纳米ZnOSDBS复合污染体系对小球藻生长的影响

第一章绪论

进入21世纪，随着科技的进步，纳米材料越来越多的被使用。大量的研究表明，纳米材料作为一种新型材料，对水生生物具有潜在的生态风险。从2004年开始，研究人员开始关注纳米材料的毒性效应。表面活性剂往往作为稳定剂、分散剂和模板剂在纳米材料的生产过程中加入。因此评价纳米材料的生物毒性需要考虑表面活性剂的影响，而纳米材料与表面活性剂复合污染体系对藻类的生物效应需要进一步研究。1.1纳米材料污染的内涵1.1.1纳米材料的性质和分类纳米材料是指在纳米尺度（1-100nm）的三维空间中具有至少一维处于纳米尺寸的材料或由它们作为基本单元组成的材料[1]。纳米复合材料大致可分为四大类：纳米粉体、纳米纤维、纳米薄膜和纳米块体。其中，纳米粉体发展时间最长，技术最成熟，是生产其他三种纳米复合材料的基础。纳米材料与大部分传统固体材料不同，它具有一些特殊性质。形成这些特性的原因有许多，如结构的特殊性、热力学不稳定性等。纳米复合材料的特性主要表现为以下四个方面[2-3]：表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。纳米材料因其一系列特性而得到广泛的应用。几乎涵盖了生活的方方面面[4-7]。表1.1列举了一些纳米材料的应用领域和特性。

表1.1纳米材料的应用Table1.1Applicationofnanomaterials应用领域纳米材料材料特性催化剂Cu-Zn合金、Ag、Pd催化效率高，选择性好护肤品ZnO、TiO2紫外光的反射与可见光的透射医学SiO2、Fe2O3、Au定向性好，副作用小传感器NiO、ZnO、FeO、CoO高灵敏度电磁学Fe、Co、Ni强磁性和高性价比光电场ZnO、SiO2、Al2O3高传导性，透光性好，选择吸收好环境保护ZnO、TiO2、Al2O3催化性能，灭菌涂层ZnO、SnO2、TiO2、SiO2防紫外线、抗老化、隔热能量ZnO、TiO2、Ag2O光电转换特性

1.1.2纳米污染自2000年以来，纳米材料广泛应用于生产生活等领域，但纳米材料的污染问题使越来越多的人对这种新的技术产生了担忧。它可能对社会、人和动物产生严重影响。纳米材料由于体积小，很容易被生物吸收。我们将吸入被纳米材料污染的空气，食用在纳米材料污染环境中生长的粮食作物和动物。纳米颗粒（粒径小于100纳米的颗粒）已被广泛应用于各种生活用品当中，以提高产品的生产效率或耐用性。它主要包括防晒霜、防污服、高尔夫球甚至美容产品。但是，这些产品对人类健康和环境的影响在很大程度上是未知的。任何事物的发展都有两面性，纳米材料的应用研究也有两面性，一纳米是一米的十亿分之一，这与足球与地球的比值相当。当颗粒粒径小到纳米级，其物理化学性质可能发生改变，其微小的粒径使其可以更容易生物体内。在2003年4月，科学家首次发表了一篇关于纳米材料生物毒性的文章[8]，将纳米材料的生物安全问题提上了生物学的议事日程。现在我们需要解决的问题是，原来的无毒化学品在到达纳米级可能产生毒性，关于化学物质的尺度、形态对其毒性的影响，纳米材料与其他物质的相互作用以及纳米颗粒在外界环境中暴露于环境中可能存在的安全风险，如温度、光照、pH值等方面的研究很少，基本上处于空白状态。随着纳米产品的升级换代，人们越来越关注纳米材料引起的环境安全问题的研究。其中，化肥、农药等与农业密切相关的化工产品更多的被关注。纳米复合材料可以提高产品的性能，帮助产品升级功能结构。然而，如果纳米颗粒直接暴露在自然环境中，极有可能会对环境产生未知的危害。1.2纳米材料的环境行为与生物效应1.2.1纳米材料的生物效应纳米颗粒的作用与其特殊结构和性质有关。纳米材料的毒性与其特性密切相关。首先，由于纳米颗粒纳米级的粒径使其拥有很大的比表面积，因此大部分的原子都位于粒子表面，而表面的原子因为存在大量悬浮键而具有较高的能量和化学反应活性。一旦纳米颗粒进入生物体，首先会通过血液的流动进入循环系统，然后通过循环系统进入组织液、淋巴液等。纳米材料通过循环系统进入器官或组织中并累积。纳米复合材料的尺寸都比较微小，比如10nm左右的纳米颗粒与蛋白质分子的大小差不多，因此我们自身的保护性生态屏障，比如脑屏障和眼屏障，在膜通道的尺寸上已经不能对其进行一定程度上的限制。纳米颗粒很可能在这些地方聚集并对生物体产生破坏作用，这在关于C60的研究中得以体现[9]。进入生物体循环系统的纳米颗粒可以通过与细胞膜上的载体蛋白或者其他受体结合，从而使结构蛋白变性，在分子水平上引起细胞功能损伤。这种情况对生物体造成更严重的影响。一方面，它可以直接影响生物代谢酶的正常运转。另一方面，它还可以通过氧化还原产生有害的自由基团，破坏细胞的正常结构和代谢系统的正常功能。当纳米颗粒粘附在藻细胞表面，会增加藻细胞附近其他污染物的富集，从而加强污染物的毒性作用[10-11]。同时，纳米材料作为其他化学物质的载体，还可以与附着体发生物理化学反应，削弱或增强它们之间的联合毒性效应[12]。1.2.2纳米材料的生物效应研究Oberdoster、Renwick、Rahman和Zhang[13-15]研究了TiO2纳米颗粒对肺巨噬细胞代谢的影响。实验结果表明，TiO2纳米颗粒的尺寸越小，肺巨噬细胞就越难将其从肺部清除出去，完全清除时间也就越长。

2004年4月，美国化学学会（AmericanChemicalSociety）报告说，C60可能会对鱼类大脑造成损伤[16]，这是纳米颗粒可能对水生物种产生毒性作用的第一个证据。纽约罗切斯特大学的研究人员发现[17]，将老鼠暴露在含有直径20nm特氟隆塑料（聚四氟乙烯）颗粒的空气中15min，大多数老鼠在4h内死亡，而暴露于直径为120nm颗粒几个小时的对照组却没有任何影响世界卫生组织根据对现有实验数据的分析发现[18]，周围空气中10μm颗粒物每增加50μg/m3，住院人数增加3%～8%；周围空气中2.5μm颗粒物每增加50μg/m3，死亡率增加6%～9%；周围空气中10μm颗粒物每增加100μg/m3，死亡率增加12%～19%，周围空气中2.5μm颗粒物每增加100μg/m3，死亡率增加12%~19%。结果表明，颗粒物的粒径越小，浓度越高对人体的危害越大。王静等用健康雄性Wistar大鼠实验结果发现[19]，将健康雄性Wistar大鼠暴露在纳米SiO2和微米SiO2环境中，纳米SiO2染尘组支气管肺泡灌洗液(BALF)中碱性磷酸酶(AKP)活力和乳酸脱氢酶(LDH)活力明显高于微米SiO2染尘组。赵玉良等人发现[20]，碳纳米管能轻易的进入细胞并破坏其结构。在低浓度（2.0μg/ml）时，碳纳米管的进入会增强嗜巨粒细胞的吞噬能力，而在高浓度（20μg/ml）时，会严重破坏嗜巨粒细胞的细胞结构，从而减弱其对外源性毒素的吞噬功能。1.2.3纳米材料的环境行为纳米技术的快速发展和纳米材料的在各个领域广泛应用，使得纳米颗粒通过水（废水的直接排放）、土壤（直接排放和径流以及剩余污泥）和空气（直接焚烧纳米产品）快速注入自然环境。纳米颗粒进入土环境和水环境后，首先发生迁移布朗扩散。随着迁移距离的增加，有机会与其他物质接触以增加潜在的伤害。当水和土壤资源环境中的溶液化学条件有利于提高纳米粒子与其他颗粒或固体颗粒的吸附时，纳米粒子将紧密地吸附并沉积在固体颗粒的表面，导致保留。相反的，当溶液条件不利于化学反应时，纳米粒子将继续迁移吸附作用纳米粒子的聚集将直接导致其尺寸和表面性质的变化，从而降低了迁移速度和距离，纳米颗粒会在迁移过程中与其他物质聚集在一起。环境聚合沉积是纳米颗粒在自然界中迁移的主要过程。最重要的是，纳米粒子本身具有巨大的表面积，与其他物质吸附；自然环境的第二种化学条件，纳米粒子的聚集改变了电位特性物质纳米颗粒在水土资源中的聚集和沉积，可以有效地降低纳米胶体的迁移和学习能力，进而降低其对自然生态环境的潜在危害。生态系统中最容易受到污染的是水环境。通过废水排放、地表径流或大气沉积等方式，纳米颗粒最终汇聚到河流、湖泊和海洋，对水生生态系统产生不良影响。Wei等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2010</Year><RecNum>2203</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[19]</style></DisplayText><record><rec-number>2203</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2ap2xtre0w9zdqex095x29e4d5wx59fzeree"timestamp="1523278996">2203</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Liping</author><author>Thakkar,Megha</author><author>Chen,Yuhong</author><author>Ntim,SusanaAddo</author><author>Mitra,Somenath</author><author>Zhang,Xueyan</author></authors></contributors><titles><title>Cytotoxicityeffectsofwaterdispersibleoxidizedmultiwalledcarbonnanotubesonmarinealga,Dunaliellatertiolecta</title><secondary-title>AquaticToxicology</secondary-title></titles><periodical><full-title>AquaticToxicology</full-title></periodical><pages>194-201</pages><volume>100</volume><number>2</number><dates><year>2010</year></dates><isbn>0166-445X</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[21]发现碳纳米管可以抑制杜氏藻的生长，并且会对其藻细胞内谷胱甘肽氧化还原状态以及光化学过程产生影响。Dale等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dale</Author><Year>2013</Year><RecNum>224</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[20]</style></DisplayText><record><rec-number>224</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e5efdwp52wsvxmefa5xxr59rfw2a0tv5v0ez">224</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dale,AmyL.</author><author>Lowry,GregoryV.</author><author>Casman,ElizabethA.</author></authors></contributors><titles><title>ModelingNanosilverTransformationsinFreshwaterSediments</title><secondary-title>EnvironmentalScience&Technology</secondary-title></titles><periodical><full-title>EnvironSciTechnol</full-title><abbr-1>Environmentalscience&technology</abbr-1></periodical><pages>12920</pages><volume>47</volume><number>22</number><dates><year>2013</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[22]发现水环境富营养化程度会影响Ag+的释放，富营养化会削弱Ag+的释放，降低水的营养能促进Ag+的释放。Dale等ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Aruoja</Author><Year>2009</Year><RecNum>131</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[21]</style></DisplayText><record><rec-number>131</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2ap2xtre0w9zdqex095x29e4d5wx59fzeree"timestamp="1487552783">131</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Aruoja,V.</author><author>Dubourguier,H.C.</author><author>Kasemets,K.</author><author>Kahru,A.</author></authors></contributors><auth-address>LaboratoryofMolecularGenetics,NationalInstituteofChemicalPhysicsandBiophysics,Akadeemiatee23,Tallinn12618,Estonia.</auth-address><titles><title>ToxicityofnanoparticlesofCuO,ZnOandTiO2tomicroalgaePseudokirchneriellasubcapitata</title><secondary-title>SciTotalEnviron</secondary-title></titles><periodical><full-title>SciTotalEnviron</full-title></periodical><pages>1461-8</pages><volume>407</volume><number>4</number><keywords><keyword>Chlorophyta/*drugeffects/growth&development</keyword><keyword>Copper/pharmacokinetics/*toxicity</keyword><keyword>Escherichiacoli/metabolism</keyword><keyword>MetalNanoparticles/*toxicity</keyword><keyword>Saccharomycescerevisiae/metabolism</keyword><keyword>Titanium/*toxicity</keyword><keyword>ZincOxide/*toxicity</keyword></keywords><dates><year>2009</year><pub-dates><date>Feb01</date></pub-dates></dates><isbn>0048-9697(Print) 0048-9697(Linking)</isbn><accession-num>19038417</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/19038417</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/j.scitotenv.2008.10.053</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[23]发现纳米ZnO对藻类产生严重的影响，在一定浓度下，藻类光合作用明显减弱。纳米材料本身的迁移可能直接威胁到水和土壤的环境安全。携带其他污染物进行深度迁移，从而扩大污染范围。重金属污染是我国农田土壤问题研究的主要污染物之一，重金属污染超标率已达19.4%。由于土壤对重金属的吸附亲和力强，一般认为重金属在土壤中迁移缓慢，在土壤中几乎不迁移[24]。但是,土壤中的重金属一定条件下会向地下迁移，从而污染地下水，直接影响身体健康。所以重金属在土壤中的迁移不能被忽略[25]。在近年来，人们发现重金属胶体可以作为载体显著提高重金属在土壤中的迁移率，并得到了广泛的认可[26]。也有很多土壤胶体的移动，从而使它出现固体土壤溶液-液两相转换成固体-液体-胶体三相中具有对重金属离子[27]的迁移三相胶体易化作用。胶体对重金属有机污染物迁移的研究过程主要包括胶体的释放，胶体对重金属污染物的吸附及释放后胶体的迁移[28]。1.3表面活性剂的环境行为和生物效应1.3.1表面活性剂的性能及应用表面活性剂是一种具有固定亲水性和亲油性基团的物质。凡加入少量而能显著降低液体表面张力的物质，统称为表面活性剂[29]。根据溶液中分子和极性基团的性质，表面活性剂可分为离子型和非离子型。根据离子所带的电荷不同可分为阳离子型、阴离子型和两性型，具体特性和应用可见表1.2：表1.2表面活性剂的类型、特性和应用类型特征性质和用途阳离子型具有正亲水性碱，如季铵卤化物（R4N+X）它能在水中形成疏水性阳离子，广泛用作杀菌剂和消毒剂。它吸附性强，能在表面形成亲油膜。阴离子型它有一个带负电荷的亲水基团，例如磺酸盐（RSO3-M+）、硫酸盐（ROSO3-M+）。水溶液中可形成疏水性阴离子，具有良好的去污、起泡、分散、乳化、润湿等性能，表面活性剂的产率居首位。非离子型亲水基团不带电荷，但水溶性可以从极性很强的基团（如聚氧乙烯、糖或类似基团）获得。它具有高稳定性、高表面活性、良好的耐水性和低发泡性。两性型分子在主链上有或可能有负电荷和正电荷，如磺基甜菜碱。在酸性溶液中是阳离子的，在中性溶液中是非离子的洗澡。在印染行业，主要用作织物柔软剂、渗透剂和清洁剂。亲水性和基本类型以及阳离子的使用特点，带正电的季铵盐（R4N+X-）能在水中生成疏水性阳离子，广泛用作杀菌剂消毒剂。它具有很强的吸附力，能在一个表面形成亲油膜表面阴离子型具有带负电的亲水基团，如磺酸盐（（RSO3-M+）、硫酸盐（ROSO3-M+）。水能产生疏水性阴离子，具有良好的去污性，作为第一表面活性剂起泡，分散、乳化、润湿特性、生产非离子帐户亲水性基团没有单一电荷，但我们可以从高极性基团出发，得到水溶性基团，如聚氧乙烯、糖或类似物组。没有在水中解离，电解液的pH值不易受高稳定性、高表面活性、高硬度和低泡沫，两性分子在主链上有或可能产生一个重要的部分负电荷和一个单位正电荷，例如磺基苯醚阳离子在酸性溶液中，中性非离子巴斯，它主要用于印染行业的织物柔软剂、渗透剂和清洁剂。1.3.2表面活性剂的环境行为作为化工领域的重要原料，表面活性剂有“工业味精”之称，使用范围不断扩大，需求也越来越大。但在生产过程中，会产生大量含有表面活性剂的废水，这些废水不可避免地有部分会进入到水环境和土壤环境中，让环境污染等环境问题越来越严重。表面活性剂吸附在土壤上会显著改变土壤的的理化性质，土壤胶体是表面活性剂在土壤表面的热力学不稳定分散体，有效的离子强度会受到影响。土壤胶体大多带负电荷，加入阴离子材料表面活性剂后，胶体间的斥力随表面电位的增大而增大；加入阳离子表面活性剂后，情况正好相反，土壤物化性质的变化将直接影响土壤中化合物的环境行为。当水体中的表面活性剂浓度达到1mg/L时，会形成泡沫隔离层，将水体和空气隔离开，并导致水产生臭味。当表面活性剂在水体中的浓度超过CMC后，将使溶解度较低的污染物在水中的溶解度升高，这种增溶作用会间接造成环境污染，改变水体性质。此外，当污水处理厂的入水中含有一定表面活性剂时，会对曝气、沉降和污泥的硝化工艺产生影响，使饮用水具有不好的味道和气味。表面活性剂不仅会直接影响水生生态环境，杀死水环境中的微生物，抑制其它有毒化学物质的降解，同时还会导致水中溶解氧的减少。1.3.3.表面活性剂的生物效应表面活性剂的毒性作用与其浓度有关。李祥英[30]研究发现十二烷基二甲基苄基氯化铵(简称1227)及双八、十烷基季铵盐（简称C8-10）季铵盐等两种阳离子表面活性剂能抑制大型溞的胚胎孵化，以及对胚胎发育后期有致畸作用。表面活性剂污染对植物的影响，是一种保护性酶起主导作用的，通过增加细胞通透性和其他方式来保护植物组织，但该植物木质化程度降低，机体在逆境中损坏。人们通过纳米材料对水中生物的影响认识到纳米材料的危害。Tamm等报道了表面活性剂单体可插入生物膜结构，并考察了结合速率常数与疏水长链间的关联[31]。插入生物膜的分子可以显著地改变前者的侧向流动性、刚性、主转变温度等性质[32-34]。但变化的方向与程度由磷脂膜与表面活性剂的组分共同决定[33]。1.4复合污染体系的联合毒性效应1.4.1复合污染体系的联合毒性效应Macbical[35]于1985年在对污染生态效应的研究中，釆用了“复合毒性效应（Combinedtoxiceffect）和联合毒性效应（Jointtoxiceffect）”的概念和术语。复合污染体系的联合毒性作用一般可以分为相加作用、协同作用、增强作用、拮抗作用、独立作用等五种类型[36]。1.4.2联合毒性效应的机理及影响因素多种污染物对生物体的联合毒性机理主要有以下几点：一种新的污染物的加入改变了原有污染物与细胞膜表面的结合点位、影响与原有污染物有关酶的活性；多种污染物互相作用，干扰正常生理过程、改变细胞结构与功能；污染物之间的螯合作用或沉淀作用改变了污染物的生物有效性[37]。影响联合毒性效应的因素较多[38]：受试组分的浓度、浓度配比、加入时间与顺序；指示生物的类别与染毒时间长短；环境介质的种类和pH值等。1.5本论文的研究内容在国家自然科学基金“纳米ZnO存在下小球藻胞外聚合物（EPS）的产生特性及其对氮磷吸收的影响”的资助下，本论文以纳米ZnO为代表，小球藻为受试生物，SDBS为阴离子表面活性剂代表，在明确纳米ZnO、SDBS单一污染体系对小球藻的毒性效应的基础上，研究纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生长的影响。第二章实验材料和方法2.1实验材料2.1.1实验藻种实验中受试藻种小球藻（FACHB-6）购自中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库（FreshwaterAlgaeCultureCollectionattheInstituteofHydrobiology）。小球藻是一种球形单细胞淡水藻类，直径3~8μm，是一种高效的光合自养植物，分布广泛，是多污带和甲型中污带的指示中，且对毒性反应极为敏感，是评价环境污染物毒性效应的极佳受试生物。2.1.2培养基的配制改良OECD培养基的配方见表2.1。表2.1OECD培养基配方Table2.1OECDmediumformulation

营养盐储备液浓度培养基中浓度储备液1

KH2PO40.88g/L8.8mg/L（改良OECD中）NH4Cl3.82g/L38.2mg/L（改良OECD中）CaCl2·2H2O1.8g/L18mg/LMgSO4·7H2O1.5g/L15mg/LMgCl2·6H2O1.2g/L12mg/L储备液2

Na2EDTA·2H2O100mg/L100µg/LFeCl3.6H2O80mg/L80µg/L储备液3

CoCl2·.6H2O1.5mg/L1.5µg/LNa2MoO4·2H2O7mg/L7µg/LZnCl23mg/L3µg/LH3BO3185mg/L185µg/LCuCl2·2H2O0.01mg/L0.01µg/LMnCl2·4H2O415mg/L415µg/L储备液4

NaHCO350g/L50mg/L2.1.3实验仪器实验中所用仪器如表2.2所示。表2.2实验主要仪器Table2.2Mainexperimentalinstruments名称型号生产厂家恒温恒湿光照培养箱LRHS-150B上海博迅设备厂低温高速冷冻离心机CT15RT上海天美科学仪器有限公司数显鼓风干燥箱GZX-9246MBE上海博迅设备厂移液枪各种型号中国大龙兴创公司电子天平AUY220日本岛津公司pH测定仪Orion4-Star美国Thermo公司立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50S11上海博迅设备厂超声波细胞粉碎机Scientz-2D宁波新芝生物科技股份有限公司恒温摇床HZ200LB

电位粒度测位仪ZS90Malvern原子吸收分光光度计6700瑞华仪器厂2.1.4实验试剂主要实验试剂见表2.2。表2.3实验主要试剂Table2.3ExperimentalmainReagents试剂

备注十二烷基苯磺酸钠(SDBS)

国药集团化学试剂有限公司纳米ZnO

购于阿拉丁公司N,N-二甲基甲酰胺

天津市恒兴化学试剂制造有限公司

2.2实验方法2.2.1小球藻的扩大培养锥形瓶（含超纯水、橡胶塞）、枪头、OECD营养盐在蒸汽锅中进行（121℃，30min）灭菌处理。将培养至对数期的藻液用滤网进行过滤，滤除死亡的藻细胞，在4℃和4000r/min下离心藻液15min，在无菌操作台去除离心上清液，将所得藻细胞接种到含300mL超纯水的锥形瓶（500mL）内，加入适量OECD营养盐，用封瓶膜封口，置于智能光照培养箱中培养。培养条件设定为25±1℃，2500Lux，光暗比采用12:12，每天在固定时间进行人工摇瓶三次以避免藻细胞聚团沉淀贴壁。接种操作均在无菌操纵台中进行[39]。小球藻生物量的测定藻密度与其在一定波长下的吸光度存在线性关系。利用分光光度计取适宜浓度的小球藻细胞，对其进行全扫描，发现小球藻在680nm处有最大吸收峰。因此，采用血球计数板法对小球藻细胞进行计数，并利用分光光度计测定其在680nm处的吸光值，通过线性拟合得到小球藻细胞密度与对应吸光值之间的标准曲线方程，如图2.1所示。图2.2为小球藻生长曲线。

图2.1小球藻细胞密度与吸光值之间的关系Fig.2.1RelationshipbetweencelldensityandabsorbancevalueofC.vulgaris

图2.2小球藻的生长曲线Figure2.2ThegrowthcurveofC.vulgaris2.2.3纳米ZnO储备液的制备精确称取0.1628g纳米ZnO，加入到容量瓶中，然后往瓶中加入100mL经0.22μm水系滤膜过滤的无菌超纯水。然后利用超声波细胞破碎仪在300W功率下冰水浴超声15min达到分散纳米ZnO颗粒的效果，得到浓度为0.15mM的纳米ZnO储备液。最后将配置好的纳米ZnO储备液立即按照实验设置的浓度梯度加入到藻液中。纳米ZnO单一污染体系的毒性效应实验（1）纳米ZnO单一污染体系中小球藻生物量的测定取扩大培养至对数生长期的藻液用滤网进行过滤，去除死亡的藻细胞，在温度为4℃，转速4000rpm的条件下离心15min，倒弃上清液后。将离心后的藻细胞用OECD培养液稀释成在680nm波长下吸光度（OD680）达到0.110（即浓度为1.0×106cell/mL）的藻液。分别量取100mL藻液置于250mL的锥形瓶中，加入化学物质纳米ZnO。纳米ZnO的浓度梯度设置依次为0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.015mM，pH值调节至7。然后将锥形瓶用薄膜封口并放入培养箱中进行恒温恒湿光照培养，其他设置与藻类扩大培养保持一致。在实验周期内每隔24小时利用分光光度计在680nm下测量藻液的吸光值，连续测量七天，并通过藻细胞密度-OD680标准方程计算藻液中的藻细胞密度。（2）单一纳米ZnO污染体系中小球藻叶绿素含量的测定在测量单一纳米ZnO污染体系下生物量的同时，每隔24小时准确量取藻液4mL放入到5mL离心管中，用低温冷冻高速离心机进行离心使藻沉淀至离心管底部，离心条件设定为4℃、6000r/min、10min。离心完毕后，缓慢倒出上清液，然后在通风橱中准确加取4mL的N,N二甲基甲酰胺到藻细胞中。放入冰箱中吸收反应24h，使N,N二甲基甲酰胺在低温避光的条件下充分萃取出叶绿素。最后再次离心（4℃、6000r/min、10min）移取出上清液，用分光光度计分别在663nm和645nm处分别测量上清液的吸光值，连续测量7天。叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量分别用如下公式进行计算：Chlorophylla(mg/L)=(12.7×A663nm－2.69×A645nm)×稀释倍数（2.1）Chlorophyllb(mg/L)=(22.9×A645nm－4.64×A663nm)×稀释倍数（2.2）Chlorophylla＋b(mg/L)=(20.2×A645nm＋8.02×A663nm)×稀释倍数（2.3）2.2.5单一SDBS污染体系中小球藻的生物量测定设置的SDBS的浓度梯度为0、5、10、15、20mg/L，每个浓度设置三个平行组，操作和测定方法同纳米ZnO单一污染体系毒性效应实验。2.2.6纳米ZnO/SDBS复合污染体系的毒性效应实验（1）纳米ZnO/SDBS复合污染体系中小球藻生物量的测定量取100mL配置好的藻液放入250mL锥形瓶中，分成两组，每组分别加入SDBS储备液至浓度为10、20mg/L，加入相同量的纳米ZnO储备液，形成纳米ZnO/SDBS复合污染体系。纳米ZnO储备液的浓度梯度设置为0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.015mg/L五个浓度。每个浓度设定3个平行组，均调节pH值至7，测量复合体系下的生物量，实验周期内每隔24h测一次并连续测量7天。具体操作步骤参考2.2.4。（2）纳米ZnO/SDBS复合污染体系中小球藻叶绿素含量的测定在测量纳米ZnO/SDBS复合污染体系小球藻生物量的同时，每隔24h准确量取藻液4mL放入到5mL离心管中，在高速离心机中进行离心。离心条件设置为4℃、6000g、10min。离心完毕后，缓慢倾倒出上清液，然后在通风橱中准确加取4mLN,N-二甲基甲酰胺到剩余的藻泥中。放入冰箱中避光反应24h使N,N-二甲基甲酰胺充分萃取出叶绿素。最后再次离心（4℃、6000g、10min）移取出上清液，分别在663nm和645nm下测量上清液的吸光值，实验周期内每隔24h测一次并连续测量七天。具体叶绿素计算公式参考2.2.4。

第三章实验结果与讨论3.1纳米ZnO、SDBS单一污染体系对小球藻生长的影响3.1.1纳米ZnO、SDBS单一污染体系对小球藻生物量的影响（1）纳米ZnO单一污染体系对小球藻生物量的影响不同浓度的纳米ZnO对小球藻生物量的影响如图3.1所示。由图可以得出，纳米ZnO对小球藻的抑制作用明显，（该抑制作用在小球藻培养24h后就已经出现）。在实验浓度范围内，纳米ZnO对小球藻生长的抑制率随着纳米ZnO浓度的升高而呈现先增大后减小的趋势。在第7天，实验组的生物量分别是对照组（无纳米ZnO，38.19×105cells/mL）的84.87%、69.23%、52.50%、45.61%、46.74%、49.20%，可以看出纳米ZnO为0.04mM时抑制作用最为明显，可能存在其它未知机理使得更高浓度的纳米ZnO没有具有更大的毒性。图3.1纳米ZnO对小球藻生物量的影响Fig.3.1Effectsofnano-ZnOonthebiomassofC.vulgaris（2）SDBS单一污染体系对小球藻生物量的影响由图3.2可知，SDBS对小球藻的生长有抑制作用，且抑制作用随着溶液中SDBS浓度的增大逐渐增强，但是在实验浓度范围内，其抑制作用都不是很明显。当SDBS浓度分别为5、10、15、20mg/L时，测得第7天的生物量分别为37.09×105、36.69×105、36.05×105、35.62×105cells/mL，分别为对照组的97.12%、96.07%、94.39%、93.27%。图3.2SDBS对小球藻生物量的影响Fig.3.2EffectsofSDBSonthebiomassofC.vulgaris3.1.2纳米ZnO单一污染体系对小球藻叶绿素含量的影响藻的生长受多种因素的共同影响，光合作用是其中重要因素之一。叶绿素作为光合作用的基础，其含量的高低能体现出藻类的生长状况并在一定程度上反应出小球藻生物量的多少。由图3.3可知，小球藻内叶绿素a的含量比叶绿素b的含量高很多，且总叶绿素的含量接近于二者之和。对照组（未添加纳米ZnO）中叶绿素含量最高。当纳米ZnO浓度C<0.04mg/L时，叶绿素的含量随纳米ZnO浓度的升高而降低，当纳米ZnO浓度C≥0.04mg/L时，叶绿素的含量随纳米ZnO浓度的升高反而有所增加，这与小球藻生物量的变化趋势具有一致性。叶绿素含量相比于对照组的减少率大于小球藻生长抑制率，这可能是由于叶绿素含量的变化发生在细胞分子水平上，比细胞增长发生的更早。而高浓度纳米ZnO由于其较强的生物毒性效应，使藻细胞的叶绿体结构遭到破坏，叶绿素合成受阻，进而影响了小球藻的光合作用，使有机物合成减少，导致藻类生长受阻，表现为生物量增长受到抑制[40]。李雅洁等[41]指出高浓度的纳米ZnO可以破坏藻体产生的解毒物质，形成大量ROS，ROS导致膜脂质过氧化，致使叶绿素含量下降，细胞生长受阻。

图3.3纳米ZnO对小球藻叶绿素的影响Fig.3.3EffectsofnanometerZnOonchlorophyllofC.vulgaris3.2纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生长的影响3.2.1纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生物量的影响纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻的生长抑制率随纳米ZnO浓度的升高而呈现先增大后减小的趋势，在0.04mg/L具有最大的抑制率，其趋势与纳米ZnO单一体系的趋势一致。纳米ZnO浓度C≥0.04mg/L时，小球藻生长在第4天后呈下降趋势，其死亡率已大于生长率，小球藻的生物量均出现负增长。即可知复合污染体系中当纳米ZnO浓度C≥0.04mg/L时，小球藻很快死亡。当纳米ZnO/SDBS复合污染体系中SDBS浓度为10mg/L时，第7天生物量是对照组1（无纳米ZnO、无SDBS，38.19×105cells/mL）的78.29%、61.48%、46.01%、27.57%、29.74%、30.29%。是对照组2（无纳米ZnO、10mg/LSDBS，36.69×105cells/mL）生物量的81.49%、64%、47.89%、28.70%、30.79%和31.53%。当纳米ZnO/SDBS复合污染体系中SDBS浓度为20mg/L时，小球藻的生长受到非常显著的抑制作用，第7天的生物量依次为16.99×105、13.44×105、12.00×105、7.50×105、8.11×105和8.60×105cells/mL，其最大值也仅是对照组1的44%，对照组3（无纳米ZnO、20mg/LSDBS，35.62×105cells/mL）的47.70%。发现复合体系显著抑制了小球藻的生长。因此可以得出对于相同浓度的纳米ZnO情况下，SDBS越大抑制作用越强。

图3.4纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生物量的影响Fig.3.4Effectsofnano-ZnOandSDBScombinedpollutionsystemonthebiomassofC.vulgaris

3.2.2纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻叶绿素的影响由图3.5可知，纳米ZnO/SDBS复合污染体系会使藻细胞内叶绿素含量降低，当SDBS浓度一定时，复合污染体系中小球藻叶绿素含量随纳米ZnO浓度的升高而呈现先减少后增加的趋势，在0.04mg/L时具有最大的抑制率，其趋势与单一纳米ZnO体系下叶绿素变化的趋势一致。通过计算，当SDBS=10mg/L时，复合污染体系下，纳米ZnO浓度为0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.15mM对应的第七天总叶绿素的含量是对照组1（无纳米ZnO、无SDBS，3.92mg/L）的63%、53.31%、44.39%、21.17%、25%、25.5%。叶绿素a的含量分别减少了41.2%、49.82%、55.60%、82.31%、77.26%、76.23%，叶绿素b的含量减少了26.96%、39.02%、55.055、70.68%、70.57%、69.9%。当SDBS=20mg/L时，总叶绿素的含量是对照组1的32.91%、21.94%、21.68%、9.44%、10.97%、11.99%，叶绿素a的含量分别减少了63.18%、76.90%、78.34%、88.45%、86.28%、85.92%，叶绿素b的含量减少了76.52%、77.39%、80.87%、96%、95.46%、93.57%。发现当纳米ZnO浓度一定时，复合污染体系中SDBS的浓度越大，对小球藻的生物毒性越强。

图3.5纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻叶绿素的影响Fig.3.5EffectsofnanometerZnO/SDBScombinedpollutionsystemonchlorophyllofCvulgaris

第四章研究结论及展望4.1研究结论本论文以纳米ZnO为纳米材料代表、十二烷基苯磺酸钠为阴离子表面活性剂代表，在明确了纳米ZnO、SDBS单一污染体系对小球藻生长的影响基础上，进一步研究了纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生长的影响。具体结论如下：4.1.1纳米ZnO、SDBS单一污染体系对小球藻生长的影响（1）纳米ZnO对小球藻生长存在毒性效应。在实验浓度范围内（0-0.15mM)，随着纳米ZnO的浓度增加呈现先增大后减小的趋势，纳米ZnO浓度0.04mM时对小球藻具有最大的生长抑制作用。（2）SDBS对小球藻生长的影响很小，几乎可以忽略。（3）纳米ZnO抑制了小球藻的叶绿素合成，其抑制趋势与对小球藻生长的抑制趋势相类似。4.1.2纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻生长的影响（1）纳米ZnO/SBDS复合污染体系显著的抑制了小球藻的生长。纳米ZnO/SDBS复合污染体系对小球藻的生长抑制率随纳米ZnO浓度的升高而呈现先增大后减小的趋势，在0.04mM时具有最大的抑制率。在复合污染体系中，当纳米ZnO浓度C≥0.04mM使得小球藻在第4天即进入衰亡期。而当SDBS为20mg/L，复合污染体系具有很强的毒性效应，使得实验组第一天的生物量均低于初始值。（2）纳米ZnO/SDBS复合体系显著抑制小球藻叶绿素的合成，其趋势与其对小球藻生物量抑制趋势几乎相同。在复合体系中，当纳米ZnO浓度一定时，20mg/L的SDBS抑制程度大于10mg/L。纳米ZnO/SDBS复合体系对小球藻比纳米ZnO单一体系有更大的抑制作用。4.2研究展望（1）本文猜测纳米ZnO对小球藻的毒性主要来源于Zn2+，但有研究表明纳米ZnO自身独特的特殊物理化学性质能引起生物毒性，所以可以考虑比较可溶性锌盐与纳米ZnO对小球藻的毒性来作进一步验证。（2）通过研究我们发现SDBS能促进纳米ZnO的溶出，但具体的作用机制还不能确认，猜测可能是离子交换作用而引起，因此可以比较可溶性钠离子和SDBS对纳米ZnO溶出的影响。参考文献[1]白春礼.纳米科技及其发展前景[J].化工学报，2001，52(6):37-37.[2]曹茂盛，曹传宝，徐甲强，等.纳米材料学，哈尔滨:哈尔滨工程大学出版社，2002.[3]吴翔.纳米材料(连载三)江南航天科技，2002，3:60-63.[4]NowackB，BucheliTD.Occurrence，behaviorandeffectsofnanoparticlesintheenvironment[J].EnvironPollut，2007，150(1):5-22.[5]张宁，金星龙，李晓，etal.人工纳米材料对藻类的毒性效应研究进展[J].安徽农业科学，2011，39(10):6000-6003.[6]朱世东，徐自强，白真权，etal.纳米材料国内外研究进展Ⅱ——纳米材料的应用与制备方法[J].热处理技术与装备，2010，31(4):1-8.[7]高春华.纳米材料的基本效应及其应用[J].江苏理工大学学报(自然科学版)，2001，22(6):45-49.[8]ServiceR.AmericanChemicalSocietymeeting.Nanomaterialsshowsignsoftoxicity[J].Science(NewYork，NY)，2003，300(5617):243.[9]OberdrsterG，FerinJ，LehnertBE.[J].EnvironHealthPerspect，1994，102(Suppl.5):173～179.[10]BaunA，SørensenSN，RasmussenR，etal.Toxicityandbioaccumulationofxenobioticorganiccompoundsinthepresenceofaqueoussuspensionsofaggregatesofnano-C60[J].AquaticToxicology，2008，86(3):379-387.[11]ZhangX，SunH，ZhangZ，etal.Enhancedbioaccumulationofcadmiumincarpinthepresenceoftitaniumdioxidenanoparticles[J].Chemosphere，2007，67(1):160-166.[12]FanW，CuiM，LiuH，etal.Nano-TiO2enhancesthetoxicityofcopperinnaturalwatertoDaphniamagna[J].EnvironmentalPollution，2011，159(3):729-734.[13]ZhangQ，KusakaY，SatoK，etal.[J].ToxicolEnvironHealthA，1998，53(6):423～438.[14]OsierM，OberdrsterG.[J].FundamApplToxicol，1997，40(2):220～227.[15]RahmanQLohaniMDoppEetal.EvidencethatultrafinetitaniumdioxideinducesmicronucleiandapoptosisinSyrianhamsterembryofibroblasts[J].EnvironHealthPerspex，2002，110:797～800[16]AlexandraG.TinyTrouble:Nanoscalematerialsdamagefishbrains.ScienceNews，2004，165(14):211[17]OberdrsterGFinkelsteinJJohnsonC.Acutepulmonaryeffectsofultrafineparticlesinratsandmice.ResReDHealthEff.Inst.，2000，96:5~74.[18]OberdorsterG，FerinJ，LehnertBE，etal.Correlationbetweenparticlesize，invivoparticlepersistence，andlunginjury[J].EnvironHealthPerspect，1994，102(5):173-179.[19]王静纳米级与微米级氧化硅粉体对大鼠急性肺毒性的比较研究[D].沈阳:中国医科大学[硕士论文]，2007.[20]赵宇亮，柴之芳纳米生物效应研究进展[J]中国科学院院刊，2005，20(3):194-199.[21]WeiL，ThakkarM，ChenY，etal.Cytotoxicityeffectsofwaterdispersibleoxidizedmultiwalledcarbonnanotubesonmarinealga，Dunaliellatertiolecta[J].AquaticToxicology，2010，100(2):194-201.[22]DaleAL，LowryGV，CasmanEA.ModelingNanosilverTransformationsinFreshwaterSediments[J].EnvironSciTechnol，2013，47(22):12920.[23]AruojaV，DubourguierHC，KasemetsK，etal.ToxicityofnanoparticlesofCuO，ZnOandTiO2tomicroalgaePseudokirchneriellasubcapitata[J].SciTotalEnviron，2009，407(4):1461-1468.[24]BürgisserсSCernikMBorkovecMetal.Determinationofnonlinearadsorptionisothermsfromcolumnexperiments:Analternativetobatchstudies[J].EnvironmentalScience&Technology，1993(27):943-948.[25]刘冠男，刘新会.土壤胶体对重金属运移行为的影响[J].环境科学，2013(7):1308-1317.[26]NowackBBucheliTD.Occurrencebehaviorandeffectsofnanoparticlesintheenvironment[J]EnvironmentalPollution，2007(1):5-22.[27]ZhuYingjiaMaLenaQXiaolingDongetal.lonicstrengthreductionandflowinterruptionenhancedcolloid-facilitatedHgtransportincontaminatedsoils[J].JournalofHazardousMaterials，2014(64):286-292.[28]RyanJN，ElimelechM.Colloidmobilizationandtranisportingroundwater[J].ColloidSurfaceА，1996(95):1-56.[29]LiwarskaBizukojcE，BizukojeM.Elfectofseleetedanionicsurfactantsonactivatedsludgeflocs[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2006，39(4):660-668.[30]李祥英.阿维菌素和两种季铵盐阳离子表面活性剂对大型溞的毒性[D].济南:山东农业大学，2012.[31]HanX，TammLKA.host-guestsystemtostudystructure-functionrelationshipsofmembranefusionpeptides[J].PNAS，2000，97:13097.[32]FernandezPerezEJ，SepulvedaFJ，PetersC，etal.Effectofcholesterolonmembranefluidityandassociationofabetaoligomersandsubsequentneuronaldamage:adouble-edgedsword[J].Front.AgingNeurosci.，2018，10:226.[33]LiuX，LiY，SunR.Influenceofcholesterolonphosphatidylethanolaminemonolayerfilm[J].J.At.Mol.Phys.，2012，29:183(inChinese)[刘晓燕，李旸，孙润广.胆固醇对磷脂酰乙醇胺单分子层影响的研究[J].原子与分子物理学报，2012，29:183][34]ChenZ，RandRP.Theinfluenceofcholesterolonphospholipidmembranecurvatureandbendingelasticity[J].Biophys.J.，1997，73:267.[35]周启星.复合污染生态学[M].City:中国环境科学出版社,1995.[36]王兰.多种重金属对发光菌联合毒性特征研究[D].华北电力大学(北京)华北电力大学,2014.[37]朱利中.环境化学[M].北京：高等教育出版社.2011[38]唐柱云.苯酚苯胺类对绿藻的联合毒性及QSAR研究[D].河海大学,2007.[39]LinD,XingB.Phytotoxicityofnanoparticles:inhibitionofseedgerminationandrootgrowth[J].EnvironmentalPollution,2007,150(2):243-250.[40]梁长华.纳米NiO对小球藻的生物毒性及致毒机制研究[D].大连海事大学,2010.[41]李雅洁,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附录：英文文献翻译腐殖质对镉和SDBS对绿藻的毒性影响张颖，杨瑞新，王思阳，司小辉，段兴伟，周吉缇摘要：化学品混合物在水生环境中的联合毒性尚不清楚。为了阐明金属和有机污染物混合物的联合毒性，以及现实水体中溶解有机物（DOM）对金属毒性作用的影响，我们用镉（Cd）和十二烷基苯磺酸钠（SDBS）对具有或不具有黄腐酸（FA）的溶解有机物（DOM）进行了毒性试验。结果表明，黄腐酸对斜角藻的毒性大于SDBS，黄腐酸对SDBS的影响大于Cd。镉和SDBS的联合毒性对绿藻有协同作用，观察到联合毒性随着FA的存在而增加。我们的结果为有机物和金属的联合毒性研究提供了一个例子，有助于了解含DOM的田间水体中污染物混合物的毒性。关键词：镉（Cd），十二烷基苯磺酸钠（SDBS），富里酸（FA），联合毒性，协同效应。1.导言大多数环境污染事件涉及到多种污染物的混合物。目前，复杂的有机污染物和重金属越来越多的在自然水域中被同时检测到（谭等人，2015年；埃特维斯等人，2016年）。因此，田间环境中的水生生物通常暴露于这些化学物质的混合物中，而不是单独的污染物（库萨富蒂斯和青山，2006年）。同时，污染物之间的相互作用通常使其联合毒性与其单独毒性的简单加入显著不同，即，协同作用或拮抗作用。众所周知，重金属的毒性（马查多等人，2015年）或有机污染物（张等人，2014年；莱丘加等人，2016年）对水生生物的毒性是单独报告的，而这些混合物对水生生物的联合毒性没有得到完全了解。天然水中的溶解有机物（DOM）表现出较高的反应性。据报道，金属或有机物会影响污染物对生物体的毒性。在金属方面，据报道，DOM可降低Cu、Pb、As和Zn对蓝贻贝、藻类和大型水蚤的毒性（张等人，2014年；诺盖拉等人，2017年；Ren等人，2017年）。在有机物方面，其影响更为复杂，DOM的存在降低了蒽、重氮酮和4-氯氧西林对水蚤的毒性（Oris等人，1990年；Lee等人，1993年）。同时增加了氰戊菊酯和三氯丙烷对水蚤的毒性（Hodge等人，2010年；阿尔巴尼斯等人，2017年）。因此，基于其个体毒性，进一步探讨DOM的化学混合物对水生生物的联合毒性的影响将是有趣的。关于化学品的混合物，据报告，DOM的存在降低了锌/铜或锌/铅二元混合物的毒性，而DOM对铜和铅二元混合物的联合毒性的影响不显著（Tsirid等人，2006年）。到目前为止，还没有关于DOM对金属和有机物联合毒性的影响的研究。因此，DOM对化学混合物联合毒性的影响，特别是金属和有机物的混合物，需要进一步研究。镉（Cd）是物质优先清单（ATSDR，2017年）中排名第七的污染物，已在中国地表水中检测到，如界河、湘江、长江（吴等人，2009年；曾，2015年）。镉对鱼类有急性毒性，对水蚤有慢性毒性（吴等人，2004年；波因顿等人，2007年；纳迪等人，2015年）。在自然水环境中也检测到SDBS，例如：长江（吴等人，2004年）。据报道，SDBS对水蚤（Oleszczuk等人，2015年）和对鱼类过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和脑乙酰胆碱酯酶（AChE）的酶活性（吉法等人，2006年）以及对鱼类（杂交罗非鱼）的免疫毒性产生影响（于等人，2008年）。在这里，我们进行了一项研究，探究有无DOM的环境中金属和有机物对水生生物的联合毒性。以Cd和SDBS为金属和有机污染物的代表，以S.obliquus为典型的水生生物模型。黄腐酸（FA）作为天然有机中最丰富的成分，由于其良好的溶解性，被选为DOM的代表。本研究的主要目的是：（1）比较Cd和SDBS对水生生物的个体毒性；（2）评价Cd和SDBS的联合毒性；（3）确定FA对Cd和SDBS联合毒性的影响。欧共体在用ScenedesmusObliquus（S.Obliquus）进行毒性试验时，用FA或不用FA评价Cd和SDBS的毒性，而联合毒性的类型用添加剂指数和等波图反映。我们的研究给出了联合毒性研究的例子，以及DOM是否会对化学混合物的毒性影响的说明。2.材料和方法2.1.测试化学品和测试藻类氯化镉（分析纯，纯度≥99%）购自天津凯美欧化学试剂有限公司，德国进口SDBS（纯度≥90%），由中国广州化学仪器和玻璃试剂批发部零售。黄腐酸（纯度≥90%）购自上海江莱试剂有限公司。绿藻是从中国科学院水文研究所（武汉，中国）获得的。S.斜面在BG11培养（胡等人，2015年）中培养，在25±1oC和具有12：12h的明暗条件下，在5000LX的连续白荧光灯下配养。初始藻类细胞密度为2×105Cell/mL进行毒性试验。2.2.毒性测试毒性试验使用的S.斜角是在OECD201（OECD，2011年）后进行的。在相同的培养条件下生长的斜角虫用于所有毒性试验。在暴露后72h对斜角藻的Chl-a合成进行了检查每个试验浓度的毒性试验一式三份。2.2.1.个别化学品的毒性试验将CD或SDBS单独添加到培养基中。本研究中用于暴露的化学品的测试浓度显示，表1其中，根据我们预实验的结果分配。绘制了Cd/SDBS对对数浓度的抑制率。e50用回归方程得到数值。2.2.2.二元混合物的毒性试验基于EC50单个化学物质的毒性计算2.2.3.含有FA的化学品的毒性试验将FA溶于超纯水中，以1g/L为原液，然后用超纯水稀释至5或25mg/L。将单个混合物和二元混合物的Cd和SDBS浓度分别设置为表1和表2。2.2.4.毒性终点镉和SDBS对S.斜角的急性毒性试验。用以下端点表示，即叶绿素a（Chl-a）浓度、细胞密度、超氧化物歧化酶（SOD）活性和细胞膜完整。（1）CHL-a浓度：采用乙醇提取（Yang等人，2013年（1）（2））的方法测定Chl-a浓度低的EQ。并分别计算了Chl-a浓度及其抑制率：C=13.95A665−6.88A649（1）红外=[（C）0−C）/C0]×100%（2）毒性其中C为Chl-a浓度；A665和A649分别为665nm和649nm的光密度。红外光谱是抑制率的百分比，C0和C分别是对照组和实验组Chl-a浓度的平均值。毒性（2）细胞密度：根据OECD201（OECD，2011年）对细胞密度进行毒性试验。用分光度计（V-560，Jasco，日本）在0h和72h测量了690nm处藻类培养的光密度。根据基于直接细胞计数的线性方程（用血细胞计测量，XB-K-25，中国）测定培养物中的细胞密度，并在690nm处测定光密度。用EQs计算藻类细胞生长速率及抑制率。μ=（lnNt－lnN0）/（t－t0）（3）红外=[（μ0−μ）/μ0]×100%（4）毒性（3）OD活性：根据硝基蓝四氮唑光化学还原法，在化学物质暴露细胞膜完整性：碘化丙啶（PI）荧光染色和流式细胞术分析用于细胞活力测试（波尚和弗里多维奇，1971年）。在正常BG11培养基中培养藻类细胞。72h后，用一定的改性分析SOD的活性。样品组的反应混合物含有5×10−2mol/L磷酸钠缓冲液，1.3×10-1mol/Ld蛋氨酸，7.5×10-4mol/L硝基蓝四唑，1×10-4mol/LEDTA-Na2，2×10-5mol/L核黄素和酶提取物。两对照组均采用磷酸钠缓冲液代替酶提取液。（4）细胞膜完整性：采用碘化丙啶荧光染色和流式细胞仪分析细胞活力（魏等人，2014年）。藻类：正常BG11培养基中的细胞培养以重铬酸钾处理的藻类细为阴性对照。通过离心300目过滤细胞培养，在2650g下收集藻类细胞5min。去除上清液后，用200μLPi溶液（50μg/mL）重新悬浮藻类颗粒，在黑暗中孵育30分钟，然后进行流式细胞术分析BD-FACS（坎托贝顿-狄金森生物科学，美国）。用氩激光（488N·m）激发细胞，检测564-606nm的荧光发射。Pi只能进入受损膜的细胞，并插入双链核酸，以发出更强的荧光。每个样品收集和分析10,000个细胞，以获得荧光发射较强的细胞百分比。2.3.镉和SDBS的联合毒性用Eq计算了混合物（A和B）的联合毒性（S）。s=（a）m（a）+（b）m（b）（5）其中A和B是EC50分别为CD和SDBS的值；Am和Bm是EC50混合物中Cd和SDBS的值。用加性指数（AI）评估联合毒性类型，以确定Cd和SDBS对斜角藻的联合毒性类型。人工智能是由Eq计算的。如果S>1.0，AI=S+1；否则，AI=1/S−1（6）如果AI值为0，则表示混合物的毒性仅为加性效应；如果AI<0，则表示拮抗效应；如果AI>0，则表示协同效应。Isobologram也是用Eq中的值绘制的目的：直观评价Cd和SDBS（兰格和托穆卡，1997年）的联合毒性。X轴定义为Am/A，Y轴定义为Bm/B。如果点位于直线上（x+y=1），则表示联合毒性的模式为加性效应，如果点位于直线左侧（x+y=1），则表示协同效应，否则为拮抗效应。2.4.统计分析所有统计分析均采用OriginPro9.0（美国OriginLab）和SPSS22.0（美国IBM）进行。采用Tukey检验的单向方差分析（P<0.05）进行差异分析。3.结果3.1.四个端点的比较为了选择一个相对敏感的终点来评估Cd和SDBS的毒性，使用了四个终点来检查单个Cd或SDBS对S.斜角的毒性，即SOD活性、Chl-a合成、细胞密度和细胞膜完整性（图1）。从图1可以看出EC50的价值。在Chl-a合成中，Chl-a合成是最低的，这表明Chl-a合成是相对敏感的终点。同时，相关系数最高（R2在四个终点之间的Chl-a合成线中也发现了拟合线，这意味着Chl-a合成可以显著反映对试液浓度的毒性反应。因此，我们选择Chl-a合成作为以下毒性试验的合适终点。3.2.二元混合物的毒性试验本文给出了Cd和SDBS二元混合物对斜角藻合成的抑制率72h的结果。从图1的72h-EC50可以看出。当Cd和SDBS的混合比为24、12和32mg/L时，二元混合物中的SDBS为24、12和32mg/L。72h-EC50关于Cd，72h-EC50混合比分别为1：1、2：1和1：2分别为0.007、0.007和0.005mg/L，低于单个Cd（0.02mg/L）。表明Cd和SDBS在二元混合物中的毒性均高于单个混合物。为了评价Cd和SDBS的联合毒性，我们还在其72h-EC50的基础上描述了等离子（图1）,当斜角植物暴露于单个Cd和SDBS及其混合物时。如图所示，当Cd和SDBS的混合比分别为1∶1，2∶1和1∶2时，点均位于线的左侧（x+y=1），表明Cd和SDBS的联合毒性对斜角星具有协同作用。同时，采用人工智能（添加剂指数）进一步研究了它们的联合毒性类型。当Cd和SDBS的混合比为1时图1，2：1和1：2，计算AI分别为0.45、0.92和0.43。均大于0，说明这两种化学物质的联合作用与斜方针有协同作用。3.3.FA对Cd和SDBS对藻类毒性的影响3.3.1.个体FA的毒性根据FA在总DOM中的比例分配FA的浓度。例如,天然水（陈等人，2015年;于等人，2018年）中的FA或HA，目的是确定FA的无观测效应浓度（NOEC）。单个FA对Chl-a合成的毒性试验。

采用5个系列浓度：1、5、10、25和50mg/L。结果表明，FA在1、5、10和25mg/L时的毒性无显着性差异（p<0.05）（数据未在此显示）。因此，我们选择的FA浓度为5.25毫克/升，在NOEC的范围内，我们做实验对其进行研究。.3.2.FA对单个和毒性的影响CDSDBS研究表明FA对单个Cd和SDBS毒性的影响。图1.4从a中，我们可以看到72h-EC50镉的含量图1.4在5mg/LFA和25mg/LFA浓度下，分别为0.016和0.017mg/L，均略低于单个Cd下的0.02mg/L，表明FA不能显著影响