（正式版）T∕JSBME 0002-2026 细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法

Specificationofcharacteristicsandmeasurementmethodofmagneticnanobeadsfor江苏省生物医学工程学会发布请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件起草单位：东南大学，华道(上海)生物医药有限公司，南京东纳生物科技有限公司，中国医学科学院基础医学研究所，南京驯鹿生物医药有限公司，南京市计量监督检测院（国家生物技术药物产业本文件主要起草人：张宇，张时音，吉永新，余学军，狄升蒙，许海燕，温涛，崔颜，董海姣，武昊安，马明，顾宁，张昕宇，林学勇，胡济民，吴晓磁性纳米材料因其丰富的磁学性能及良好的生物相容性，在生物医学领域具有广泛的应用，如磁共振成像、药物递送、磁热疗、生物分离与检测等。随着纳米生物技术和免疫细胞治疗的快速发展，磁性纳米材料在细胞治疗领域发挥着不可替代的作用，已经成为细胞分选的重要核心材料。为了指导该类材料的研发、生产及应用，本文件提供了基础特性及测量方超顺磁性为核心磁学特征。该类磁珠具有很好的特异性，可高效标记目标细胞，同时具有极好的悬浮稳定性，避免了磁珠团聚对细胞分选效率及细胞活性的影响。然而，因为纳米级尺寸以及较弱的磁响应性，不能使用常规磁铁进行分离，须借助磁分选柱强化磁场梯度实现高效分离。现有国内及国际标准虽然给出了磁性纳米材料的通用测量方法，但细胞分选纳米磁珠在具体适用性上存在独特性，因此本文件依据其特有性能建立了适用于上下游应用的特性指标体系及测量方法。由于该类纳米磁珠应用于细胞分选，安全性依据药品检测要求，比如无菌检测（中华人民共和国本文件针对细胞分选纳米磁珠建立了系列的特性指标及对应的测量方法。其他一些相关性能（如 1 1 1 3 3 8 9 1细胞分选用纳米磁珠的特性和测量方法本文件适用于粒径在1nm~100nm范围、表面标记抗体等生物活性分子、用于细胞分选并具有超顺下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适GB/T6682分析实验室用水规格GB/T32671.2-2019胶体体系zGB/T37966-2019纳米技术氧化铁纳米颗粒GB/T39729-2020细胞纯度GB//T40171-2021磁珠法DNA提取纯化试GB/T42076-2022生物技术细GB/Z26082-2010纳米材料直流磁化率(磁矩GB/Z43592.1-2023纳米技术磁性纳米材料第WS/T360-2011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南ISO23033:2021Biotechnology—AnalyttestingandcharacterizationofcellulartherapeuticproductsGB/Z43592.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便阅读和使用，本文件重复列出一种表面经过了功能化修饰，包被有生物活性基团的功能化载体，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能快速分散，具有超顺磁性的一种磁性纳米级球状或无定形颗在指定测量条件下用特定的测量方法确定的颗粒的线性2在场流分级（如磁场）分离系统中，样品中的分析物悬浮于流动相后，通过分离系统时未被分离细胞分选后实际回收的目标细胞数量，占分选前原始样本中目标细胞数量的百分3任何非故意引入的、并非原料药或药品生产工艺预期组成部分的4缩略语BCA：2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸（[2,2'-biquinoline]-4,4'-dicarboxylicaDLS：动态光散射粒度仪（dynamiclightscattering）EU：内毒素单位（endotoxinuNHS：N-羟基琥珀酰亚胺（N-HydroxysuccinimSQUID：超导量子干涉器磁强计（superconductingquantuminterferencVSM：振动样品磁强计（vibratingsamplemagnetometr对细胞分选用纳米磁珠悬浮液进行质量测量时，主要理化性质、生物学性能和安全性能指标及其特征单位测量方法参考标准或方法水动力直径及粒径分布nm动态光散射GB/T29022-2012Zeta电位mV电泳光散射GB/T32671.2、GB/Z42353-2023铁浓度mg/mL邻菲啰啉分光光度法GB/T37966-2019饱和磁化强度emu/g直流磁化率测量方法GB/Z26082蛋白偶联量µg/mg蛋白质含量测定法中华人民共和国药典[1]细胞分选效率和纯度%流式细胞术GB/T39729-2020、WS/T360-2024污染物/无菌检查法、细菌内毒素检查法、支原体检查法中华人民共和国药典[2-4]水动力直径可以体现溶液中颗粒的内核以及表面修饰层与水化层的总体尺寸，还能反映颗粒在溶4当一束单色激光照射到悬浮液中的颗粒时，会产生散射光。由于颗粒在液体中的布朗运动，各个颗粒散射光的位相或频率会发生随机变化，观察到的散射光是散射体积内所有颗粒散射光的相干叠加，因此散射光强也将随时间涨落。通过分析这些散射光强度随时间涨落的相关性，可得到颗粒的扩散系数，进而根据斯托克斯-爱因斯坦方程计算得到颗粒的流体动力学直径。[5]使用水稀释样品至0.1mg/mL（以铁浓度计量），也可增加浓度但不超过1mg/mL，测量体积不少按照GB/T29022-2012的方法进行测量。将1mL样品加入测试皿中，测试水动力直径，至少进行三次测量，记录每次测量的水动力直径d（nm）和多分散指数PI。计算d和PI的平通过测量某一特定位置颗粒速度，从而得到颗粒相对于管壁的移动速度和移动方向，只要已知电的本质、表面电荷（通常由pH值决定）、溶液的电解质浓度、溶剂与电解质的本质来共同决定[7]。动态光散射仪、测试皿、稀释液；仪器处于校准有将稀释后的1mL样品加入测试皿中，进行三次测量，计算Zeta电位平均值及标准偏差。水溶液体系下磁性纳米颗粒的铁浓度测量按照GB/T37966-2019附录中的邻菲啰啉分光光度法使用邻菲啰啉分光光度法进行测试，对样品中纳米磁珠进行酸溶解，用盐酸羟胺将溶液中的Fe3+还原为Fe2+，利用Fe2+与邻菲啰啉在pH=3~9条件下生成稳定橙红色络合物的原理，通过测量其在510nm处的吸光度计算铁浓度。5设备耗材：紫外-可见光分光光度计、超声波清洗仪、50mL和100mL的容量瓶、比色皿。仪器和试剂：盐酸羟胺溶液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液、邻菲啰啉溶液、醋酸-醋酸钠缓冲液配置方法如5.5.3.1.铁浓度标准曲线绘制液中至2mL，在超声仪中超声不少于15分钟，所得液体为黄色；加入1mL盐酸羟胺溶液，再于5分钟；加入2mL邻菲啰啉溶液，摇匀后再加入2mL氢氧化钠溶液，所得液体由淡黄变成红色；加入5mL醋酸-醋酸钠缓冲液，摇匀静置20分钟；最后加入水至50mL，用紫外-可见光分光光度计测量其在510nm处的吸光度。将吸光度数据同对应的铁质量浓度进行线）：A——溶液在510nm处的吸光度；k——斜率常数；），法显色后，定容到50mL，对其进行吸光度的测量，根据以上方程分别计算出质量浓度，取平均值后折算出待测溶液中铁元素质量浓度，单位为标准曲线线性应大于0.99，应选测试中标准曲线线性范围内中间浓度作为合适浓度，并进行三宜使用已知浓度的参考氧化铁纳米颗粒悬浮利用电磁感应定律测量纳米材料的直流磁化率(磁矩)，通过测量样品在强磁场中的磁矩饱和值推导出饱和磁化强度。直流磁化率测量通常使用超导量子干涉器磁强计（SQUID）或振动样品磁强计6超导量子干涉器磁强计（SQUID）或振动样品磁强计（VSM）、液体样品管；仪器处于校准有效以纳米磁珠悬浮液形式进行测量，铁浓度要求大于1mg/mL。对于浓度较低的样品，可采用超滤注：一般情况下，采用抗体等生物分子对磁性纳米颗粒进行修饰的过程，对饱和磁化强度的影响线，得到饱和磁化强度，按照测试样品中铁质量进行归一化，得到单位质量饱和磁化强度，单位emu/g抗体等蛋白质与磁性纳米颗粒偶联后，收集未与磁性纳米颗粒偶联的蛋白，参照《中华人民共和本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，BCA与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定样品中蛋仪器设备：恒温仪、紫外-可见光分光光度计或酶标仪、高速离心机或磁力架和磁分离柱，仪5.7.3.1.对照品溶液的制备除另有规定外，取牛血清白蛋白对照品或蛋白质含量测定国家标准样品，加水溶解并制成标准溶5.7.3.2.待测品溶液的制备使用磁分离柱分离抗体等蛋白偶联后的纳米磁珠，磁场作用下收集流穿液（磁分离柱下端流出的液体）作为待测溶液。或者使用高速离心方式，获得不含纳米颗粒的上清液作为待测溶液（例如，对可采用20000×g、20分钟离心）。若上清液中或流传液中含有残留待测溶液可直接取样或稀释后测量（蛋白质浓度应在标准曲线测量BCA法测试蛋白质含量时需考虑干扰因素，如还原剂、金属离子、螯合剂等，尤其是使用了NHS7具体操作步骤参照《中华人民共和国药典》第四部0731中蛋白质含量测定法及试剂盒说明书进行蛋白质投料量减去未结合的蛋白质量即为蛋白质偶联量，并计算纳米磁珠单位质量上抗体量通过细胞分选用纳米磁珠对目标细胞的特异性生物学特征（如抗原、受体、糖蛋白等）进行靶向标记，经磁分离实现目标细胞与杂细胞的分离，分别对细胞分选的纯度及效率进行测细胞分选纯度是分选后目标细胞占总细胞的百分率。采用流式细胞术，依据总细胞与目标细胞在散射光、荧光信号等光学特性上的差异，对分选后目标细胞进行识别、区分与定量计数，得到分选后细胞分选效率是分选前、后目标细胞数量的比值。采用流式细胞术和细胞计数，分别测量分选前、后的目标细胞占比和总细胞数量，计算分选后获得的目标细胞数量占分选前初始目标细胞数量的百分仪器：细胞计数仪或细胞计数板与显微镜、流式细胞仪，仪器处于校准有效使用与荧光染料标记的抗体相同种属来源、同种免疫球蛋白的相同亚型的相同剂量抗体染色的细使用两个和两个以上的荧光染料或荧光染料标记抗体组合标记细胞样本时，在完整的染色基础上使用减少一种荧光染料或荧光染料标记抗体进行细胞染色的待测细胞样本作为荧光扣除对染色时应避免与磁珠上的抗体使用同一表位的抗体，应使用不同克隆号或不同表位抗体进行流式采用两种及以上染料组合方案进行细胞计数时或光学检测通道的电压及增益发生变动时，需要进行荧光补偿。荧光补偿样品进样完成后，根据仪器操作软件的指示a)使用细胞计数仪或细胞计数板，按照GB/T42076-2022规定的方法，测量样本的总活细胞浓b)用待测细胞与纳米磁珠结合，磁场条件下进行磁分离，去掉未结合的细胞。撤掉磁场，收集c)参照GB/T39729-2020中规定的方法，采用荧光标记抗体分别对分选前后样本中的目8进行染色，按照流式细胞仪使用说明操作，测量分选前后细胞中目标细胞亚群所占百分比，分别记为E——目标细胞分选效率；Ps——分选后所得细胞中目标细胞亚群占比，即为目标细胞的分选纯度；Nt——分选前总细胞数量，单位为个Pt——分选前总细胞中目标细胞亚群占比。微生物污染会影响细胞活性和功能。微生物检测包括无菌检查、支原体检查和内毒素检查。测量方法和步骤按照《中华人民共和国药典》第四部1101无菌检测方法、3301支原体检查法、1143细菌内毒素检查法。细胞分选纳米磁珠应无菌、无支原体，低纳米磁珠的分选性能会随着储存条件而发生变化，某一次测量数据的绝对偏差与原数据的百分比水动力尺寸（5.3）和细胞分选效率与纯度（5.8）作为稳定性的监测指标，应磁性纳米颗粒磁性纳米颗粒抗体细胞分选用纳米磁珠A.2水动力直径及粒径分布(动态光散0