3.2基因工程操作的基本程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3

实例：抗虫棉的培育第2节基因工程操作的基本程序中国抗虫棉之父郭三堆棉铃（果实）和棉铃虫取得的成就：1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

1911年，德国人在一个叫苏云金的地方发现了一种寄生在昆虫体内，具有很强的杀虫能力的细菌，将它命名为苏云金杆菌。苏云金杆菌是一种能产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)的革兰氏阳性细菌。用它可以制成微生物源低毒杀虫剂。苏云金杆菌在芽孢形成期，它体内的B基因可以编码产生Bt抗虫蛋白。Bt抗虫蛋白被目标昆虫摄食后，在昆虫消化道的碱性环境下被胰蛋白酶水解，形成毒素核心肽段与昆虫肠上皮细胞上的受体结合，结合后插入细胞磷脂双分子层，使细胞膜允许离子(如Na、K等)和寡糖(如蔗糖、麦芽糖等)自由通过，细胞的渗透压发生改变，从而导致昆虫中肠停止蠕动，中肠上皮细胞解离，昆虫停止进食。芽孢在肠中萌发，经被破坏的肠壁进血腔，大量繁殖，使昆虫患败血症，最终死亡。培育抗虫棉的过程1342

基因工程操作的基本程序一、目的基因的筛选与获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。例如：抗虫基因、荧光基因、抗寒基因、抗体基因、干扰素基因等等。如何筛选和获取合适的目的基因呢？（以棉花抗虫基因为例）

一、目的基因的筛选与获取（以棉花抗虫基因为例）

用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂防治棉花虫害→伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)→Bt基因的序列。明确了目的基因（Bt基因）后，该怎么获得它呢？③利用PCR技术获取和扩增目的基因（Bt基因）②从基因文库（或数据库）中获取目的基因①人工化学合成目的基因DNA分子量比较小，序列已知(DNA合成仪直接合成)技术成熟、简便、快速、成本低等优点，广泛应用DNA合成仪从基因文库中获取目的基因提取基因组DNADNA片段重组载体基因组文库限制酶与载体连接导入受体菌提取特定组织或发育时期的mRNA单链DNA重组载体cDNA文库双链cDNA导入受体菌与载体连接DNA聚合酶逆转录酶基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子cDNA文库中的基因不含以上结构PCR技术的原理和操作过程PCR：聚合酶链式反应的缩写（PolymeraseChainReaction，PCR）。在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR技术是穆里斯等人1985发明，1993年获得诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－2019）→→5’3’5’3’DNA复制原理主要场所原料酶能量引物过程产物细胞核4种游离脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶等ATPRNA解旋、合成引物、延伸2个完整的DNA分子回顾：细胞内DNA复制的原理、条件与过程DNA分子复制【资料1】1971年科拉纳最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆DNA”，但只限于理论研究，也未得到普遍关注和认同。【资料2】供职于生物公司的穆利斯对DNA合成很有兴趣，1983年4月在一次度假路上，他联想到两条相向的高速公路为DNA模板，再加上引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶，进行循环扩增，DNA数目会呈指数型增长，30个循环后就会得到一个天文数字！“Idomybestthinkingwhiledriving.”我在开车的时候最有灵感。【思考】两位科学家都设想了体外扩增DNA的方法，他们依据的生物学原理是什么呢？DNA半保留复制【资料3】穆利斯将部分人体细胞DNA、dNTPs和一种神经生长因子基因的引物放入试管中，将混合物煮沸几分钟后冷却，再放入适量大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，封好试管后在37℃下保存，然后将混合物重复高温加热、冷却、37℃保存的操作，可是12小时后没有任何产物。【思考】穆利斯进行煮沸的目的是什么？

dNTPs可能是什么？

推测没有成功的原因是什么？高温断开氢键，解开双链高温条件下，DNA聚合酶会失活，所以每一轮都应该加入新的DNA聚合酶合成DNA的原料【资料4】穆利斯改进了操作，每一个循环都加入新的DNA聚合酶，3个月后，终于完成了第一次扩增实验，对一个49bp的DNA片段进行了10个循环的扩增。他的扩增实验需要纯手工操作：分别将3个水浴槽设置为高温变性温度、复性（退火）温度、延伸温度，然后把装着试管的小篮子放进高温变性水浴槽里泡着，十几秒钟后，DNA充分变性了，便把篮子放复性（退火）水浴槽里几秒钟，让引物和DNA结合，再把篮子放延伸水浴槽里几十秒合成新的DNA。【思考】根据资料推测体外扩增DNA的过程是什么？每个步骤的目的是什么？94℃55℃37℃变性解螺旋延伸DNA聚合酶促扩增复性引物—模板结合循环循环1966年，美国微生物学家布鲁克在黄石国家公园的一个热泉找到一种耐热细菌——Taq细菌。1976年，中国台湾科学家钱嘉韵成功的从Taq细菌中分的到耐高温的DNA聚合酶——Taq酶。Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）的发现【资料5】由于高温下酶会变性失活，每一轮循环都要加入新的聚合酶。当时聚合酶的价格胜过黄金，这样的消耗必然影响这项技术的普及。并且一次扩增循环，就要把篮子在3个水浴槽都过上一轮。几十个循环下来，技术员已是筋疲力尽。如何解决这个难题呢？PCR：原理、条件与过程DNA复制PCR原理主要场所原料酶能量---------引物过程产物缓冲溶液--------细胞核4种游离脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶等ATPRNA解旋、合成引物、延伸2个完整的DNA分子DNA分子复制大量扩增引物间的DNA片段体外4种dNTPsTaq酶（耐高温的DNA聚合酶）DNA变性、复性（退火）、延伸在一定的缓冲溶液中进行3’5’3’5’脱氧核苷酸脱氧核苷三磷酸（dNTP）脱氧核苷酸链4种dNTPdATPdGTPdCTPdTTPPCR仪2种能与母链互补的小段单链DNA引物:DNA分子模板:4种游离的脱氧核苷三磷酸原料:酶:耐高温DNA聚合酶合适的缓冲液（维持pH恒定）；Mg2+

(酶的激活剂）……变性、复性（退火）、延伸PCR的过程高温变性：90-95℃，解开DNA双链。低温复性：约50℃，两种引物通过碱基互补配对分别与两条模板链结合。适温延伸：约72℃，Taq酶将4种dNTP连续添加到（3’端）

上，

根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。PCR过程动画播放【PCR的反应过程】94℃55℃72℃三个步骤为一个循环高温变性→低温复性→适温延伸变性（解旋）复性（退火）延伸第1个循环94℃55℃72℃三个步骤为一个循环变性（解旋）复性（退火）延伸第2个循环95℃55℃72℃三个步骤为一个循环变性（解旋）复性（退火）延伸第3个循环**PCR的过程变性复性（50℃-55℃左右）延伸（72℃）（90℃—95℃）目的基因DNA受热变性，解为单链2种引物与单链DNA的相应序列互补结合以2条单链DNA为模板，4种脱氧核苷酸加到引物的3

端，在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸形成DNA链【拓展任务】经过几轮循环，能够获得两条脱氧核苷酸链等长的

目的基因序列？

3轮总结PCR的条件及过程PCR的条件：PCR的过程：模板/原料（dNTPs）/Taq酶/引物（15-30个碱基）变性（94℃）/复性或退火（55℃）/延伸（72℃）

DNA复制PCR反应解旋在

酶作用下，细胞提供

，双链

解开加热至

℃，双链全部

解开，不需要

酶特点

酶

复制次数

引物

结果

相同点都需要

，

，

，都需要在一定的

中进行，都遵循

。解旋ATP部分90-95解旋边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增，半保留复制解旋酶，DNA聚合酶耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶）细胞自身控制一般30—40次模板原料与能量引物液体环境碱基互补配对原则RNA单链大量特异性DNA片段整个DNA分子引物对（DNA单链）…………【思考】1、2两个学生小组进行PCR操作扩增VisG和mCh，均没有扩增出两种基因。经检查两组PCR操作添加反应成分、用量、操作程序均未发现问题，下面是两组设计的引物，请分析扩增不成功的原因是什么？第1组引物：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效;第2组引物：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。设计引物注意：①两种引物序列往往既不相同，也不互补。②不能过短（15-30个碱基），避免降低特异性；也不能过长,避免同一引物自身碱基序列互补。③引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性，避免非特异性扩增。PCR过程模拟活动每小组4人，模拟1个DNA分子经过3轮PCR扩增过程。实验——VisG和mCh的扩增及电泳鉴定1.DNA体外扩增的原理PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解旋与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。越小的DNA片段距离出发点越远，片段相同（或大小相同）的DNA分子会停留在凝胶中相同的位置形成条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来荧光条带。通过PCR技术扩增获得了目的基因，如何从反应体系中分离出它呢？琼脂糖凝胶电泳

DNA分子带负电，向琼脂糖凝胶中灌注缓冲溶液，在阴极端琼脂糖凝胶中的点样孔中，分别加入MARK和经过染色剂处理DNA样品（PCR产物）。通入电流，在电场力的作用下，目的基因（DNA片段）形成条带，在紫外光下可观测到荧光条带，切割这部分琼脂糖凝胶，即可获得目的基因。PCR反应体系的配方实验组对照组VisG引物F（mCh引物F）1ul1ulVisG引物R（mCh引物R）1ul1ul扩增缓冲液（10ⅹEasytaqBuffer）5ul5ul4种脱氧核苷酸的等量混合液(dNTPs)4ul4ulddH2O36ul38ul模板DNA(VisG质粒或mCherry质粒）2ul——TaqDNA聚合酶1ul1ul总体积50ul50ul材料用具将50ul分装在2个离心管中，每管25ul。VisG和mCh基因的扩增——PCRPCR方法步骤用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约30s，使反应液集中在离心管的底部参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min40次940C,20s560C,20s720C，1min移液离心扩增VisG和mCh基因的扩增——PCR160C，5min720C，5min电泳方法步骤PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，5ul缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳、观察取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。电泳鉴定VisG和mCh基因(VisG——720bp；mCh——711bp）电泳结果分析：碱基对（bp）点样孔80005000300020001000750500M12345678M——标准参照物（Marker）2、4——VisG质粒做模板DNA1、3——与2、4不同的只是没有加入模板DNA，其它物质相同；6、8——mCh质粒做模板DNA，5、7——与6、8不同的只是没有加入模板DNA。

已知VisG与mCh基因的碱基对数为720bp和711bp【思考】依据以上操作和结果，分析是否成功扩增出VisG与mCh基因？判断的依据是什么？是，

VisG与mCh基因大小为720bp和711bp，2.4.6.8泳道中都可以在紫外灯下直接观察到DNA条带在750bp附近的分布，且2.4泳道条带较粗。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，2.4泳道中不是一条，出现了非特异性条带。RNA可以通过PCR技术扩增进行的？扩增过程与DNA一样吗？如何进行的呢？

反转录PCR(RT-PCR)又称为逆转录PCR。其原理是:

提取样品中的总RNA，以其中的目标RNA作为模板，根据模板上的已知序列设计DNA引物（例如，新冠病毒的S蛋白RNA序列），利用反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。该技术灵敏度高、应用广泛，可以检测目的基因表达量、获得目的基因（cDNA序列）、或合成cDNA探针，检测RNA病毒的含量等。反转录PCR（RT-PCR）

检测样品2.PCR的原理：4.PCR反应过程：板书3.PCR的条件：1.PCR的概念：课堂练习

根据引物延伸方向应为5′→3′，且PCR只能扩增两个引物之间的DNA序列。由DNA模板链的方向与引物方向相反可知，只有选择引物②和引物③才可以完成对T-DNA的扩增。

1.下图是某DNA分子中插入T-DNA后获得的突变体DNA，插入位点两侧限制酶切点序列未知，T-DNA两端的引物①-④序列已知，如图所示。选择合适的引物组合，通过PCR扩增获得T-DNA片段，并说明理由。2.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，原理如图所示：在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当Taq酶催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧