2.2.1+动物细胞培养课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2章

细胞工程第2节动物物细胞工程11907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子获能现象。1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核实验，同期，我国科学家童第周开展了

鱼类细胞核移植工作。1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术。1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育了小鼠。2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。动物细胞工程重要技术时间节点1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生。1975年，米尔斯坦（C.Milstein，1927—2002）和科勒（G.Köhler，1946—1995）等创立了单克隆抗体技术。1958年，格登（J.Gurdon，1933—）用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，成功培育出性成熟个体。同一时期，我国科学家童第周（1902—1979）等开展了鱼类细胞核移植工作。1951年，张明觉（1908-1991）等发现了哺乳动物精子的获能现象。1907年，哈里森（R.G.Harrison，1870—1959）用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。1890年，希普（W.Heape，1855—1929）将安哥拉兔的胚胎移入比利时兔的输卵管内，得到了两只安哥拉兔，这是世界上胚胎移植成功的首例。动物细胞工程的发展历程1951195918901907197519782014年世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生。2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。2006年，山中伸弥（S.Yamanaka，1962）等获得了诱导多能干细胞。我国科学家用这种细胞培育出了小鼠。1996年，世界上第一只体细胞克隆羊多莉在英国诞生。随后多种克隆动物相继问世。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941—）等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞。1978年，小鼠的桑葚胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊。动物细胞工程的发展历程199620061978198120142017小面积烧伤：植皮(自身)后恢复大面积烧伤？自体移植在治疗大面积烧伤时，通常采用的办法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。【从社会中来】但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？科学家通过动物细胞培养构建了人造皮肤皮肤烧伤2.2动物细胞工程动物细胞工程动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞工程的基础人造皮肤克隆猴：中中和华华单克隆抗体一动物细胞培养1.动物细胞培养概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。原理地位对象目的细胞有丝分裂动物细胞工程的基础胚胎或幼龄动物的细胞获得细胞或者细胞产物动物细胞培养体现细胞全能性？一动物细胞培养1.快速繁殖知识回顾：选择性必修一第1章第1节一动物细胞培养1.快速繁殖（1）营养培养皿培养瓶水、糖类（葡萄糖）、氨基酸、无机盐、维生素……已知成分:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。称为合成培养基。未知成分：使用合成培养基时，通常需加入血清等一些天然成分。血清中含有人类尚未全部研究清楚、细胞生长和增殖所必需的物质。注意：培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。一动物细胞培养1.快速繁殖（2）无菌、无毒的环境无菌①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作定期更换培养液无毒定期更换培养液的目的是什么？如何防止培养过程中的微生物污染？目的：1、补充营养；2、清除代谢废物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害一动物细胞培养1.快速繁殖（3）适宜的温度、pH和渗透压温度：哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。渗透压：维持细胞正常的形态和功能。（4）气体环境通常采用培养皿或松盖培养瓶。并将它们置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。

O2：细胞代谢所必需的。CO2：主要作用是维持培养液的pH。糖类、氨基酸、无机盐、维生素等动物血清：含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质。

将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基。动物细胞培养常用培养液。合成培养基（一）动物细胞培养的条件温顾思考1:为什么培养液需要定期更换？

____________________________________________思考2:如何防止培养过程中的微生物污染？

____________________________________________培养液所有培养用具灭菌无菌环境定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害在细胞培养液中添加一定量的抗生素（5）动物细胞培养的条件②其他条件脉动真空灭菌器A.无菌、无毒的环境对_____和__________进行_____处理在________下进行操作还需要____________维持适宜渗透压的目的______________________36.5±0.5℃7.2-7.4维持细胞正常的形态和功能（5）动物细胞培养的条件②其他条件CO2培养箱B.温度、pH和渗透压哺乳动物细胞培养的温度多以____________为宜适宜的温度多数动物细胞生存的适宜pH为________适宜的pH适宜的渗透压含有___________和__________的混合气体的__________动物细胞培养所需气体主要有___和____O2：_____________________CO2：_________________________通常采用_______或____________O2CO2O2是细胞代谢所必需的CO2的主要作用维持培养液的pH培养皿松盖培养瓶95%空气5%CO2CO2培养箱CO2培养箱（5）动物细胞培养的条件②其他条件C.气体环境组成培养容器培养仪器加抗生素无菌操作95%空气+5%O2的CO2培养箱定期更换培养液细胞代谢所必需维持培养液的pH值无毒无菌CO2O2温度pH36.5±0.5℃7.2~7.4一动物细胞培养1.快速繁殖教材P44-45体外细胞培养的类型有哪些？动物细胞培养取材时，为什么取动物胚胎或幼龄动物的组织、器官？培养前，为什么要将组织分散成单个细胞？怎样将组织分散成单个细胞？处理时有什么注意事项？细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是为什么？怎样解决这一问题？3.动物细胞培养过程：细胞贴壁接触抑制原代培养传代培养2.培养过程中出现的名词：细胞的接触抑制（1）细胞贴壁—悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；（2）接触抑制—

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。原代培养——初次培养传代培养——分瓶后的培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞分化程度低，增殖能力强去掉组织间蛋白出现接触抑制1.培养过程：（二）动物细胞培养的过程大多讨论1：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养）①机械法②用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间为什么用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理？这里中酶作用是什么？由此说明细胞间的物质是什么成份？用酶制备单细胞悬液不会把所培养的细胞消化掉吗？取动物组织块分散成单个细胞剪碎胰蛋白酶处理制成细胞悬液加培养液原代培养传代培养（分瓶培养）1.动物细胞培养一.动物细胞工程动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质(胶原蛋白等)。长时间处理会消化细胞膜蛋白，当然会损伤细胞，所以必须控制好时间！例3.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此不能推测出来的是()A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系B.胰蛋白酶可能会对动物细胞造成损伤C.处理时一定要注意处理时间、加酶量D.换用胃蛋白酶也能起到相同的作用D1.动物细胞培养的过程①从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；②能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换不可以；胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。可以用胃蛋白酶处理吗？为什么？为什么要将组织分散成单个细胞？取动物组织块分散成单个细胞剪碎胰蛋白酶处理制成细胞悬液加培养液原代培养传代培养（分瓶培养）原代培养①悬浮生长类：能够悬浮在培养液中生长增殖，会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。②贴壁生长类：大多数需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁）；除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制。由于细胞之间有接触抑制的特性，一般的正常细胞并不重叠干其他细胞之上生长，而是单层生长。癌细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，发生堆积。是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。取动物组织块分散成单个细胞剪碎胰蛋白酶处理制成细胞悬液加培养液原代培养传代培养（分瓶培养）1.动物细胞培养一.动物细胞工程（6）动物细胞培养的过程圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）先收集细胞，制成细胞悬液，再分瓶培养a.悬浮生长类：直接用离心法收集。b.贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。取动物组织块分散成单个细胞剪碎胰蛋白酶制成细胞悬液加培养液原代培养传代培养（分瓶培养）1.动物细胞培养一.动物细胞工程（6）动物细胞培养的过程传代培养：通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。动物细胞培养的过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶、胶原蛋白酶10代细胞50代细胞无限传代单个细胞加培养液回顾植物组织培养和动物细胞培养流程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体脱分化再分化接种至培养基动物细胞培养植物组织培养比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的相同点讨论2：植物组织培养和动物细胞培养的比较获得细胞或细胞产物常用固体培养基植物体葡萄糖、动物血清常用液体培养基细胞增殖细胞的全能性许多细胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件1.动物细胞培养一.动物细胞工程（6）动物细胞培养的过程讨论：动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。1.动物细胞培养一.动物细胞工程（6）动物细胞培养的过程有关动物细胞培养的问题例1.下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别()A.动物细胞培养所用的培养基的成分与植物的不同B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C.动物细胞培养过程中可发生基因重组，而植物组织培养不能D.植物组织培养和动物细胞培养都体现了细胞的全能性A资料：动物细胞生长特性细胞贴壁（3）原代培养把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。（4）传代培养

当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内的过程。（5）细胞株从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。（6）细胞系传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。细胞悬浮液细胞株10代细胞50代细胞细胞系无限传代原代培养传代培养遗传物质改变原代培养、传代培养、细胞株、细胞系四者之间的关系：注意三干细胞的培养及应用知识回顾：必修一第六章第2节三干细胞的培养及应用三干细胞的培养及应用动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。存在于早期胚胎、骨髓和脐带血。1.概念受精卵原始胚胎干细胞囊胚胎儿成人胚胎干细胞成体干细胞三干细胞的培养及应用2.分类胚胎干细胞（ES细胞）存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。桑葚胚三干细胞的培养及应用实例局限性分布特点胚胎干细胞（ES细胞）早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；限制了在医学上应用。需要分化诱导因子诱导在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约1500倍）全能干细胞三干细胞的培养及应用实例运用实例分布特点②成体干细胞造血干细胞是发现最早、研究最多的、应用最成熟的一类成体组织或器官内具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。①造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）②神经干细胞（神经系统中）③精原干细胞（睾丸中）治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。造血干细胞→神经干细胞→多能干细胞专能干细胞三干细胞的培养及应用③iPS细胞通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。病人各种类型细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物成纤维细胞T细胞B细胞iPS细胞分化取出移植三干细胞的培养及应用运用获取方法优点③iPS细胞a.诱导过程无须破坏胚胎b.iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。a.将特定基因或特定蛋白导入细胞b.用小分子化合物诱导形成。a.可治疗镰状细胞贫血症b.治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域研究取得了新进展三干细胞的培养及应用干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险。应用展望：3.面临的问题及展望电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约1500倍）2.干细胞培养及其应用（1）干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。一.动物细胞工程干细胞存在于___________、_________和__________等多种组织和器官中早期胚胎骨髓脐带血2.干细胞培养及其应用（1）干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。①胚胎干细胞②成体干细胞干细胞①胚胎干细胞（ES细胞）存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。特点：体积小，细胞核大、核仁明显。取自早期胚胎。也叫做全能干细胞。一.动物细胞工程②成体干细胞：存在于成体组织或器官内中。A.造血干细胞：存在于骨髓、脐带血、外周血，可分化成各种血细

胞和免疫细胞。也叫做多能干细胞。B.神经干细胞：取自神经系统，可分化成神经细胞。C.精原干细胞：取自睾丸，可分化成无数的精子。专能干细胞一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。2.干细胞培养及其应用一.动物细胞工程（1）干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。(2)iPS细胞(诱导多能干细胞)的培养和应用将特定基因或特定蛋白导入细胞用小分子化合物诱导形成①获取方法：iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。②诱导多能干细胞优点：A.诱导过程无需破坏胚胎。B.iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。2.干细胞培养及其应用一.动物细胞工程类型应用造血干细胞神经干细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）(3)干细胞的应用有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展干细胞应用面临的问题存在存在着导致肿瘤发生的风险。2.干细胞培养及其应用一.动物细胞工程诱导多能干细胞（iPS细胞）多种体细胞iPS细胞用于治疗人类疾病示意图定向诱导分化体外诱导小鼠成纤维细胞临床治疗人类疾病如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等(3)干细胞的应用2.干细胞培养及其应用一.动物细胞工程1.干细胞：存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。包括胚胎干细胞和成体干细胞等。2.胚胎干细胞：简称ES细胞，存在于早期胚胎中，具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。（1）造血干细胞存在于骨髓、脐带血、外周血，可分化成各种血细胞和免疫细胞全能干细胞多能干细胞（2）神经干细胞

取自神经系统，可分化成神经细胞(3)精原干细胞专能干细胞（三）干细胞培养及其应用3.成体干细胞4.iPS细胞的培养和应用iPS细胞（诱导多能干细胞）将特定基因或特定蛋白导入细胞用小分子化合物诱导形成获取方法移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化分化病人胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞iPS细胞用于治疗人类疾病示意图例2.某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，若后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的()A.用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性B.用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病C.如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术D.如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物C(2)培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和

动物血清

等。当细胞分裂生长到

相互接触

时，就会停止增殖，需用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为

传代培养

。(3)有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触抑制机制的制约而表现为“疯长”，这类细胞最可能是

癌细胞

。例4.左图为动物细胞培