离体豚鼠回肠法评价中药注射剂安全性标准

ICS**.***.**

CCSC**

团体标准

T/TPPA***–2022

离体豚鼠回肠法评价中药注射剂抗过敏反

应操作规程

Operatingproceduresforevaluating

antiallergicreactionoftraditionalChinesemedicineinjection

byisolatedguineapigileummethod

****–**-**发布****–**-**实施

天津市医药行业协会发布

T/TPPA000-2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。

本文件由天津市医药行业协会归口。

本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津大学、天津市药品检验研究院、

天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室、现代中

医药海河实验室、河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。

本文件主要起草人：鞠爱春、高文远、华晓东、李霞、李德坤、岳洪水、张俊华、周水

平、周立华、万梅绪、王冲、徐琳、张燕欣、李智、何毅、白晓丽、江昕、张松梅。

本标准是首次发布。

I

T/TPPA***-2022

T/TPPA***-2022

离体豚鼠回肠法评价中药注射剂抗过敏反应操作规程

1范围

本标准规定了利用豚鼠静息离体肠、乙酰胆碱(Ach)诱导的离体肠、KCl诱导的离体肠、

CaCl2诱导的离体肠和His诱导的离体肠试验评价中药注射剂安全性的试验方法，并对相应的

试验方法进行了描述。

本标准适用于所有中药注射剂。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的

引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所

有的修改单）适用于本文件。

GB14925-2010实验动物、环境及设施

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

3.1回肠（Ileum）

指连接空肠和盲肠的一段小肠，形状弯曲，位于哺乳动物的小肠中十二指肠和空肠后方

的部分，其后连接大肠。

3.2组胺（His，Histamine）

是一种有机含氮化合物，是由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的。许多组织，特别是皮肤、

肺和肠黏膜的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏反应时，都可

释放组胺。组胺有强烈的舒血管作用，并能使毛细血管和微静脉的管壁通透性增加，血浆漏

入组织，导致局部组织水肿。

3.3乙酰胆碱（Ach，acetylcholine）

是一种神经递质。在组织内迅速被胆碱酯酶破坏。乙酰胆碱能特异性地作用于各类胆碱

受体，但其作用广泛，选择性不高。

4检测原理

豚鼠离体回肠收缩实验是筛选抗Ⅰ型变态反应性疾病药物的有效、简便手段之一。回

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肠平滑肌收缩依赖细胞内Ca2+介导，通过兴奋收缩耦联过程而实现；而游离Ca2+通常是由

细胞外Ca2+内流及细胞内Ca2+释放而获得。

过敏介质组胺（His）及乙酰胆碱（Ach）是引起回肠平滑肌收缩及诱发变态反应的主

要递质，而且Ach、His又为M、H1受体完全激动剂，Ach和His分别与M1受体和H1

受体结合，通过G蛋白介导激活磷脂酶C(PLC)，PLC使4,5二磷酸肌醇磷脂(PIP2)水解为

二酰甘油(DAG)及1、4、5-三磷酸肌醇(IP3)。DAG在细胞膜上激活蛋白激酶C(PKC)，使

靶蛋白磷酸化，激活钙通道，使细胞外钙内流增加。维拉帕米主要影响平滑肌细胞膜上电

压依赖性钙通道(Potentialdependentchannel，PDC)，影响Ca2+跨膜内流，致平滑肌松弛。

高K+使平滑肌膜除极化，引起PDC开放，Ca2+跨膜内流导致平滑肌收缩。

本标准通过建立豚鼠回肠收缩模型，评价不同注射剂对豚鼠回肠的作用，从而对其安全

性进行评价。

5试剂与材料

5.1试剂

CaCl2，MgCl2，KCl，NaHCO3，NaH2PO4，NaCl和葡萄糖均为分析纯。

乙酰胆碱（Ach）：99%

组胺：≥97.0%

5.2仪器

组织器官灌流装置，生物信号采集处理系统。

5.3实验动物

豚鼠，雌雄均可，体重为200±50g，实验用鼠于18-29℃条件下适应性饲养一周以后进

行实验。实验动物的饲养和处理严格按照《实验动物、环境及设施》（GB14925-2010）和

《实验室生物安全通用要求》（GB19489）执行。

5.4试剂配制

Tyrode’s液的配制:NaCl136.9mmoL;KCl2.7mmoL;CaCl21.8mmoL;MgCl21.1mmoL;

NaHCO311.9mmoL;NaH2PO40.4mmoL;葡萄糖5.6mmoL（均为1000mL液体中所需的

物质的量），pH=7.4。临用现配。

6实验方法

6.1离体标本制备

将豚鼠适应性饲养一周，于实验前一天禁食12h，自由饮水。处死后，迅速取出回肠，

将内容物用0℃的Tyrode’s液冲洗干净，剪成2cm左右的肠段。用细线将肠段一端悬挂于

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通气挂钩，另一端与张力换能器相连，置于盛放有37℃Tyrode’s液的麦氏水浴槽中，并缓

慢通入95%O2和5%CO2的混合气体，控制气体流速在2-3个气泡/秒。调整前负荷在1.5g，

平衡1h，期间每20min更换一次新鲜的Tyrode’s营养液，待肠平滑肌自发性收缩运动处于

平衡状态后进行后续实验。

6.2供试品对静息离体肠的影响

离体肠段平衡后，依次加入不同终质量浓度的供试品，每次加药后平衡3min，记录平

滑肌收缩曲线，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入

前相比有显著性差异(P<0.05)，表明所加入的供试品对静息离体肠平滑肌的收缩有抑制作用。

按照如下公式计算其抑制率：抑制率=(给药前回肠收缩平均张力-给药后回肠收缩平均

张力)/给药前回肠收缩平均张力×100%，抑制率越大表明对静息离体肠的抑制作用越强。

6.3供试品对Ach诱导的离体肠收缩的影响

6.3.1Ach诱导的离体肠收缩模型的建立

待回肠收缩曲线稳定后，加入10-7.5-10-4.5mol/L范围的Ach，平衡3min，记录加入Ach

前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入Ach后收缩张力明显升高，且与加入前

相比有显著性差异(P<0.05)，表明Ach诱导的离体肠收缩模型制备成功。

6.3.2供试品对Ach引起的豚鼠离体肠平滑肌收缩异常的影响

按照上述方法制备Ach诱导的离体肠收缩模型，将造模后离体肠中加入一定质量浓度的

供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过

张力值参数比较作用强弱。

加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异(P<0.05)，表明所加入

的供试品对Ach诱导的平滑肌收缩有抑制作用，说明该供试品是M受体的拮抗剂，其抗过

敏作用是通过M受体调节的。按照6.2所示公式进行抑制率的计算，抑制率越大表明对Ach

诱导的离体肠的抑制作用越强，抗过敏作用越强。

6.4供试品对KCl诱导的离体肠收缩的影响

6.4.1KCl诱导的离体肠收缩模型的建立

待回肠收缩曲线稳定后，加入10-5.0-10-0.5mol/L范围的KCl，平衡3min，记录加入KCl前

后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入KCl后收缩张力明显升高，且与加入前相

比有显著性差异(P<0.05)，表明KCl诱导的离体肠收缩模型制备成功。

6.4.2供试品对KCl引起的豚鼠离体肠平滑肌收缩异常的影响

3

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按照上述方法制备KCl诱导的离体肠收缩模型，将造模后离体肠中加入一定质量浓度的

供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过

张力值参数比较作用强弱。

加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异(P<0.05)，表明所加入

的供试品对KCl诱导的平滑肌收缩有抑制作用，说明该供试品是Ca2+离子通道阻滞剂，通

过影响K+使平滑肌膜除极化，引起电压依赖性钙通道开放，从而抑制Ca2+内流，舒张平滑

肌痉挛，发挥抗过敏作用。按照6.2所示公式进行抑制率的计算，抑制率越大表明对KCl

诱导的离体肠的抑制作用越强，抗过敏作用越强。

6.5供试品对CaCl2诱导的离体肠收缩的影响

6.5.1CaCl2诱导的离体肠收缩模型的建立

-4.5-1.5

待回肠收缩曲线稳定后，加入10-10mol/L范围的CaCl2，平衡3min，记录加入CaCl2

前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入CaCl2后收缩张力明显升高，且与加入

前相比有显著性差异(P<0.05)，表明CaCl2诱导的离体肠收缩模型制备成功。

6.5.2供试品对CaCl2引起的豚鼠离体肠平滑肌收缩异常的影响

按照上述方法制备CaCl2诱导的离体肠收缩模型，将造模后离体肠中加入一定质量浓度

的供试品，平衡3min，记录加入药物加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，

通过张力值参数比较作用强弱。

加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异(P<0.05)，表明所加入

2+

的供试品对CaCl2诱导的平滑肌收缩有抑制作用，说明该供试品是Ca离子通道阻滞剂，通

过抑制Ca2+内流，舒张平滑肌痉挛，发挥抗过敏作用。按照6.2所示公式进行抑制率的计算，

抑制率越大表明对CaCl2诱导的离体肠的抑制作用越强，抗过敏作用越强。

6.6供试品对His诱导的离体肠收缩的影响

6.6.1His诱导的离体肠收缩模型的建立

待回肠收缩曲线稳定后，加入10-8.5-10-4.5mol/L范围的His，平衡3min，记录加入His前后

3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入His后收缩张力明显升高，且与加入前相比

有显著性差异(P<0.05)，表明His诱导的离体肠收缩模型制备成功。

6.6.2供试品对His引起的豚鼠离体肠平滑肌收缩异常的影响

按照上述方法制备His诱导的离体肠收缩模型，将造模后离体肠中加入一定质量浓度的

供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过

张力值参数比较作用强弱。

4

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加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异(P<0.05)，表明所加入

的供试品对His诱导的平滑肌收缩有抑制作用，说明该供试品是H1受体的拮抗剂，其抗过敏

作用是通过H1受体调节的。按照6.2所示公式进行抑制率的计算，抑制率越大表明对His诱导

的离体肠的抑制作用越强，抗过敏作用越强。

7统计学处理及判定

采用统计分析处理软件，对实验数据进行统计学分析，实验数据以x±s表示，各给药

组给药前后进行比较，*P＜0.05表示为存在显著性差异。

当供试品对Ach诱导的离体肠、His诱导的离体肠、CaCl2诱导的离体肠和His诱导的

离体肠4种收缩模型中≥1种具有抑制作用，表明该供试品具有抗过敏作用。

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目次

前言............................................................................................................................I

1范围.....................................................................................................................1

2规范性引用文件.................................................................................................1

3术语和定义.........................................................................................................1

4检测原理.............................................................................................................1

5试剂与材料.........................................................................................................1

6实验方法.............................................................................................................2

7统计学处理....................................................................................