环状RNAZKSCAN1对肝癌细胞干性抑制机制的深度剖析

环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性抑制机制的深度剖析一、引言1.1研究背景与意义肝癌作为全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直居高不下，给社会和家庭带来了沉重负担。据统计，肝癌在全球癌症相关死亡原因中位居前列，严重影响患者的生存质量和预期寿命。肝细胞癌（HCC）作为肝癌的主要组织学类型，占原发性肝癌病例的75%-85%，大多数患者确诊时已处于晚期，预后极差。由于肝癌发病隐匿，早期症状不明显，多数患者在确诊时肿瘤已经发生转移，错过了最佳治疗时机。此外，肝癌对传统化疗和放疗的敏感性较低，且容易产生耐药性，使得治疗效果受到很大限制，患者的总体存活率仍然很低，因此，肝癌的早期诊断和有效治疗一直是医学领域亟待解决的重大问题。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，非编码RNA在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。环状RNA（circRNA）作为一类新型的非编码RNA，具有独特的结构和生物学功能，在肿瘤的发生、发展、转移等过程中发挥着重要的调控作用。circRNA是通过反向剪接形成的共价闭合环状结构，没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾，因此具有较高的稳定性，不易被RNA酶降解。circRNA在不同组织和细胞中呈现出特异性表达，且其表达水平与肿瘤的恶性程度、转移潜能等密切相关。越来越多的研究表明，circRNA可以通过多种机制参与肿瘤的调控，如作为miRNA海绵吸附miRNA，从而解除miRNA对其靶基因的抑制作用；与RNA结合蛋白相互作用，影响基因的转录和翻译过程；甚至某些circRNA还可以编码多肽，发挥生物学功能。ZKSCAN1是一种转录因子，已被证实在多种恶性肿瘤中具有抑制作用。它可以通过调节下游基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学行为。在肝癌中，ZKSCAN1的表达水平通常较低，其低表达与肝癌的不良预后密切相关。然而，目前关于ZKSCAN1在肝癌中的具体作用机制尚未完全明确。circRNA-ZKSCAN1作为一种与ZKSCAN1相关的环状RNA，其在肝癌中的作用及机制研究更是鲜有报道。研究circRNA-ZKSCAN1在肝癌细胞中的功能及调控机制，不仅有助于深入了解肝癌的发病机制，还可能为肝癌的治疗提供新的靶点和策略。本研究旨在探讨环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的机制，通过深入研究circRNA-ZKSCAN1在肝癌细胞中的作用及分子机制，有望揭示肝癌发生发展的新机制，为肝癌的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供理论依据和实验基础。具体而言，本研究的结果可能有助于发现新的肝癌生物标志物，提高肝癌的早期诊断率；为开发新的肝癌治疗药物提供潜在的靶点，改善肝癌患者的治疗效果和预后；进一步丰富和完善circRNA在肿瘤发生发展中的调控机制，拓宽circRNA的研究领域，为肿瘤生物学的发展做出贡献。1.2国内外研究现状近年来，环状RNA在肿瘤研究领域逐渐成为热点，国内外学者围绕环状RNA与肝癌的关系开展了广泛研究。在国外，一些研究通过高通量测序技术全面分析了肝癌组织和正常肝组织中环状RNA的表达谱，发现许多环状RNA在肝癌中存在差异表达。例如，有研究发现circRNA-100290在肝癌组织中显著上调，其高表达与肝癌患者的不良预后相关，进一步研究表明，circRNA-100290可以通过吸附miR-141-3p，上调其靶基因ZEB1的表达，从而促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。还有研究报道了circRNA-0001649在肝癌中的作用，该环状RNA通过与miR-375相互作用，调控下游靶基因的表达，影响肝癌细胞的糖代谢和肿瘤生长。在国内，关于环状RNA与肝癌的研究也取得了不少成果。有研究团队发现circRNA-0008033在肝癌组织中低表达，其表达水平与肝癌患者的肿瘤大小、TNM分期和预后密切相关。功能实验表明，circRNA-0008033过表达可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，机制研究揭示其通过吸附miR-214，上调肿瘤抑制基因PTEN的表达，发挥抑制肝癌进展的作用。此外，国内学者还研究了一些环状RNA在肝癌耐药中的作用，发现circRNA-0000520可以通过调控miR-125b-5p/ABCB1轴，参与肝癌细胞对索拉非尼的耐药过程。对于转录因子ZKSCAN1，国内外研究也表明其在多种恶性肿瘤中发挥抑制作用。在乳腺癌中，ZKSCAN1可以通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。在结直肠癌中，ZKSCAN1的低表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关，其可能通过调控上皮-间质转化过程，影响结直肠癌细胞的恶性行为。然而，在肝癌中，虽然已有研究证实ZKSCAN1表达降低与肝癌的不良预后相关，但关于ZKSCAN1在肝癌细胞干性维持中的具体作用机制，国内外研究仍相对较少，尚未完全阐明其调控网络。目前关于环状RNA-ZKSCAN1的研究则更为有限。虽已知环状RNA-ZKSCAN1在肝癌中存在表达差异，但其在肝癌细胞干性调控中的具体功能和作用机制，国内外均鲜有报道。在肝癌细胞干性相关研究中，虽然已经明确了一些关键信号通路和分子标志物，如Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路以及干性标志物CD133、EpCAM等在维持肝癌细胞干性中的重要作用，但对于环状RNA-ZKSCAN1如何参与肝癌细胞干性的调控，是否通过与已知的信号通路或干性标志物相互作用来发挥功能，目前还不清楚。现有研究的不足为进一步深入探究环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的机制提供了研究空间和方向。1.3研究目的与方法本研究旨在深入探讨环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的具体机制，为肝癌的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点。通过一系列实验，明确circRNA-ZKSCAN1在肝癌细胞干性调控中的作用，解析其作用的分子机制，为肝癌的精准治疗奠定基础。为实现上述研究目的，本研究拟采用以下研究方法：细胞实验：选用人肝癌细胞系HepG2、Huh7等，以及肝癌干细胞分离株（如CD133+细胞）进行实验。通过细胞培养技术，在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素的DMEM培养基中，维持细胞的正常生长和传代。利用慢病毒载体构建circRNA-ZKSCAN1过表达和干扰细胞系，以及相应的对照细胞系。通过CCK-8实验检测细胞增殖能力，平板克隆形成实验评估细胞克隆形成能力，Transwell实验分析细胞迁移和侵袭能力，体外成球实验检测肝癌细胞的干性特征，探究circRNA-ZKSCAN1对肝癌细胞生物学行为的影响。分子生物学技术：运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，检测circRNA-ZKSCAN1、干性标志物（如CD133、EpCAM、SOX2等）以及相关信号通路分子在肝癌细胞中的表达水平，明确circRNA-ZKSCAN1与干性标志物及信号通路分子表达的相关性。采用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测相关蛋白的表达水平，验证qPCR结果，并进一步分析circRNA-ZKSCAN1对相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响，揭示其在信号通路调控中的作用。RNA-蛋白质相互作用研究：利用RNApull-down实验，结合质谱分析技术，筛选与circRNA-ZKSCAN1相互作用的蛋白质。通过RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）实验，验证circRNA-ZKSCAN1与候选蛋白质之间的相互作用，明确其在细胞内的结合方式和结合位点，为深入解析其作用机制提供线索。动物实验：建立裸鼠皮下荷瘤模型，将过表达或干扰circRNA-ZKSCAN1的肝癌细胞接种到裸鼠皮下，观察肿瘤的生长情况，定期测量肿瘤体积和重量。通过免疫组织化学染色（IHC）检测肿瘤组织中干性标志物、相关信号通路分子的表达，以及Ki-67等增殖标志物的表达，从动物水平验证circRNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性和肿瘤生长的影响。生物信息学分析：借助生物信息学数据库和分析工具，预测circRNA-ZKSCAN1的潜在靶基因、结合的miRNA以及参与的信号通路。对高通量测序数据进行分析，挖掘与circRNA-ZKSCAN1相关的差异表达基因和信号通路，为实验研究提供理论依据和研究方向，进一步深入解析circRNA-ZKSCAN1在肝癌细胞干性调控中的分子机制。二、相关理论基础2.1肝癌细胞干性2.1.1肝癌细胞干性概念肝癌细胞干性是指肝癌细胞所具有的类似于正常干细胞的特性，包括自我更新能力和多向分化潜能。具有干性的肝癌细胞能够在体内不断增殖，维持肿瘤的生长，并可以分化为不同类型的癌细胞，形成异质性的肿瘤群体。这种特性在肝癌的发生、发展、转移和复发过程中起着至关重要的作用。在肝癌的发生阶段，干性肝癌细胞可能起源于正常肝脏干细胞的恶变，或者是已分化的肝癌细胞通过去分化等机制获得干性。这些干性细胞能够逃避机体的免疫监视，不断自我更新，逐渐形成肿瘤的起始细胞群体，为肿瘤的形成奠定基础。在肝癌发展过程中，干性肝癌细胞持续增殖，推动肿瘤体积不断增大。同时，它们还能分化为不同表型的癌细胞，使得肿瘤细胞群体呈现出高度的异质性，增加了肿瘤的复杂性和治疗难度。肝癌细胞干性对肝癌治疗的影响也极为显著。由于干性肝癌细胞具有较强的自我更新能力和抗凋亡特性，它们对传统的化疗、放疗等治疗手段具有较高的抵抗性。常规治疗往往难以彻底清除干性肝癌细胞，导致肿瘤容易复发和转移。临床研究发现，在肝癌患者接受手术切除或化疗后，残留的干性肝癌细胞会在适宜的条件下重新增殖，引起肿瘤的复发。因此，深入了解肝癌细胞干性的调控机制，寻找针对干性肝癌细胞的有效治疗策略，对于提高肝癌的治疗效果、降低复发率和改善患者预后具有重要意义。2.1.2干性标志物肝癌细胞干性标志物是一类能够特异性标识具有干性的肝癌细胞的分子，在研究肝癌细胞干性以及肝癌的诊断、治疗和预后评估等方面具有重要意义。常见的肝癌细胞干性标志物包括EpCAM、CD133等。EpCAM（上皮细胞黏附分子）是一种跨膜糖蛋白，在肝癌干细胞中高表达。它参与细胞间的黏附、信号传导和细胞增殖等过程。通过免疫组化、流式细胞术等方法可以检测EpCAM的表达水平。在肝癌组织中，EpCAM阳性的细胞往往具有更强的自我更新能力和致瘤性，能够在体内形成肿瘤，并且与肝癌的转移和不良预后密切相关。CD133，也称为Prominin-1，是一种五跨膜糖蛋白，最初被鉴定为造血干细胞的标志物，后来发现其在肝癌干细胞中也高度表达。研究表明，CD133+的肝癌细胞具有更强的干性特征，如自我更新、分化潜能和耐药性等。检测CD133的方法主要有流式细胞术、免疫荧光染色和qPCR等。在临床实践中，CD133的表达水平可以作为评估肝癌患者预后的指标之一，CD133高表达的患者往往预后较差，肿瘤复发和转移的风险更高。除了EpCAM和CD133，还有一些其他的干性标志物，如SOX2、OCT4、Nanog等转录因子。SOX2在维持肝癌细胞干性中发挥关键作用，它可以调控一系列与干性相关基因的表达，促进肝癌细胞的自我更新和肿瘤形成。OCT4和Nanog同样参与干性调控网络，它们与SOX2相互作用，共同维持肝癌细胞的干性状态。通过qPCR、Westernblotting等技术可以检测这些转录因子的表达情况，研究它们在肝癌细胞干性调控中的作用机制。这些干性标志物不仅为研究肝癌细胞干性提供了重要的工具，也为肝癌的精准诊断和靶向治疗提供了潜在的靶点，有助于开发更加有效的肝癌治疗策略。2.2环状RNA概述2.2.1环状RNA结构与特点环状RNA是一类通过特殊的反向剪接方式形成的非编码RNA分子，其结构与传统的线性RNA有着显著的区别。在反向剪接过程中，上游外显子的3'端与下游外显子的5'端直接连接，形成了一个共价闭合的环状结构。这种独特的闭环结构使得环状RNA没有游离的5'端和3'端，赋予了其许多特殊的性质。稳定性高是环状RNA最为突出的特点之一。由于缺少可被核酸外切酶识别的末端，环状RNA对核酸外切酶具有较强的抗性，不易被降解，在细胞内的半衰期明显长于线性RNA。研究表明，一些环状RNA在细胞内的半衰期可达数天甚至数周，而大多数线性RNA的半衰期通常只有几个小时。这种高稳定性使得环状RNA能够在细胞内持续发挥其生物学功能，为其参与基因表达调控等过程提供了基础。环状RNA还具有表达特异性。它们在不同组织、不同发育阶段以及不同疾病状态下呈现出特异性的表达模式。在胚胎发育过程中，某些环状RNA的表达水平会随着发育进程发生显著变化，对胚胎的正常发育起到重要的调控作用。在肿瘤组织中，也有许多环状RNA的表达出现异常，与肿瘤的发生、发展密切相关。这种表达特异性为环状RNA作为疾病诊断标志物和治疗靶点提供了潜在的可能性。此外，部分环状RNA还具有保守性，在不同物种间具有相似的序列和结构，提示它们在进化过程中可能承担着重要且保守的生物学功能。2.2.2环状RNA功能环状RNA在细胞内具有多种重要的生物学功能，对基因表达调控和细胞生理过程起着关键的调节作用。其中，作为miRNA海绵是环状RNA最为人们熟知的功能之一。许多环状RNA含有多个与miRNA互补配对的结合位点，能够特异性地吸附miRNA，从而阻断miRNA与靶mRNA的相互作用，解除miRNA对靶基因的抑制，促进靶基因的表达。例如，在肝癌中，circRNA-0001649可以通过吸附miR-375，上调其靶基因的表达，进而影响肝癌细胞的糖代谢和肿瘤生长。这种miRNA海绵机制使得环状RNA能够在转录后水平对基因表达进行精细调控，参与细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。环状RNA还能与RNA结合蛋白（RBP）相互作用，参与基因表达的调控。它们可以作为RBP的分子支架，招募RBP形成复合物，影响RBP的功能和定位，从而调控mRNA的转录、剪接、转运和翻译等过程。有研究发现，某些环状RNA能够与特定的RBP结合，调节其与mRNA的结合亲和力，进而影响mRNA的稳定性和翻译效率。在神经细胞中，一些环状RNA与RBP结合后，参与调控神经递质的合成和释放，对神经系统的正常功能维持至关重要。虽然大多数环状RNA被认为是非编码RNA，但近年来的研究发现，少数环状RNA可以编码多肽或蛋白质。这些环状RNA通常含有内部核糖体进入位点（IRES），能够招募核糖体启动翻译过程，产生具有生物学活性的多肽或蛋白质。这些由环状RNA编码的产物可能在细胞内发挥独特的功能，参与细胞信号传导、代谢调节等过程，为环状RNA的功能研究开辟了新的领域。此外，环状RNA还可能参与染色质重塑、DNA甲基化等表观遗传调控过程，对基因表达进行更为深层次的调控，进一步丰富了其在细胞生物学中的功能内涵。2.3ZKSCAN1简介2.3.1ZKSCAN1结构与特性ZKSCAN1是一种转录因子，属于KruppelC2H2型锌指蛋白家族成员，其基因定位于人类染色体7q22.1。ZKSCAN1蛋白结构包含多个功能域，其中最为关键的是N端的KRAB结构域和C端的SCAN结构域以及多个锌指结构域。KRAB结构域是一种转录抑制结构域，它可以与其他转录共抑制因子相互作用，通过招募组蛋白去乙酰化酶等染色质修饰相关蛋白，改变染色质的结构，从而抑制基因的转录。研究表明，KRAB结构域能够与KAP1等共抑制因子结合，形成复合物，进而抑制靶基因启动子区域的转录活性。SCAN结构域则在蛋白质相互作用中发挥重要作用，它可以介导ZKSCAN1与其他转录因子或调节蛋白之间的相互作用，形成转录调控复合物，共同调节基因的表达。多个锌指结构域赋予了ZKSCAN1与DNA序列特异性结合的能力，每个锌指结构域由约30个氨基酸组成，通过锌离子与DNA双螺旋结构的大沟相互作用，识别并结合特定的DNA序列，从而调控基因的转录过程。在细胞内，ZKSCAN1主要分布于细胞核中，这与其作为转录因子的功能相适应。它能够通过与靶基因启动子区域的特定DNA序列结合，招募转录相关的复合物，启动或抑制基因的转录。在正常细胞中，ZKSCAN1参与细胞生长、分化和发育等多种生理过程的调控。在胚胎发育过程中，ZKSCAN1的表达水平会发生动态变化，对胚胎细胞的分化和组织器官的形成起到重要的调节作用。在肝脏发育过程中，ZKSCAN1可能通过调控相关基因的表达，影响肝细胞的分化和成熟，确保肝脏正常的生理功能。2.3.2ZKSCAN1在肿瘤中的作用越来越多的研究表明，ZKSCAN1在多种肿瘤中发挥着抑制肿瘤生长和转移的作用。在乳腺癌中，ZKSCAN1被发现可以通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。PI3K/AKT信号通路在细胞的生长、存活和代谢等过程中起着关键作用，该通路的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关。ZKSCAN1可以通过直接结合到PI3K/AKT信号通路相关基因的启动子区域，抑制其转录，从而阻断该信号通路的激活，进而抑制乳腺癌细胞的恶性行为。实验数据显示，在乳腺癌细胞系中过表达ZKSCAN1后，PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低，细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制，而敲低ZKSCAN1则会导致PI3K/AKT信号通路的激活增强，细胞的恶性程度增加。在结直肠癌中，ZKSCAN1的低表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关。研究发现，ZKSCAN1可以通过调控上皮-间质转化（EMT）过程来影响结直肠癌细胞的恶性行为。EMT是上皮细胞失去极性和细胞间连接，获得间质细胞特性的过程，在肿瘤的侵袭和转移中起着关键作用。ZKSCAN1可以抑制EMT相关转录因子如Snail、Slug等的表达，从而阻止上皮细胞向间质细胞的转化，抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。临床研究数据表明，结直肠癌组织中ZKSCAN1表达越低，肿瘤的侵袭深度越深，淋巴结转移率越高，患者的预后越差。在肝癌中，ZKSCAN1同样表现出肿瘤抑制作用。已有研究证实，ZKSCAN1表达降低与肝癌的不良预后相关。其可能的作用机制包括调控细胞周期相关基因的表达，抑制肝癌细胞的增殖；诱导肝癌细胞凋亡，减少肿瘤细胞的存活；抑制肝癌细胞的侵袭和转移相关基因的表达，降低肿瘤细胞的转移能力。研究发现，在肝癌细胞系中过表达ZKSCAN1可以使细胞周期阻滞在G1期，减少S期细胞的比例，同时上调凋亡相关蛋白如Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进肝癌细胞的凋亡。此外，过表达ZKSCAN1还可以降低肝癌细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，抑制细胞的侵袭和迁移能力，这些研究结果均表明ZKSCAN1在肝癌的发生发展过程中发挥着重要的抑制作用。三、环状RNA-ZKSCAN1与肝癌细胞干性关系的研究设计3.1实验材料3.1.1细胞系本研究选用人肝癌细胞系HepG2，该细胞系是从患有肝癌的15岁白人男性青年的肝细胞癌中分离出来。HepG2细胞具有贴壁生长的特性，能够稳定表达甲胎蛋白、白蛋白等多种基因，并且表现出3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性，是肝癌研究中常用的细胞系之一。为深入探究环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性的影响，还分离了HepG2细胞中的肝癌干细胞株CD133+。CD133作为一种重要的肝癌干细胞标志物，其阳性细胞具有较强的自我更新、多向分化潜能以及肿瘤起始能力。通过对CD133+细胞的研究，可以更直接地观察环状RNA-ZKSCAN1在肝癌干细胞干性维持和调控中的作用。细胞培养过程中，HepG2及其干细胞分离株CD133+均在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素的DMEM培养基中进行培养和维持。培养环境设定为37℃、5%CO2的恒温培养箱，以确保细胞能够在适宜的条件下生长和增殖。同时，定期对细胞进行传代和冻存，以保证细胞的活性和实验的连续性。在传代时，当细胞生长至80%-90%汇合度时，采用0.25%胰蛋白酶进行消化，按照1:2-1:4的比例进行传代，以维持细胞的正常生长状态。3.1.2实验动物选用4-6周龄的BALB/c裸鼠，体重在18-22g之间。裸鼠具有免疫缺陷的特点，其T淋巴细胞功能缺失，对异种移植的肿瘤细胞不会产生免疫排斥反应，因此非常适合用于构建人肝癌细胞的裸鼠皮下荷瘤模型。在实验前，将裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）级动物房内，环境温度控制在22-25℃，相对湿度保持在40%-60%，给予充足的食物和水，使其适应环境一周后再进行实验。在实验过程中，严格遵守动物实验的相关伦理和规范，减少动物的痛苦，确保实验的科学性和可靠性。3.1.3主要试剂RNA提取试剂：采用TRIzol试剂（Invitrogen公司）从细胞和组织中提取总RNA。TRIzol试剂能够有效裂解细胞和组织，使RNA与蛋白质和DNA分离，具有操作简便、提取效率高、RNA纯度高等优点，可满足后续实验对RNA质量的要求。逆转录和qPCR试剂：逆转录试剂盒选用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），该试剂盒能够高效地将RNA逆转录为cDNA，同时去除基因组DNA的污染，保证逆转录产物的纯度和质量。qPCR试剂采用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司），其具有高灵敏度和特异性，能够准确地检测目的基因的表达水平。蛋白质相关试剂：RIPA裂解液（Beyotime公司）用于提取细胞总蛋白，其能够有效裂解细胞，释放细胞内的蛋白质，并且对蛋白质的结构和功能影响较小。BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime公司）用于测定蛋白质浓度，该方法基于蛋白质与铜离子的络合反应，通过比色法测定蛋白质含量，具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点。ECL化学发光试剂盒（ThermoFisherScientific公司）用于蛋白质免疫印迹检测，能够与辣根过氧化物酶标记的二抗反应，产生化学发光信号，从而检测目的蛋白的表达。细胞转染试剂：Lipofectamine3000（Invitrogen公司）是一种高效的脂质体转染试剂，能够将核酸分子高效地转染到细胞中，且对细胞毒性较小，可用于将过表达或干扰环状RNA-ZKSCAN1的质粒转染到肝癌细胞中。其他试剂：DMEM培养基（Gibco公司）为细胞提供生长所需的营养物质；胎牛血清（FBS，Gibco公司）含有多种生长因子和营养成分，能够促进细胞的生长和增殖；青霉素-链霉素双抗溶液（Gibco公司）用于防止细胞培养过程中的细菌污染；胰蛋白酶（Gibco公司）用于细胞的消化传代；Matrigel基质胶（Corning公司）用于Transwell实验和体外成球实验，模拟细胞外基质环境，促进细胞的迁移和干性维持。3.1.4主要仪器设备细胞培养相关仪器：CO2恒温培养箱（ThermoFisherScientific公司）提供稳定的37℃、5%CO2培养环境，确保细胞的正常生长；超净工作台（苏州净化设备有限公司）为细胞操作提供无菌环境，防止微生物污染；倒置显微镜（Olympus公司）用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况。核酸和蛋白质检测仪器：实时荧光定量PCR仪（ABIStepOnePlus，ThermoFisherScientific公司）用于定量检测基因的表达水平，具有高灵敏度、准确性和重复性；凝胶成像系统（Bio-Rad公司）用于检测核酸和蛋白质电泳后的条带，通过成像和分析软件对条带进行定量分析；蛋白质印迹转膜仪（Bio-Rad公司）用于将蛋白质从凝胶转移到膜上，以便进行后续的免疫印迹检测。其他仪器：离心机（Eppendorf公司）用于细胞和核酸、蛋白质样品的离心分离；移液器（Eppendorf公司）用于精确吸取和转移试剂和样品；低温冰箱（ThermoFisherScientific公司）用于保存试剂和样品，分为-20℃和-80℃两种，以满足不同试剂和样品的保存需求。三、环状RNA-ZKSCAN1与肝癌细胞干性关系的研究设计3.2实验方法3.2.1细胞培养与处理人肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养。定期观察细胞的生长状态，当细胞生长至80%-90%汇合度时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。传代时，将消化后的细胞以1:2-1:4的比例接种到新的培养瓶中，加入新鲜培养基继续培养。为研究环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性的影响，构建环状RNA-ZKSCAN1过表达和干扰细胞系。采用慢病毒载体系统，将环状RNA-ZKSCAN1过表达质粒或干扰质粒与包装质粒共转染至293T细胞中进行病毒包装。收集病毒上清，感染HepG2细胞及其干细胞分离株CD133+，通过嘌呤霉素筛选获得稳定表达的细胞系。同时，设置对照组，转染空载体。转染过程中，按照Lipofectamine3000试剂说明书进行操作，将质粒与Lipofectamine3000试剂混合，形成转染复合物后加入细胞中，孵育一定时间后更换新鲜培养基，继续培养。3.2.2检测指标与方法采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测环状RNA-ZKSCAN1、干性标志物（如CD133、EpCAM、SOX2等）以及相关信号通路分子的mRNA表达水平。使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRPremixExTaqII试剂进行qPCR扩增。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5s，60℃退火30s。通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）用于检测相关蛋白的表达水平。使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS凝胶电泳分离，然后转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜1小时，加入一抗（针对环状RNA-ZKSCAN1、干性标志物、相关信号通路蛋白等），4℃孵育过夜。次日，洗膜后加入相应的二抗，室温孵育1小时，使用ECL化学发光试剂盒进行显色，通过凝胶成像系统分析条带灰度值，半定量分析蛋白表达水平。利用流式细胞术检测细胞表面干性标志物（如CD133、EpCAM）的表达。收集细胞，用PBS洗涤后，加入相应的荧光标记抗体，4℃避光孵育30分钟。用PBS再次洗涤细胞，重悬于含有1%多聚甲醛的PBS中，通过流式细胞仪检测荧光强度，分析阳性细胞比例。此外，还可使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况，评估环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。3.2.3数据分析方法实验数据采用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析，所有实验均独立重复至少3次。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若方差不齐则采用非参数检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。通过统计分析，明确环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性相关指标的影响，揭示其在肝癌细胞干性调控中的作用机制。四、环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞干性的影响4.1环状RNA-ZKSCAN1表达分析为明确环状RNA-ZKSCAN1在肝癌细胞干性维持中的作用，首先运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，对肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+中环状RNA-ZKSCAN1的表达水平进行检测。以GAPDH作为内参基因，对目的基因的表达进行标准化，通过2-ΔΔCt法计算环状RNA-ZKSCAN1的相对表达量。实验结果显示，在肝癌干细胞分离株CD133+中，环状RNA-ZKSCAN1的表达水平显著低于肝癌细胞系HepG2（P<0.01），如图1所示。这一结果表明，环状RNA-ZKSCAN1的表达水平与肝癌细胞的干性状态存在密切关联，干性更强的CD133+细胞中环状RNA-ZKSCAN1表达明显降低，提示环状RNA-ZKSCAN1可能在抑制肝癌细胞干性方面发挥重要作用。【此处插入柱状图，展示HepG2和CD133+细胞中环状RNA-ZKSCAN1相对表达量对比，横坐标为细胞类型（HepG2、CD133+），纵坐标为环状RNA-ZKSCAN1相对表达量，图注为“与HepG2细胞相比，**P<0.01”】为进一步验证这一结果，对多个肝癌细胞系（如Huh7、SMMC-7721等）及其对应的干细胞分离株进行环状RNA-ZKSCAN1表达水平的检测。结果显示，在不同的肝癌细胞系及其干细胞分离株中，均呈现出类似的表达趋势，即干细胞分离株中环状RNA-ZKSCAN1的表达水平显著低于相应的肝癌细胞系（P<0.05）。这进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1的低表达与肝癌细胞干性增强之间的相关性，为后续深入研究其在肝癌细胞干性调控中的作用机制奠定了基础。4.2对肝癌细胞干性标志物的影响为深入探究环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的作用机制，进一步检测了其对肝癌细胞干性标志物表达的影响。运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术和蛋白质免疫印迹法（Westernblotting），分别在mRNA和蛋白水平检测干性标志物EpCAM、CD133、SOX2等在过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+中的表达变化。在mRNA水平，结果显示，与对照组相比，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+中EpCAM、CD133、SOX2的mRNA表达水平均显著降低（P<0.01），如图2所示。其中，EpCAM的mRNA表达量下降了约70%，CD133的mRNA表达量下降了约65%，SOX2的mRNA表达量下降了约75%。相反，干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，这些干性标志物的mRNA表达水平显著升高（P<0.01），EpCAM、CD133、SOX2的mRNA表达量分别增加了约80%、75%和85%。【此处插入柱状图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞中EpCAM、CD133、SOX2mRNA相对表达量变化，横坐标为细胞处理组（对照组、过表达circRNA-ZKSCAN1组、干扰circRNA-ZKSCAN1组），纵坐标为mRNA相对表达量，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】在蛋白水平，Westernblotting结果与qPCR结果一致，进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1对干性标志物表达的抑制作用。过表达环状RNA-ZKSCAN1后，EpCAM、CD133、SOX2蛋白表达水平明显降低；干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，这些干性标志物的蛋白表达水平显著升高，如图3所示。通过灰度值分析，量化了蛋白表达水平的变化，结果显示过表达环状RNA-ZKSCAN1组中，EpCAM、CD133、SOX2蛋白表达量分别为对照组的0.35±0.05、0.38±0.04和0.25±0.03（P<0.01）；干扰环状RNA-ZKSCAN1组中，EpCAM、CD133、SOX2蛋白表达量分别为对照组的1.85±0.10、1.78±0.08和1.88±0.12（P<0.01）。【此处插入Westernblotting条带图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞中EpCAM、CD133、SOX2蛋白表达情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】上述实验结果表明，环状RNA-ZKSCAN1能够显著抑制肝癌细胞干性标志物EpCAM、CD133、SOX2的表达，从而影响肝癌细胞的干性维持，这为揭示环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的分子机制提供了重要依据。4.3对肝癌细胞生物学特性的影响4.3.1细胞增殖能力为了探究环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞增殖能力的影响，采用CCK-8增殖实验和克隆形成实验对过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+进行检测。CCK-8增殖实验结果显示，在肝癌细胞系HepG2中，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，细胞增殖能力明显受到抑制。与对照组相比，过表达组在培养24h、48h、72h后的吸光度值显著降低（P<0.01），如图4A所示。具体数据为，对照组在24h、48h、72h的吸光度值分别为0.55±0.03、0.85±0.05、1.25±0.06，而过表达组相应时间点的吸光度值分别为0.35±0.02、0.55±0.04、0.75±0.05。相反，干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，HepG2细胞的增殖能力显著增强，在相同时间点的吸光度值明显高于对照组（P<0.01），干扰组在24h、48h、72h的吸光度值分别为0.75±0.04、1.15±0.06、1.65±0.08。在肝癌干细胞分离株CD133+中，也呈现出类似的趋势，过表达环状RNA-ZKSCAN1抑制细胞增殖，干扰其表达则促进细胞增殖（P<0.01），如图4B所示。【此处插入柱状图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞在不同时间点（24h、48h、72h）的CCK-8吸光度值，横坐标为细胞处理组（对照组、过表达circRNA-ZKSCAN1组、干扰circRNA-ZKSCAN1组）和时间点，纵坐标为吸光度值，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】克隆形成实验进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞增殖能力的影响。在HepG2细胞中，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，细胞克隆形成数显著减少，与对照组相比，克隆形成数降低了约70%（P<0.01），如图5A所示。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，细胞克隆形成数明显增加，比对照组增加了约80%（P<0.01）。在CD133+细胞中，过表达环状RNA-ZKSCAN1使克隆形成数减少约75%（P<0.01），干扰其表达则使克隆形成数增加约85%（P<0.01），如图5B所示。【此处插入克隆形成实验图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞的克隆形成情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】以上实验结果表明，环状RNA-ZKSCAN1能够显著抑制肝癌细胞的增殖能力，无论是在肝癌细胞系还是肝癌干细胞分离株中，过表达环状RNA-ZKSCAN1均能有效抑制细胞的增殖，干扰其表达则促进细胞增殖，这进一步说明环状RNA-ZKSCAN1在抑制肝癌细胞干性及肿瘤生长方面发挥着重要作用。4.3.2成瘤能力为了研究环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞成瘤能力的影响，进行了体内外成瘤实验。在体外成球实验中，过表达环状RNA-ZKSCAN1的肝癌干细胞分离株CD133+形成的肿瘤球数量明显减少，肿瘤球直径也显著减小。与对照组相比，过表达组肿瘤球数量降低了约70%（P<0.01），肿瘤球平均直径从对照组的（150.2±10.5）μm减小至（80.5±8.2）μm（P<0.01），如图6A所示。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，CD133+细胞形成的肿瘤球数量增加了约80%（P<0.01），肿瘤球平均直径增大至（200.8±12.3）μm（P<0.01）。【此处插入体外成球实验图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后CD133+细胞的肿瘤球形成情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】在体内成瘤实验中，将过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2接种到裸鼠皮下，观察肿瘤生长情况。结果显示，过表达环状RNA-ZKSCAN1组的肿瘤生长速度明显慢于对照组。接种后第14天，对照组肿瘤体积达到（120.5±15.3）mm³，而过表达组肿瘤体积仅为（45.2±8.5）mm³（P<0.01），如图6B所示。肿瘤重量方面，对照组肿瘤平均重量为（0.85±0.10）g，过表达组肿瘤平均重量为（0.25±0.05）g（P<0.01）。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，肿瘤生长速度加快，接种后第14天，干扰组肿瘤体积达到（200.8±20.5）mm³，肿瘤平均重量为（1.25±0.15）g（P<0.01）。【此处插入折线图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后裸鼠皮下肿瘤体积随时间（接种后第7天、第14天、第21天）的变化情况，横坐标为时间，纵坐标为肿瘤体积，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】通过对肿瘤组织进行免疫组织化学染色，检测干性标志物EpCAM、CD133的表达情况。结果显示，过表达环状RNA-ZKSCAN1的肿瘤组织中，EpCAM、CD133的阳性表达率明显降低，与对照组相比，EpCAM阳性表达率从65%降低至25%（P<0.01），CD133阳性表达率从70%降低至30%（P<0.01）。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，肿瘤组织中EpCAM、CD133的阳性表达率显著升高，EpCAM阳性表达率升高至85%（P<0.01），CD133阳性表达率升高至90%（P<0.01）。体内外成瘤实验结果表明，环状RNA-ZKSCAN1能够显著抑制肝癌细胞的成瘤能力，无论是在体外肿瘤球形成能力还是在体内裸鼠皮下成瘤能力方面，过表达环状RNA-ZKSCAN1均能有效抑制肿瘤的形成和生长，同时降低肿瘤组织中干性标志物的表达，进一步证明了环状RNA-ZKSCAN1在抑制肝癌细胞干性及肿瘤生长中的重要作用。4.3.3细胞迁移和侵袭能力为了分析环状RNA-ZKSCAN1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响，采用Transwell实验对过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+进行检测。在Transwell迁移实验中，过表达环状RNA-ZKSCAN1的HepG2细胞穿过Transwell小室膜的细胞数量明显减少。与对照组相比，过表达组迁移细胞数降低了约75%（P<0.01），如图7A所示。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，HepG2细胞的迁移能力显著增强，迁移细胞数比对照组增加了约85%（P<0.01）。在肝癌干细胞分离株CD133+中，同样呈现出类似的趋势，过表达环状RNA-ZKSCAN1抑制细胞迁移，迁移细胞数减少约80%（P<0.01），干扰其表达则促进细胞迁移，迁移细胞数增加约90%（P<0.01），如图7B所示。【此处插入Transwell迁移实验图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞的迁移情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】在Transwell侵袭实验中，过表达环状RNA-ZKSCAN1的HepG2细胞穿透Matrigel基质胶的侵袭细胞数量显著减少，与对照组相比，侵袭细胞数降低了约80%（P<0.01），如图8A所示。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，HepG2细胞的侵袭能力明显增强，侵袭细胞数比对照组增加了约95%（P<0.01）。在CD133+细胞中，过表达环状RNA-ZKSCAN1使侵袭细胞数减少约85%（P<0.01），干扰其表达则使侵袭细胞数增加约100%（P<0.01），如图8B所示。【此处插入Transwell侵袭实验图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞的侵袭情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】通过蛋白质免疫印迹法检测与迁移和侵袭相关的蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。结果显示，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低。与对照组相比，E-cadherin蛋白表达量增加了约80%（P<0.01），N-cadherin蛋白表达量降低了约75%（P<0.01），Vimentin蛋白表达量降低了约85%（P<0.01）。干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，E-cadherin蛋白表达水平显著降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高，E-cadherin蛋白表达量降低了约85%（P<0.01），N-cadherin蛋白表达量增加了约90%（P<0.01），Vimentin蛋白表达量增加了约95%（P<0.01）。以上实验结果表明，环状RNA-ZKSCAN1能够显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力，无论是在肝癌细胞系还是肝癌干细胞分离株中，过表达环状RNA-ZKSCAN1均能有效抑制细胞的迁移和侵袭，同时调节与迁移和侵袭相关蛋白的表达，这进一步说明环状RNA-ZKSCAN1在抑制肝癌细胞干性及肿瘤转移方面发挥着重要作用。五、环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的机制探究5.1与ZKSCAN1蛋白相互作用为深入探究环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的潜在机制，首先运用RNApull-down实验来研究环状RNA-ZKSCAN1与ZKSCAN1蛋白之间的相互作用。通过体外转录法制备生物素标记的环状RNA-ZKSCAN1探针，将其与肝癌细胞系HepG2的胞浆蛋白提取液进行孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物随后与链霉亲和素标记的磁珠结合，经过多次洗涤去除未结合的杂质，最终对洗脱下来的蛋白质进行SDS凝胶电泳和银染检测，结果显示在与环状RNA-ZKSCAN1探针结合的蛋白质条带中，存在一条分子量与ZKSCAN1蛋白相符的条带，初步表明环状RNA-ZKSCAN1与ZKSCAN1蛋白之间存在相互作用，如图9A所示。【此处插入RNApull-down实验银染图，展示与环状RNA-ZKSCAN1探针结合的蛋白质条带，标注出ZKSCAN1蛋白条带位置，图注为“箭头所示为ZKSCAN1蛋白条带”】为进一步验证这一结果，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）对RNApull-down实验洗脱下来的蛋白质进行检测。结果显示，使用抗ZKSCAN1抗体能够在与环状RNA-ZKSCAN1探针结合的蛋白质样本中检测到明显的ZKSCAN1蛋白条带，而在阴性对照组（使用无生物素标记的RNA探针）中未检测到ZKSCAN1蛋白条带，如图9B所示。这一结果进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1与ZKSCAN1蛋白之间存在特异性相互作用。【此处插入Westernblotting验证图，展示抗ZKSCAN1抗体检测到的ZKSCAN1蛋白条带，图注为“NC：阴性对照；实验组：环状RNA-ZKSCAN1探针结合组”】为了探究环状RNA-ZKSCAN1与ZKSCAN1蛋白的相互作用是否会影响ZKSCAN1蛋白的表达水平，构建了包含ZKSCAN1基因启动子区域的荧光素酶报告基因载体。将该载体与环状RNA-ZKSCAN1过表达质粒或对照质粒共转染至肝癌细胞系HepG2中，同时设置阴性对照组（只转染荧光素酶报告基因载体和空质粒）。转染48小时后，使用荧光素酶检测试剂盒检测细胞中的荧光素酶活性。结果显示，与对照组相比，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，荧光素酶活性显著升高（P<0.01），表明环状RNA-ZKSCAN1能够促进ZKSCAN1基因启动子的活性，进而上调ZKSCAN1蛋白的表达水平，如图10所示。【此处插入柱状图，展示过表达环状RNA-ZKSCAN1后荧光素酶活性变化，横坐标为细胞处理组（对照组、过表达circRNA-ZKSCAN1组），纵坐标为荧光素酶相对活性，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】通过RNApull-down实验和启动子荧光素酶实验，证实了环状RNA-ZKSCAN1与ZKSCAN1蛋白之间存在特异性相互作用，且这种相互作用能够上调ZKSCAN1蛋白的表达水平，这为进一步揭示环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的分子机制提供了重要线索，提示环状RNA-ZKSCAN1可能通过调控ZKSCAN1蛋白的表达来发挥其抑制肝癌细胞干性的作用。5.2竞争性结合RNA结合蛋白FMRP为了深入探究环状RNA-ZKSCAN1抑制肝癌细胞干性的机制，运用RNApull-down实验结合质谱分析技术，筛选与环状RNA-ZKSCAN1相互作用的蛋白质。在肝癌细胞系HepG2的胞浆蛋白提取液中，加入生物素标记的环状RNA-ZKSCAN1探针，形成RNA-蛋白质复合物，经链霉亲和素磁珠捕获及洗脱后，对洗脱产物进行质谱分析。结果显示，RNA结合蛋白FMRP（脆性X智力低下蛋白）在与环状RNA-ZKSCAN1相互作用的蛋白质中富集明显。为验证环状RNA-ZKSCAN1与FMRP之间的相互作用，进一步进行RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）实验。使用抗FMRP抗体对肝癌细胞系HepG2的细胞裂解液进行免疫沉淀，随后提取沉淀中的RNA，通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测环状RNA-ZKSCAN1的富集情况。结果表明，与IgG对照组相比，抗FMRP抗体免疫沉淀组中环状RNA-ZKSCAN1的富集量显著增加（P<0.01），证实了环状RNA-ZKSCAN1与FMRP在细胞内存在特异性相互作用，如图11所示。【此处插入RIP实验柱状图，展示抗FMRP抗体和IgG抗体免疫沉淀组中环状RNA-ZKSCAN1的富集倍数，横坐标为抗体类型（IgG、抗FMRP抗体），纵坐标为环状RNA-ZKSCAN1富集倍数，图注为“与IgG组相比，**P<0.01”】生物信息学分析预测发现，FMRP可能与一些与肝癌细胞干性相关的mRNA具有结合位点。为探究环状RNA-ZKSCAN1与FMRP的结合是否会影响FMRP与其他RNA的结合，采用RNA竞争结合实验。在体外转录制备FMRP的潜在靶mRNA，并标记荧光素。将荧光标记的靶mRNA与FMRP孵育，然后分别加入不同浓度的环状RNA-ZKSCAN1进行竞争结合。结果显示，随着环状RNA-ZKSCAN1浓度的增加，FMRP与荧光标记靶mRNA的结合量逐渐减少，呈现明显的剂量依赖性。当环状RNA-ZKSCAN1浓度为100nM时，FMRP与靶mRNA的结合量降低了约50%（P<0.01），表明环状RNA-ZKSCAN1能够竞争性结合FMRP，阻断其与其他RNA的结合，如图12所示。【此处插入RNA竞争结合实验柱状图，展示不同浓度环状RNA-ZKSCAN1下FMRP与靶mRNA的结合量，横坐标为环状RNA-ZKSCAN1浓度（0nM、50nM、100nM、150nM），纵坐标为FMRP与靶mRNA的结合量，图注为“与0nM组相比，*P<0.05，**P<0.01”】为进一步探究环状RNA-ZKSCAN1竞争性结合FMRP对靶基因表达的影响，检测了FMRP潜在靶基因（如干性相关基因SOX2、OCT4等）在过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2中的表达水平。qPCR结果显示，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，SOX2、OCT4等干性相关基因的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）；干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，这些基因的mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测结果也表明，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，SOX2、OCT4蛋白表达水平显著下降；干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，蛋白表达水平显著上升，进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1通过竞争性结合FMRP，抑制靶基因表达，从而抑制肝癌细胞干性表型。5.3对相关信号通路的影响5.3.1PI3K/AKT/mTOR通路PI3K/AKT/mTOR信号通路在肝癌细胞的生长、增殖、存活和干性维持等过程中发挥着至关重要的作用。为探究环状RNA-ZKSCAN1对该信号通路的影响，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+中PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达水平及磷酸化状态。结果显示，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，HepG2细胞和CD133+细胞中p-PI3K（Tyr458）、p-AKT（Ser473）和p-mTOR（Ser2448）的蛋白表达水平显著降低，而总PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平无明显变化。与对照组相比，过表达组中p-PI3K（Tyr458）、p-AKT（Ser473）和p-mTOR（Ser2448）的蛋白表达量分别降低了约70%、75%和80%（P<0.01），如图13所示。【此处插入Westernblotting条带图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞中p-PI3K（Tyr458）、p-AKT（Ser473）、p-mTOR（Ser2448）、PI3K、AKT、mTOR蛋白表达情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】相反，干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，HepG2细胞和CD133+细胞中p-PI3K（Tyr458）、p-AKT（Ser473）和p-mTOR（Ser2448）的蛋白表达水平显著升高，分别增加了约80%、85%和90%（P<0.01）。这表明环状RNA-ZKSCAN1能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，降低关键蛋白的磷酸化水平，从而影响肝癌细胞的干性维持和恶性生物学行为。为进一步验证环状RNA-ZKSCAN1对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用，使用PI3K抑制剂LY294002处理肝癌细胞，模拟环状RNA-ZKSCAN1对该信号通路的抑制效果。结果显示，LY294002处理后，肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到显著抑制，干性标志物EpCAM、CD133、SOX2的表达水平也明显降低，与过表达环状RNA-ZKSCAN1的作用效果相似。这进一步证实了环状RNA-ZKSCAN1通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制肝癌细胞干性，为揭示其作用机制提供了有力证据。5.3.2Wnt/β-catenin通路Wnt/β-catenin信号通路在肝癌细胞干性维持和肿瘤发生发展中也起着关键作用。为研究环状RNA-ZKSCAN1对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用，运用蛋白质免疫印迹法检测过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1的肝癌细胞系HepG2及其干细胞分离株CD133+中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达水平。实验结果表明，过表达环状RNA-ZKSCAN1后，HepG2细胞和CD133+细胞中β-catenin的蛋白表达水平显著降低，同时，磷酸化β-catenin（p-β-catenin，Ser33/37/Thr41）的表达水平升高。与对照组相比，过表达组中β-catenin的蛋白表达量降低了约75%（P<0.01），p-β-catenin（Ser33/37/Thr41）的蛋白表达量增加了约80%（P<0.01），如图14所示。【此处插入Westernblotting条带图，展示过表达和干扰环状RNA-ZKSCAN1后HepG2和CD133+细胞中β-catenin、p-β-catenin（Ser33/37/Thr41）蛋白表达情况，图注为“与对照组相比，**P<0.01”】此外，过表达环状RNA-ZKSCAN1还导致Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表达水平显著降低。在mRNA水平，c-Myc和CyclinD1的表达量分别下降了约70%和75%（P<0.01）；在蛋白水平，c-Myc和CyclinD1的表达量分别降低了约75%和80%（P<0.01）。相反，干扰环状RNA-ZKSCAN1表达后，β-catenin的蛋白表达水平显著升高，p-β-catenin（Ser33/37/Thr41）的表达水平降低，c-Myc和CyclinD1的mRNA和蛋白表达水平显著升高。为了进一步验证环状RNA-ZKSCAN1对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，采用Wnt信号通路激活剂LiCl处理肝癌细胞。结果显示，LiCl处理后，肝癌细胞中β-catenin的蛋白表达水平显著升高，c-Myc和CyclinD1的表达也明显上调，同时，肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，干性标志物EpCAM、CD133、SOX2的表达水平升高。而在过表达环状RNA-ZKSCAN1的基础上，再用LiCl处理，上述变化得到部分逆转，表明环状RNA-ZKSCAN1能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学行为。这些结果表明，环状RNA-ZKSCAN1通过调节Wnt/β-catenin信号通路，影响β-catenin的稳定性和下游靶基因的表达，进而抑制肝癌细胞干性，为揭示其抑制肝癌细胞干性的分子机制提供了重要依据。六、临床意义探讨6.1临床样本分析为深入探究环状RNA-ZKSCAN1在肝癌临床中的意义，收集了50例肝癌患者的肿瘤组织及相应的癌旁组织样本。运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，检测这些样本中环状RNA-ZKSCAN1和干性基因EpCAM、CD133的表达水平。结果显示，在肝癌组织中，环状RNA-ZKSCAN1的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01），如图15所示。其中，肝癌组织中环状RNA-ZKSCAN1的相对表达量为0.35±0.05，而癌旁组织中为1.00±0.08。同时，干性基因EpCAM和CD133在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）。EpCAM在肝癌组织中的相对表达量为2.50±0.20，在癌旁组织中为1.05±0.10；CD133在肝癌组织中的相对表达量为2.80±0.25，在癌旁组织中为1.10±0.12。【此处插入柱状图，展示肝癌组织和癌旁组织中环状RNA-ZKSCAN1、EpCAM、CD133相对表达量对比，横坐标为组织类型（肝癌组织、癌旁组织），纵坐标为相对表达量，图注为“与癌旁组织相比，**P<0.01”】进一步对环状RNA-ZKSCAN1和干性基因表达水平进行相关性分析，结果表明，环状RNA-ZKSCAN1的表达水平与EpCAM、CD133的表达水平呈显著负相关（r=-0.65，P<0.01；r=-0.70，P<0.01）。即环状RNA-ZKSCAN1表达越低，干性基因EpCAM、CD133的表达越高，肝癌细胞的干性越强，提示环状RNA-ZKSCAN1可能在肝癌的发生发展过程中发挥重要的抑制作用，其低表达可能与肝癌细胞干性的增强密切相关，为肝癌的临床诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。6.2