1、非介体传播

通过感病植株本身的有性或无性繁殖材料完成的传染作用。是植物病毒从

感病寄主体通过机械摩擦造成的微伤（称机械汁液传染），或通过感病和无病寄

主体细胞间的有机结合传染的，如带病的鳞茎、块茎、块根、插条、嫁接苗、

种子和花粉等。目前了解到由种子传染的病毒有104种，花粉传染的病毒有10

多种。机械摩擦主要指田间病健株间的相互摩擦，或人为的接触摩擦。

2、介体传播

通过带毒或感染的昆虫或其他生物介体而完成的传染作用。

介体传播主要是昆虫，其次是线虫、蜻类和真菌。介体传毒专化性极强，

一、蝴蝶兰种苗生产概况

蝴蝶兰产业在中国的兴起不过十余年，作为花卉业中的一个新兴类别，蝴

蝶兰一直受到中国花卉市场的喜爱。

目前，欧洲、美国、日本、韩国是世界主要的蝴蝶兰消费市场。仅在2005

年，全球蝴蝶兰消费量已达到1.5亿株，预计到2008年，全球对蝴蝶兰的需求

量将达2.5亿株左右。

全球蝴蝶兰种苗的大幅度增长主要得益于以荷兰为代表的欧洲市场和美国

市场的强劲需求。从2004年起，荷兰市场蝴蝶兰消费量从3500万株上升到

2006年的8000多万株。2007年预计需求在1亿株；在美国蝴蝶兰已全年消费

额接近2亿美元。

2006年，国内蝴蝶兰市场的产量约在4500万株，其中60%左右用于出口，

但主要集中在瓶苗与大、中、小苗。国内消费的蝴蝶兰不到2000万株，相对于

广阔的市场与人口基数，国内蝴蝶兰市场还有很大的拓展空间。

随着世界蝴蝶兰产业向中国转移，中国将成为全球蝴蝶兰的第一大生产基

地。

二、蝴蝶兰病毒病种类和症状

1.病毒种类

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物，因此与兰科其他属植物(6个亚科725属约

25000多个种)具有相同的病毒。

病毒病问题日趋严重世界范围内已报道从各种栽培兰科植物中分离出至少

25种病毒。

Magee(1943)最早记载兰科花卉病毒病。1900年出版的兰科植物图谱上

有类似齿兰环斑病毒的症状。

兰花病毒病分布情况差异极大，但是建兰花叶病毒(Cymbidiummosaic

virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossuoringspotvirus,ORSV)几

乎遍及全世界，所以围绕一些兰科花卉病毒的研究工作最主要集中于建兰花叶

病毒和齿兰环斑病毒。

据报道，目前国内90%蝴蝶兰种苗带有以上两种病毒，台湾生产的种苜有

70%带毒，严重影响到种苗质量。

Feritas-Astua(1999)等从在圣保罗(巴西)商贸农场取得来自17个国家

的1777个样本用PTA-ELISA和电镜检测CyMV,ORSV,CMV,CymRSV,VMV

(vanillamosaic),得出CyMV、ORSV是主要侵染兰花病毒的,而没有一个样本

感染了CMV,CymRSV和VanMVo

郑平等(1999)利用ELISA方法对426个热带兰花品种检测发现了建兰花

叶病毒(CyMV)总感病率为38.0%,齿舌兰属环斑病毒(ORSV)总感病率为

27.7%,其中蝴蝶兰、卡特利亚兰、文心兰两种病毒感病率均较高，石斛兰感

病率较低，对两种病毒具较强的抗性；大花蕙兰易感ORSV,感病率高达

42.8%。

2、主要病毒危害症状:

(1)建兰花叶病毒(CyMV)：

属于马铃薯X病毒属，能使兰科花卉产生褪绿斑点及坏死斑，蝴蝶兰表现

为叶片出现病斑，到开花时，植株出现花朵畸形、花瓣缺、小花簇生于花梗同

一部位等症状。

病症：植株经常产生坏死病症的倾向，如黑色坏死斑点、坏死条纹等。感

病植株除叶部、茎部产生坏死外，花部也会产生坏死，这是CyMV病毒特有的病

症。坏死斑有时只出现于叶片下表面而不发生于上表面，也会产生黄绿斑驳的

嵌纹或黄化条斑形病症。另外也有部分兰花种类感染后并不表现任何可辨认症

状。

病毒特性及传播方式：

CyMV在细胞外的稳定性虽然不及烟草花叶属(TMV)的病毒，但也是已知

病毒中性质极为稳定的一属。其颗粒体稍可弯曲，长度约为450nm,细胞外耐

热温度为60c至70℃,在室温条件下可存活25天。

目前尚未发现可以传播CyMV的媒介昆虫，其传播途径由机械性伤口入侵及

感染。

(2)齿兰环斑病毒(0RSV)：

属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),主要危害齿兰、建兰、蝴蝶兰等。兰科

花卉一旦感染ORSV,其叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，病株花部甚

至出现畸形或褪色斑，红色系花朵褪色斑尤为明显。

可以感染ORSV的兰花种类超过20个属以上。不同的兰属或兰种所产生的

病症会有所差异。蝴蝶兰、文心兰、卡特兰等易被齿舌兰环斑病毒感染，尤其

是蝴蝶兰。

齿兰环斑病毒最早在文献上记载的病症是环斑，另外花叶、斑纹、黄化条

纹、花色条斑等。在这些病症中以花叶与斑纹最为常见。CyMV和ORSV复合感

染同一兰株的现象极为普遍，病症会远比单一病毒感染时严重许多。

可以感染ORSV的兰花种类超过20个属以上。不同的兰属或兰种所产生的

病症会有所差异。蝴蝶兰、文心兰、卡特兰等易被齿舌兰环斑病毒感染，尤其

是蝴蝶兰。

病毒特性及传播方式：

0RSV为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的一种。颗粒体为短硬杆状，长

度约300nm。该属病毒的共同特性是性质极其稳定，在寄主细胞外耐热性强，

在高达95℃的温度下，仍可存活相当时日。本病毒主要由机械性伤口入侵植物

体内，在组织培养或温室栽培管理过程中，所有可能造成表面伤口的操作，包

括切花梗、修剪，甚至植株叶片间的磨擦，都可能成为病毒入侵感染的途径。

尚未证实齿舌兰环斑病毒可被任何专一性的媒介昆虫传播。

(3)黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)

最早有关CMV感染兰花的记录是在蝴蝶兰上发现的。所记载的病症是植株

叶片上出现与叶脉平行的黄化条纹。CMV病毒也可使红花品系蝴蝶兰的花瓣产

生褪色或条纹病症。此外，文心兰中也发现有CMV感染的情况。叶片呈现不明

显的斑纹病症，隐约可见与叶脉平行的黄色条纹，但是该植株大小与正常的植

株大小无差别。

病毒特性及传播方式：

CMV属黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的一种。颗粒体为球形颗粒体，直

径28nm。此病毒的寄主范围极为广泛，可以感染85科365属高达800种以上

的植物。我国许多地区的大部分重要经济作物均有CMV感染的记录，其族群在

田间分布极为普遍。此病毒可以由机械磨擦所致的伤口传染。在田间主要由射

虫以非永续型方式媒介传播，由于可以传播CMV的蝇虫种类众多，所以病毒分

布十分广泛。

四、病毒脱除技术

1.脱毒技术概况

兰科花卉长期无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒

病，并导致种性退化。

Morel（I960）首次成功获得兰花的脱毒快繁以来，脱毒快繁技术在蝴蝶

兰、卡特丽亚兰、石斛兰等热带兰花中都有深入研究，并带动了兰花产业的迅

速发展。

植物脱毒的方法主要有茎尖分生组织培养脱毒、热处理和茎尖分生组织培

养相结合脱毒、病毒抑制剂与分生组织培养相结合脱毒、微嫁接等几种方法。

2、常用脱毒方法

（1）茎尖分生组织培养：

主要原理是病毒在植物体内的分布不均匀，在茎尖部位带病毒少或不带病

毒，因此可以通过茎尖培养脱毒。主要应用于各种无性繁殖植物。

Nimi,Y.Inohara,M.（1986）切取感染病毒的Cymbidium顶端分生组织在适

合的培养基上培养，获得了94%的无毒苗。

朱根发等（1997）将文心兰茎尖生长锥在MS+NAAO.1mg/L+6-BAO.5mg/L培

养基上培养脱除了烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、建兰花叶病毒和齿兰环斑病

毒。

影响脱毒效果的因素：

A.茎尖分生组织的大小：越小脱毒越彻底，但培养越困难；通常为0.1〜

0.5nlm才能脱除病毒。

B.培养条件：培养基营养、生长调节剂种类和浓度、有机附加物、P1L

C.环境条件：培养温度、光照和黑暗条件。

（2）热处理结合茎尖分生组织培养

热处理后进行茎尖分生组织培养。

（3）分生组织培养结合病毒抑制剂

抑制植物病毒的活性化学物质包括代谢拮抗物质、植物生长调节物质等。

在兰科花卉报道的病毒抑制剂主要是病毒哇（利巴韦林），是一种核昔类

似物，病毒弹对病毒的复制有一定专一的抑制作用，对RNA病毒、DNA病毒皆

表现出较好的制作用，因此是一种广谱的病毒抑制剂。有学者认为病毒哇的主

要抗病毒作用机制是在RNA病毒基因组上的致死诱变。

Hsieh,R.M.(2003)等以病毒剂为基础除去感染了蝴蝶兰原球茎CyMV和

0RSV病毒，然后将再生出来的无毒植株在温室中培养，数据表明当长大后66%

一99%的植株仍保持无毒状态。

通过茎尖培养结合病毒陛连续处理获得了CymbidiumSw的无毒苗

(A.Toussaint,1993)、CymbidiumAyakoTanaka<Hinodezuru,

(Freitas-Astua,1998)

Loi,J.S等(1991)通过将DendrobiumSon:a的茎尖组织和愈伤组织分别

接种在含三氮晚核昔5-15mg/L,或10-40mg/L的培养基上都成功地脱去感染

的CyMV或ORSV病毒。

姜玲(2005)等通过墨兰原球茎顶端分生组织结合三氮晚核昔的处理脱除

了CyMVo

Inouye,N.(1983)将感染了ORSV病毒的Cymbidium的原球茎顶端分生组

织浸泡在ORSV抗血清(tire1:2048)2h到1天，经过培养获得了52.9%的无

毒苗。

(4)微嫁接脱毒

剥离的茎尖分生组织嫁接培养也可以获得脱毒苗。

(5)转基因技术后获得抗病毒植株

通过转CymMV病毒外壳蛋白CP基因可以获徨抗病毒植株，国外己有相关报

道。

三、病毒检测方法

1.形态鉴定：

通过症状表现直接鉴定，简单但只有到后期才能观察到症状，准确性差。

2、指示植物鉴定法：

利用特定的易于感染某些病毒的指示植物(览色藜、千日红)的特征进行病

毒鉴定。

3、酶联免疫吸附测定(ELISA)

最早进行病毒检测是利用抗血清法，利用抗原和抗体的特异性反应原理进

行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鉴定未知病毒。

1971年逐渐在此基础上发展出酶联免疫法（EnzymeLinked

ImmunosorbentAssay,ELISA）,应用越来越广泛，方法是将抗原固定在支持

物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，

使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。

ELISA是一种免疫测定（immunoassay,TA）

基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物

后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，

由此进行定性或定量分析。

EL1SA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必

要的试剂：

（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）；

（2）酶标记的抗原或抗体，称为〃结合物"（conjugate）；

（3）酶反应的底物。

EL1SA中有三个必要的试剂：

免疫吸附剂、结合物、酶的底物。

A已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

B酶标记的抗原或抗体（结合物）；

C酶的底物：

D阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；

E结合物及标本的稀释液；

F洗涤液；

G酶反应终止液

E