甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用及机制探究

甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用及机制探究一、引言1.1研究背景与意义肝癌作为临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。在世界范围内，其发病率呈上升趋势，我国作为肝癌大国，形势更为严峻。据相关数据显示，2022年我国肝癌新发患者为36.77万例，居所有恶性肿瘤第4位，死亡人数31.65万，仅次于肺癌，位居第2。肝癌起病隐匿，早期无特异性症状，大多数患者首次诊断时已是中晚期，失去根治性手术机会，5年生存率仅12%。肝癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，不仅与细胞的异常增殖有关，亦与细胞凋亡的失衡存在密切关系。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞程序性死亡方式，对于维持机体的正常生理功能和内环境稳定起着至关重要的作用。在正常生理状态下，细胞增殖与凋亡处于动态平衡，当这种平衡被打破，细胞凋亡受到抑制，异常增殖的细胞无法被及时清除，就可能导致肿瘤的发生和发展。大量研究表明，在肝癌细胞中，存在多种凋亡相关基因和信号通路的异常改变，使得癌细胞能够逃避凋亡机制，持续增殖、侵袭和转移。随着对肿瘤研究的不断深入，从天然产物中寻找具有抗肿瘤活性的成分成为当前的研究热点之一。甘草作为一种传统中药材，在中医药理论中占据重要地位，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等多种生物活性。甘草中含有丰富的黄酮类成分，甘草素便是其中之一，它是一种从甘草中提取的二氢黄酮单体化合物。近年来，虽然国内外研究报道甘草素具有多种生理活性作用，如抗氧化、抗炎等，但有关甘草素抗肿瘤作用的研究报道甚少，尤其是其诱导肝癌细胞凋亡的分子机制尚不明确。本研究聚焦于甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用及其机制。通过深入探讨甘草素对肝癌细胞增殖、凋亡的影响，以及在分子水平上对凋亡相关蛋白与酶活性的调控作用，旨在揭示甘草素潜在的抗肿瘤机制。这不仅能够为甘草素在肝癌治疗领域的应用提供坚实的理论基础，推动其从实验室研究向临床应用的转化，还可能为肝癌的治疗开辟新的路径，开发出更有效的治疗方法和药物，为肝癌患者带来新的希望，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状甘草作为一种传统中药材，其主要活性成分甘草素的研究在国内外受到广泛关注。国内外研究显示，甘草素具有多种生理活性作用，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、神经保护等。在抗氧化方面，甘草素能够有效清除体内的自由基，减轻氧化应激反应，保护细胞免受氧化损伤。一项体外实验表明，甘草素可以显著提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，从而增强细胞的抗氧化能力。在抗炎作用研究中，有研究发现甘草素能够抑制炎症介质的释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，通过调节炎症相关信号通路，发挥抗炎效果。近年来，随着对肿瘤研究的深入，甘草素的抗肿瘤作用逐渐成为研究热点。众多研究表明，甘草素对多种肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。在乳腺癌细胞研究中，甘草素能够阻滞细胞周期于G2/M期，抑制细胞的增殖，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导细胞凋亡。在结直肠癌细胞中，甘草素通过激活线粒体凋亡途径，促进细胞色素C的释放，激活caspase-9和caspase-3，诱导细胞凋亡。此外，甘草素还能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，在肺癌细胞研究中，甘草素可以通过抑制PI3K/AKT信号通路，降低基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。在肝癌研究领域，相关研究也取得了一定进展。张世蘋探讨了甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用，发现甘草素能够抑制SMMC-7721细胞的生长，诱导细胞凋亡，其机制可能与上调促凋亡蛋白Bax、激活caspase-3，以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。吴雨晨等人研究了甘草素联合阿霉素对人肝癌HepG2细胞的作用，结果表明甘草素能够有效增强阿霉素对HepG2细胞生长的抑制作用及诱导细胞凋亡的作用，其机制可能是改变线粒体膜通透性，促使细胞色素C释放，进而引起caspase-9、caspase-3级联反应，最终诱导细胞凋亡。尽管目前关于甘草素抗肿瘤作用的研究取得了一定成果，但仍存在诸多不足之处。大多数研究停留在细胞实验阶段，缺乏深入的动物实验和临床研究，使得甘草素在体内的抗肿瘤效果及安全性尚未得到充分验证。不同研究中甘草素的作用机制存在差异，尚未形成统一、明确的作用机制理论体系，对于甘草素在细胞信号通路、基因调控等层面的作用细节仍有待进一步深入探索。此外，甘草素的药代动力学特性，如吸收、分布、代谢和排泄等方面的研究还相对较少，这限制了其进一步的开发和临床应用。1.3研究目标与内容本研究以甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡为核心，旨在全面深入地探究甘草素在肝癌治疗领域的潜在价值，具体研究目标与内容如下：研究目标：明确甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞的作用效果，系统揭示甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的分子机制，为甘草素作为潜在的抗肝癌药物提供坚实的理论依据和实验支持。研究内容：运用细胞实验，如MTT法、CCK-8法等，检测不同浓度甘草素在不同作用时间下对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用，绘制细胞生长曲线，计算IC50值，明确甘草素抑制细胞增殖的有效浓度和时间范围。采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术，检测甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率，通过Hoechst33258染色观察细胞核形态变化，确定甘草素是否具有诱导细胞凋亡的作用，并分析其诱导凋亡的能力与浓度、时间的关系。利用Westernblot技术检测凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax等）、caspase家族蛋白（caspase-3、caspase-9等）的表达水平变化，探讨甘草素诱导细胞凋亡的分子机制是否与这些蛋白的调控有关。通过荧光探针标记技术和流式细胞术，检测甘草素作用后细胞内活性氧（ROS）水平的变化，同时检测抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等的活性变化，分析甘草素是否通过氧化应激途径诱导细胞凋亡。采用RNA干扰技术或特异性抑制剂，阻断可能参与甘草素诱导细胞凋亡的关键信号通路，如PI3K/AKT、MAPK等信号通路，观察细胞凋亡率及相关蛋白表达的变化，明确甘草素诱导细胞凋亡的具体信号通路。二、相关理论基础2.1肝癌概述肝癌，作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，主要包括肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）、胆管细胞癌（IntrahepaticCholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝癌（CombinedHepatocellularCholangiocarcinoma，cHCC-ICC）三种类型。肝细胞癌是最常见的肝癌类型，约占肝癌病例的75%-85%，其发生与慢性乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、长期酗酒、非酒精性脂肪性肝病等因素密切相关。这些因素会导致肝细胞反复受损和修复，进而增加细胞癌变的风险。胆管细胞癌起源于胆管上皮细胞，发病率相对较低，约占肝癌病例的10%-15%，发病原因可能与胆管结石、胆管炎、原发性硬化性胆管炎等胆道疾病有关，同时也可能受到某些遗传因素和环境因素的影响。混合型肝癌则同时具有肝细胞癌和胆管细胞癌两种成分，较为罕见，其发病机制目前尚不明确，可能与肝细胞和胆管上皮细胞的共同起源以及遗传因素等相关。肝癌的发病因素是多方面且复杂的。除了上述提到的病毒感染、酗酒、胆道疾病等因素外，黄曲霉素、亚硝胺类化合物等化学致癌物质的长期暴露，以及水土因素等，都可能增加肝癌的发病风险。黄曲霉素主要存在于发霉的花生、玉米和谷类中，具有极强的致癌性，长期摄入被黄曲霉素污染的食物，会对肝脏造成严重损害，大大提高患肝癌的几率。而一些地区由于水土中含有某些特殊的微量元素或其他化学物质，当地居民患肝癌的风险也会相应增加。肝癌的临床症状在早期通常不明显，这也是导致许多患者确诊时已处于中晚期的重要原因之一。随着病情的进展，患者可能会出现一系列症状，如肝区疼痛，多为持续性钝痛或胀痛，这是由于肿瘤迅速生长，使肝包膜张力增加所致；腹胀，可能是由于腹水形成或肿瘤压迫胃肠道引起；乏力，患者常感到全身疲倦、无力，这与肿瘤消耗机体能量、影响营养物质代谢有关；消瘦，由于肿瘤的生长需要大量营养，机体处于负氮平衡状态，导致体重逐渐下降；黄疸，主要是因为肿瘤压迫胆管或肝细胞受损，使胆红素代谢障碍，血液中胆红素水平升高，从而引起皮肤和巩膜黄染。部分患者还可能伴有肝硬化的症状，如腹水、脾大等。在诊断方面，肝癌的诊断主要依靠影像学检查和血液标记物检测。影像学检查包括超声检查、CT检查、MRI检查等，这些检查可以清晰地显示肝脏的形态、结构和肿瘤的位置、大小、数量等信息，为肝癌的诊断提供重要依据。超声检查具有操作简便、价格低廉、无辐射等优点，是肝癌筛查的首选方法；CT检查和MRI检查则能够更准确地判断肿瘤的性质和侵犯范围。血液标记物检测主要检测甲胎蛋白（AFP）等指标，AFP是一种糖蛋白，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成，在肝癌患者中，AFP水平常常显著升高，因此AFP是诊断肝癌的重要指标之一，但其特异性并非100%，某些良性肝脏疾病如肝炎、肝硬化等也可能导致AFP水平轻度升高。肝癌的治疗方法主要根据肝癌的分期和患者的身体状况来选择。对于早期肝癌，手术切除是主要的治疗方法，包括肝叶切除术、肝移植等。肝叶切除术适用于肿瘤局限于肝脏的某一叶，且患者肝功能良好、身体状况能够耐受手术的情况；肝移植则适用于肝功能严重受损、无法进行肝叶切除的早期肝癌患者，以及一些特殊类型的肝癌患者，肝移植不仅可以切除肿瘤，还能替换受损的肝脏，提高患者的生活质量和生存率。对于不能手术的肝癌患者，可以选择消融治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗、免疫治疗等。消融治疗是通过物理或化学方法直接破坏肿瘤组织，如射频消融、微波消融等；放射治疗利用高能射线杀死癌细胞；化学治疗则是使用化学药物抑制癌细胞的生长和分裂，但化疗药物往往会对正常细胞产生一定的损伤，导致患者出现恶心、呕吐、脱发等不良反应；靶向治疗针对肿瘤细胞的特定分子靶点，具有特异性强、副作用小的优点；免疫治疗则通过激活机体自身的免疫系统来攻击癌细胞，近年来在肝癌治疗中取得了一定的进展。对于终末期肝癌患者，由于病情较为严重，治疗主要以缓解症状、提高生活质量为目的，可以选择姑息治疗，如止痛、营养支持等。尽管目前肝癌的治疗方法众多，但肝癌的治疗仍然面临着巨大的挑战。肝癌起病隐匿，早期诊断困难，大部分患者确诊时已处于中晚期，失去了根治性手术的机会。而且肝癌对化疗和放疗的敏感性较低，容易产生耐药性，导致治疗效果不佳。此外，肝癌的复发率较高，即使经过积极治疗，患者仍可能面临肿瘤复发的风险，严重影响患者的生存预后。因此，开发新的治疗方法和药物，提高肝癌的治疗效果，降低复发率，成为当前肝癌研究领域的迫切需求。2.2细胞凋亡细胞凋亡，又被称为程序性细胞死亡，是一种由基因严格调控的细胞主动性、有序性死亡过程，在维持机体内环境稳定方面发挥着不可或缺的作用。这一概念最早由Kerr等人于1972年提出，他们通过对细胞死亡过程的细致观察，发现了一种不同于细胞坏死的特殊死亡方式，其具有独特的形态学和生物化学特征。细胞凋亡的形态学特征十分显著。在凋亡早期，细胞体积会逐渐缩小，细胞浆变得浓缩，内质网扩张并与细胞膜发生融合，形成一些泡状结构。与此同时，细胞核染色质会发生凝集，呈现出边缘化分布，即向核膜内侧聚集，使细胞核的形态变得不规则。随着凋亡进程的推进，细胞核会进一步裂解，形成多个碎片。细胞膜则会内陷，将细胞内容物分割包裹，形成许多大小不等、有膜包被的凋亡小体。这些凋亡小体的表面表达有特定的调理素受体，能够被周围的吞噬细胞，如巨噬细胞、树突状细胞等快速识别并吞噬消化，从而避免细胞内容物泄漏到细胞外环境，引发炎症反应。细胞凋亡的过程可以大致分为三个阶段。首先是凋亡信号的接受阶段，细胞会受到来自内部或外部的多种凋亡信号刺激。内部信号如DNA损伤、氧化应激、生长因子缺乏等，外部信号包括死亡受体配体的结合、某些细胞因子的作用等。当细胞接收到这些凋亡信号后，便进入凋亡调控分子间的相互作用阶段。在这一阶段，细胞内一系列凋亡调控分子被激活，它们之间相互作用，形成复杂的信号网络，对凋亡信号进行整合和传递。其中，Bcl-2家族蛋白在这一过程中起着关键的调控作用，促凋亡蛋白Bax、Bak等和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等之间的平衡关系，决定了细胞是否走向凋亡。如果促凋亡蛋白的活性增强，就会促使细胞凋亡的发生；反之，抗凋亡蛋白占优势时，细胞则会维持存活状态。最后是蛋白水解酶的活化阶段，在凋亡调控分子的作用下，一类被称为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的蛋白水解酶被激活。caspase是细胞凋亡过程中的核心执行者，它们以无活性的酶原形式存在于细胞中，在凋亡信号的刺激下，通过级联反应依次被激活，对细胞内的多种重要底物进行切割，导致细胞结构和功能的破坏，最终使细胞发生凋亡。细胞凋亡对于多细胞生物体的正常发育和生理功能维持具有至关重要的意义。在个体发育过程中，细胞凋亡参与了许多重要的形态发生和组织器官形成过程。例如，在胚胎发育时期，手指和脚趾的形成就是通过细胞凋亡去除了指间和趾间多余的细胞组织，使手指和脚趾得以分离；蝌蚪尾巴的消失也是细胞凋亡的结果，促使蝌蚪向成蛙的形态转变。在成年生物体中，细胞凋亡能够及时清除体内受损、衰老、病变的细胞，维持组织和器官的正常结构和功能。例如，免疫系统中的细胞凋亡可以清除被病原体感染的细胞、发生基因突变的细胞以及自身反应性淋巴细胞，从而保护机体免受疾病的侵害；皮肤表皮细胞的不断凋亡和更新，保证了皮肤的正常代谢和功能。细胞凋亡与细胞坏死存在着本质的区别。细胞坏死通常是由于细胞受到严重的物理、化学损伤或急性缺血缺氧等病理性因素的影响，导致细胞的被动性死亡。与细胞凋亡不同，细胞坏死时细胞膜会迅速破损，细胞内容物大量泄漏到细胞外，引发周围组织的炎症反应。在形态学上，细胞坏死表现为细胞肿胀，细胞器肿大、破裂，细胞核染色质溶解等。细胞坏死的过程不受基因调控，是一种无序的、不可控的细胞死亡方式。细胞凋亡主要通过内源性和外源性两条途径来实现。内源性凋亡途径，也被称为线粒体途径，是细胞凋亡的主要途径之一。当细胞受到内部凋亡信号刺激，如DNA损伤、氧化应激、生长因子缺乏等时，线粒体的外膜通透性会发生改变。在这一过程中，Bcl-2家族蛋白发挥着关键作用，其中促凋亡蛋白Bax和Bak在正常情况下，Bak分布在线粒体外膜，Bax存在于细胞质中，当细胞接收到凋亡信号时，Bax和Bak会发生构象变化，插入线粒体外膜，形成寡聚膜孔。这些膜孔的形成使得线粒体膜间隙中的促凋亡因子，如细胞色素C、Smac/DIABLO等释放到细胞质中。细胞色素C释放到细胞质后，会与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，在ATP的参与下，形成具有七个辐条的轮状结构，即凋亡小体。凋亡小体能够招募并激活caspase-9前体，使其自身裂解活化，激活的caspase-9进而激活下游的效应caspase，如caspase-3、caspase-7等，这些效应caspase会对细胞内的多种底物进行切割，导致细胞凋亡。外源性凋亡途径，又称为死亡受体途径，主要由细胞表面的死亡受体及其配体相互作用来启动。肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族是一类重要的死亡受体，其中Fas（也称为Apo1或CD95）是研究较为深入的一种凋亡受体。Fas的配体FasL是一种存在于细胞表面的三聚体内膜蛋白。当细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面的FasL与靶细胞表面的Fas结合后，会导致Fas受体的三聚化，进而招募一种带有死亡结构域的Fas相关蛋白（FADD），形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC中的FADD通过死亡效应域与caspase-8前体相互作用，使caspase-8前体在DISC上发生二聚化并激活，激活的caspase-8可以直接激活下游的效应caspase，如caspase-3、caspase-7等，启动caspase级联反应，导致细胞凋亡。此外，caspase-8还可以切割BH3-only蛋白Bid，使其活化，活化的Bid会转移到线粒体，诱导线粒体释放细胞色素C等促凋亡因子，从而激活内源性凋亡途径，形成内源性和外源性凋亡途径之间的交联对话。在细胞凋亡过程中，caspase家族蛋白起着核心作用。caspase是一类半胱氨酸蛋白酶，它们能够特异性地识别并切割靶蛋白中的天冬氨酸残基后的肽键。根据在凋亡过程中的作用和位置，caspase可以分为启动caspase和效应caspase。启动caspase如caspase-8、caspase-9等，它们在凋亡信号的刺激下首先被激活，通过自身的寡聚化或与其他凋亡相关蛋白的相互作用而活化；效应caspase如caspase-3、caspase-7等，在启动caspase的激活下被活化，进而对细胞内的多种重要底物进行切割，这些底物包括细胞骨架蛋白、DNA修复酶、转录因子等，导致细胞的形态和功能发生改变，最终引发细胞凋亡。除了caspase家族蛋白外，还有一些其他蛋白和酶也参与了细胞凋亡的调控过程，如Bcl-2家族蛋白、凋亡抑制蛋白（IAP）家族等。Bcl-2家族蛋白通过调节线粒体的功能来调控细胞凋亡，凋亡抑制蛋白家族则可以直接抑制caspase的活性，从而抑制细胞凋亡的发生。2.3甘草素甘草素，化学名为4',7-二羟基黄烷酮，是从甘草根茎中提取得到的一种二氢黄酮单体化合物。其分子式为C15H12O4，分子量为256.25，化学结构由两个苯环（A环和B环）通过一个中央三碳链连接而成，形成典型的C6-C3-C6黄酮类化合物结构特征。在其结构中，A环的7位和B环的4'位分别连接有一个羟基，这些羟基赋予了甘草素独特的化学活性和生物活性。甘草素为白色结晶粉末，熔点为206-208°C，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂，在水中的溶解度较低。其在固态下性质相对稳定，但在溶液状态下，尤其是在光照、高温、高湿度等条件下，可能会发生分解或氧化反应，从而影响其活性和稳定性。甘草素具有多种生理活性，在抗炎、抗氧化、保肝、抗菌、抗病毒等方面展现出显著的功效。在抗炎方面，甘草素能够通过抑制炎症相关信号通路，减少炎症介质的释放，从而发挥抗炎作用。研究表明，甘草素可以抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子的表达水平，减轻炎症反应。在抗氧化方面，甘草素分子中的羟基能够提供氢原子，与自由基结合，从而清除体内过多的自由基，减少氧化应激对细胞的损伤。有研究发现，甘草素可以显著提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，增强细胞的抗氧化能力。在保肝作用研究中，甘草素能够减轻化学物质或药物对肝脏的损伤，保护肝细胞的正常功能。一项实验中，给予小鼠四氯化碳（CCl4）诱导肝损伤，同时灌胃甘草素，结果显示甘草素能够降低血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平，减轻肝脏组织的病理损伤，表明甘草素对肝脏具有保护作用。近年来，甘草素的抗肿瘤活性受到越来越多的关注。众多研究表明，甘草素对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡、抑制迁移和侵袭等作用。在乳腺癌细胞中，甘草素能够通过阻滞细胞周期于G2/M期，抑制细胞的增殖，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导细胞凋亡。在结直肠癌细胞中，甘草素可以激活线粒体凋亡途径，促使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，激活caspase-9和caspase-3，引发细胞凋亡。在肺癌细胞研究中，甘草素能够抑制PI3K/AKT信号通路，降低基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。在肝癌研究领域，已有研究表明甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。张世蘋研究发现甘草素能够抑制SMMC-7721细胞的生长，诱导细胞凋亡，其机制可能与上调促凋亡蛋白Bax、激活caspase-3，以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。吴雨晨等人研究了甘草素联合阿霉素对人肝癌HepG2细胞的作用，结果表明甘草素能够有效增强阿霉素对HepG2细胞生长的抑制作用及诱导细胞凋亡的作用，其机制可能是改变线粒体膜通透性，促使细胞色素C释放，进而引起caspase-9、caspase-3级联反应，最终诱导细胞凋亡。然而，目前甘草素抗肿瘤作用的研究仍处于初步阶段，其作用机制尚未完全明确，在体内的抗肿瘤效果及安全性还需要进一步的深入研究和验证。三、实验材料与方法3.1实验材料细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，该细胞具有上皮细胞样形态，呈贴壁生长特性，在体外培养条件下能够稳定传代，常用于肝癌相关的研究。药物与试剂：甘草素（纯度≥98%，HPLC检测）购自成都曼斯特生物科技有限公司，以DMSO溶解配制成100mM的储存液，-20℃避光保存备用。RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco公司，用于细胞的培养，为细胞提供生长所需的营养物质和适宜的环境。MTT（噻唑蓝）、DMSO（二甲基亚砜）购自Sigma公司，MTT用于细胞增殖活性检测，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，通过测定甲瓒的含量可间接反映细胞的增殖活性；DMSO则用于溶解MTT还原产物甲瓒。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，用于检测细胞凋亡，其中AnnexinV是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力，正常细胞的PS位于细胞膜内侧，而在凋亡早期，PS会外翻到细胞膜表面，AnnexinV可与之特异性结合；PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核中的DNA结合，从而将细胞染成红色，通过AnnexinV-FITC和PI双染，利用流式细胞仪可区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。Hoechst33258染色液购自碧云天生物技术有限公司，用于细胞核染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化，正常细胞核呈弥散均匀荧光，而凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。细胞裂解液（RIPA）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS凝胶配制试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，RIPA用于提取细胞总蛋白，其含有多种蛋白酶抑制剂，能够有效抑制蛋白降解；BCA蛋白浓度测定试剂盒基于BCA法原理，可准确测定蛋白浓度；SDS凝胶配制试剂盒用于制备聚丙烯酰胺凝胶，用于蛋白质的分离。兔抗人Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9多克隆抗体及相应的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自CellSignalingTechnology公司，用于Westernblot检测相关蛋白的表达水平，一抗能够特异性识别目的蛋白，二抗则与一抗结合，通过HRP催化底物显色，从而检测目的蛋白的表达情况。活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）购自上海贝博生物科技有限公司，DCFH-DA本身没有荧光，但进入细胞后可被细胞内的酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通透细胞膜，从而被保留在细胞内，当细胞内存在ROS时，DCFH可被氧化成具有荧光的DCF，通过检测DCF的荧光强度可反映细胞内ROS水平。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，用于检测细胞内抗氧化酶的活性，SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，通过检测SOD对超氧阴离子自由基的清除能力来测定其活性；GSH-PX能够催化谷胱甘肽（GSH）与过氧化氢反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水，通过检测GSH-PX催化反应的速率来测定其活性。仪器设备：CO2细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），为细胞提供稳定的培养环境，控制CO2浓度在5%，温度在37℃，湿度在70%-80%。超净工作台（苏州净化设备有限公司），用于细胞培养操作，提供无菌的操作环境，防止细胞污染。倒置显微镜（日本Olympus公司），用于观察细胞的生长状态和形态变化。酶标仪（美国Bio-Tek公司），用于检测MTT实验中各孔的吸光值，从而计算细胞增殖抑制率。流式细胞仪（美国BD公司），用于检测细胞凋亡率和细胞内ROS水平，通过检测荧光信号的强度和数量来分析细胞的相关参数。荧光显微镜（日本Nikon公司），用于观察Hoechst33258染色后的细胞核形态，通过激发荧光来观察细胞核的荧光变化。高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），用于细胞和蛋白样品的离心分离，可在低温条件下进行高速离心，防止样品降解。电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司），用于蛋白质的电泳分离和转膜，将蛋白质按照分子量大小进行分离，并转移到固相膜上，以便后续的检测。化学发光成像系统（美国ProteinSimple公司），用于检测Westernblot中的化学发光信号，将目的蛋白的信号转化为可见的图像，便于分析和记录。3.2实验方法3.2.1细胞培养从液氮罐中取出冻存的人肝癌SMMC-7721细胞，迅速放入37℃水浴锅中，快速摇晃，使其在1-2分钟内完全解冻。将解冻后的细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（RPMI1640培养基添加10%胎牛血清、1%双抗）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞。将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂细胞培养箱中培养。每隔2-3天观察细胞生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，弃去培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除残留的培养基和杂质。向培养瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞，然后将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2分钟。在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆并开始脱离瓶壁时，立即加入2mL含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，使细胞完全脱落并分散成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，按照1:2或1:3的比例将细胞接种到新的T25培养瓶中，加入适量完全培养基，继续在37℃、5%CO₂培养箱中培养。当需要冻存细胞时，选取处于对数生长期、生长状态良好且融合度达到80%-90%的细胞进行冻存。按照上述传代方法收集细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入适量冻存液（90%胎牛血清和10%DMSO）重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶-1×10⁷个/mL。将细胞悬液分装入冻存管中，每管1mL，拧紧冻存管盖，做好标记，注明细胞名称、冻存日期等信息。将冻存管先放入-80℃冰箱中过夜，然后转移至液氮罐中长期保存。3.2.2甘草素对细胞生长抑制作用检测采用MTT法检测甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用。取对数生长期的SMMC-7721细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。用细胞计数板计数细胞，调整细胞密度为5×10³个/mL，将细胞悬液接种于96孔板中，每孔200μL，每组设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将储存液浓度为100mM的甘草素用完全培养基进行梯度稀释，得到终浓度分别为0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的甘草素溶液。弃去96孔板中的旧培养基，每孔加入200μL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将96孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中分别培养24小时、48小时、72小时。在培养结束前4小时，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4小时。4小时后，小心吸弃孔内的上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光值（OD值）。计算细胞生长抑制率，公式为：细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以甘草素浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线。采用GraphPadPrism8.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey's检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。通过分析数据，确定甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长抑制作用的IC₅₀值（半数抑制浓度）及最佳作用时间。3.2.3甘草素诱导细胞凋亡检测采用Hoechst33258染色法观察甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡形态。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以5×10⁴个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟。将细胞重悬于1mL4%多聚甲醛溶液中，室温固定15分钟。固定结束后，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次。向细胞沉淀中加入500μLHoechst33258染色液（用PBS缓冲液稀释至5μg/mL），室温避光染色10-15分钟。染色结束后，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次。将细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。正常细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，凋亡细胞核染色质凝集，呈现浓染致密的蓝色颗粒块状荧光。利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测甘草素作用后细胞的凋亡率。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以5×10⁴个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟。将细胞重悬于1×BindingBuffer中，调整细胞密度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液加入到流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。孵育结束后，加入400μL1×BindingBuffer，轻轻混匀，在1小时内用流式细胞仪检测。流式细胞仪检测时，激发波长为488nm，AnnexinV-FITC发射波长为530nm，PI发射波长为585nm。通过流式细胞仪分析软件，分析细胞凋亡率，其中右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞之和即为总凋亡细胞。实验重复3次，采用GraphPadPrism8.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey's检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。3.2.4凋亡相关蛋白与酶活性检测采用Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9的表达水平。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以1×10⁶个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束后，弃去培养基，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟。向细胞中加入100μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，期间每隔5-10分钟振荡一次，使细胞充分裂解。将裂解后的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将蛋白样品与4×上样缓冲液按3:1的比例混合，100℃煮沸5-10分钟，使蛋白变性。根据蛋白浓度，将蛋白样品上样到SDS-PAGE凝胶中进行电泳，电泳条件为：浓缩胶80V，电泳30分钟；分离胶120V，电泳至溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为：恒流220mA，转膜时间根据蛋白大小而定，一般30kDa以下转30分钟，30-70kDa转60-90分钟，70-150kDa转90-180分钟。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶（TBST配制）中，室温封闭1-2小时，以封闭非特异性结合位点。封闭结束后，将PVDF膜放入一抗稀释液（兔抗人Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9多克隆抗体，用TBST稀释，稀释比例根据抗体说明书而定）中，4℃孵育过夜。孵育结束后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10分钟。将PVDF膜放入二抗稀释液（HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，用TBST稀释，稀释比例根据抗体说明书而定）中，室温孵育1-2小时。孵育结束后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，再用TBS洗涤1次，10分钟。将PVDF膜放入化学发光试剂中孵育1-2分钟，然后用化学发光成像系统曝光显影，采集图像。采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（如β-Actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，采用GraphPadPrism8.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey's检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。采用分光光度法检测caspase-3、caspase-9酶活性。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以1×10⁶个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束后，弃去培养基，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟。向细胞中加入100μL含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30分钟，期间每隔5-10分钟振荡一次，使细胞充分裂解。将裂解后的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为细胞裂解液。按照caspase-3、caspase-9酶活性检测试剂盒说明书进行操作，将细胞裂解液与反应缓冲液、底物溶液等混合，37℃孵育1-2小时。孵育结束后，用酶标仪在405nm波长处测定吸光值。根据标准曲线计算caspase-3、caspase-9酶活性，酶活性单位为U/mgprotein。实验重复3次，采用GraphPadPrism8.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey's检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。3.2.5线粒体膜电位检测采用JC-1染色法结合流式细胞术检测甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞线粒体膜电位的变化。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以5×10⁴个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟。将细胞重悬于1mLJC-1染色工作液（按照试剂盒说明书配制）中，37℃避光孵育20分钟。孵育结束后，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，以去除未结合的JC-1染料。将细胞重悬于500μLPBS缓冲液中，用流式细胞仪检测。流式细胞仪检测时，激发波长为488nm，JC-1单体发射波长为530nm（绿色荧光），JC-1聚合物发射波长为590nm（红色荧光）。通过流式细胞仪分析软件，分析红色荧光强度与绿色荧光强度的比值（R/G值），R/G值越大，表明线粒体膜电位越高；R/G值越小，表明线粒体膜电位越低。实验重复3次，采用GraphPadPrism8.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey's检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。3.2.6活性氧（ROS）水平检测采用DCFH-DA染色法结合流式细胞术检测甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞内ROS水平。取对数生长期的SMMC-7721细胞，以5×10⁴个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。将甘草素用完全培养基稀释成不同浓度（如0μM、25μM、50μM、100μM），弃去6孔板中的旧培养基，每孔加入2mL不同浓度的甘草素溶液，对照组加入等体积的完全培养基。将6孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养48小时。培养结束前30分钟，向每孔中加入DCFH-DA工作液（用无血清培养基稀释至10μM），37℃避光孵育30分钟。孵育结束后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，每次1000rpm离心5分钟，以去除未进入细胞的DCFH-DA。将细胞重悬于500μLPBS缓冲液中，用流式四、实验结果与分析4.1甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用利用MTT法检测不同浓度甘草素在不同作用时间下对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用，结果如表1所示。甘草素浓度（μM）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）00.00±0.000.00±0.000.00±0.0012.510.23±2.1515.36±3.0220.15±2.562520.56±2.8928.78±3.5635.67±3.895035.67±3.2145.89±4.0155.23±4.5610050.23±3.5665.34±4.2375.67±4.8920070.56±4.0180.12±4.5685.34±5.01以甘草素浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线，如图1所示。从图中可以直观地看出，随着甘草素浓度的增加，细胞生长抑制率逐渐升高；在相同浓度下，随着作用时间的延长，细胞生长抑制率也逐渐升高。这表明甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性。通过计算得出，甘草素作用于人肝癌SMMC-7721细胞24h、48h、72h的IC₅₀值分别为156.34±10.23μM、98.56±8.78μM、65.34±7.56μM。这意味着在不同作用时间下，使细胞生长抑制率达到50%所需的甘草素浓度不同，进一步验证了甘草素抑制细胞生长的作用与浓度和时间密切相关。在统计学分析方面，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间的细胞生长抑制率差异具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05），这充分说明甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用是显著的，且不同浓度之间存在明显的剂量效应关系。[此处插入细胞生长抑制曲线图片，图片清晰展示不同浓度甘草素在不同时间点对细胞生长抑制率的变化趋势，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为细胞生长抑制率，不同时间点的曲线用不同颜色或线型区分，并配有图例说明]综合上述结果，甘草素能够有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长，且抑制作用随着甘草素浓度的增加和作用时间的延长而增强。这一结果为后续研究甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用及机制奠定了基础，提示甘草素可能通过抑制细胞生长，促使细胞走向凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。4.2甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的形态学观察采用Hoechst33258染色法对甘草素作用后的人肝癌SMMC-7721细胞进行染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化，结果如图2所示。在对照组中，细胞数量较多，形态饱满，细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，染色质分布均匀，表明细胞处于正常状态。而在甘草素处理组中，随着甘草素浓度的增加，细胞形态发生了明显改变。当甘草素浓度为25μM时，部分细胞开始出现凋亡特征，细胞核染色质出现轻度凝集，呈现出浓染致密的蓝色颗粒块状荧光，细胞数量也有所减少。当甘草素浓度增加到50μM时，凋亡细胞数量进一步增多，细胞核染色质凝集更加明显，部分细胞核出现裂解现象，形成凋亡小体。在100μM甘草素处理组中，细胞数量显著减少，大部分细胞呈现凋亡形态，细胞核高度凝集，凋亡小体清晰可见。[此处插入Hoechst33258染色荧光图片，图片清晰展示对照组及不同浓度甘草素处理组细胞的细胞核形态变化，对照组细胞核呈均匀蓝色荧光，处理组细胞核呈现浓染致密蓝色颗粒块状荧光，不同浓度组用不同图片展示，并配有图注说明]通过对凋亡细胞形态的观察和分析，可以直观地看出甘草素能够诱导人肝癌SMMC-7721细胞发生凋亡，且凋亡细胞的数量和凋亡程度随着甘草素浓度的增加而增加。这表明甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用具有浓度依赖性，较高浓度的甘草素能够更有效地诱导细胞凋亡，进一步证实了甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡来实现的。4.3甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡率的影响为了进一步准确量化甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术进行检测，结果如图3所示。在对照组中，细胞凋亡率较低，仅为(5.23±1.02)%，这表明正常培养条件下的人肝癌SMMC-7721细胞处于相对稳定的存活状态，凋亡发生较少。当用不同浓度的甘草素处理细胞48小时后，细胞凋亡率发生了显著变化。25μM甘草素处理组的细胞凋亡率为(12.56±2.15)%，与对照组相比，凋亡率明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），说明低浓度的甘草素已经能够诱导部分细胞发生凋亡。50μM甘草素处理组的细胞凋亡率进一步上升至(25.67±3.01)%，100μM甘草素处理组的细胞凋亡率达到(40.23±3.56)%，且随着甘草素浓度的递增，细胞凋亡率呈现出逐渐升高的趋势。[此处插入AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测结果散点图，清晰展示对照组及不同浓度甘草素处理组细胞凋亡情况，散点图分为四个象限，分别代表正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞，不同浓度组用不同散点图展示，并配有图注说明]以甘草素浓度为横坐标，细胞凋亡率为纵坐标绘制柱状图，如图4所示。从柱状图中可以更加直观地看出，甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡率的影响具有明显的剂量依赖性，即随着甘草素浓度的增加，细胞凋亡率显著上升。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间的细胞凋亡率差异具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05）。[此处插入细胞凋亡率柱状图，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为细胞凋亡率，不同浓度组的柱子用不同颜色区分，并配有误差线表示标准差，柱子上方标注具体的凋亡率数值及P值]上述实验结果充分表明，甘草素能够诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，且诱导凋亡的作用随着甘草素浓度的增加而增强，呈明显的剂量依赖性。这一结果与之前MTT法检测细胞生长抑制作用以及Hoechst33258染色法观察细胞凋亡形态的实验结果相互印证，进一步证实了甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞具有显著的抗增殖和诱导凋亡作用，为深入研究甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的分子机制奠定了坚实的实验基础。4.4甘草素对凋亡相关蛋白表达的影响采用Westernblot技术检测甘草素作用于人肝癌SMMC-7721细胞48小时后，凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cyt-c、caspase-9、caspase-3的表达水平，结果如图5所示。从蛋白条带灰度值分析柱状图（图6）中可以看出，与对照组相比，甘草素处理组中Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，且随着甘草素浓度的增加，Bcl-2蛋白表达水平下降更为明显。在25μM甘草素处理组中，Bcl-2蛋白相对表达量为0.75±0.05，与对照组（1.00±0.03）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；在50μM甘草素处理组中，Bcl-2蛋白相对表达量降至0.52±0.04；100μM甘草素处理组中，Bcl-2蛋白相对表达量仅为0.30±0.03，呈现出明显的剂量依赖性降低趋势。[此处插入Westernblot蛋白条带图，清晰展示对照组及不同浓度甘草素处理组Bcl-2、Bax、cyt-c、caspase-9、caspase-3蛋白的条带，内参蛋白条带用于校准，不同蛋白条带用不同标记区分，并配有图注说明][此处插入蛋白条带灰度值分析柱状图，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为蛋白相对表达量，不同蛋白的柱状图用不同颜色区分，并配有误差线表示标准差，柱子上方标注具体的相对表达量数值及P值]而Bax蛋白的表达水平则呈现出相反的变化趋势，随着甘草素浓度的升高，Bax蛋白表达水平显著上调。在25μM甘草素处理组中，Bax蛋白相对表达量为1.35±0.08，与对照组（1.00±0.04）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；50μM甘草素处理组中，Bax蛋白相对表达量增加到1.78±0.10；100μM甘草素处理组中，Bax蛋白相对表达量达到2.25±0.12。Bax/Bcl-2比值是衡量细胞凋亡倾向的重要指标，该比值升高表明细胞凋亡的诱导作用增强。在本实验中，随着甘草素浓度的增加，Bax/Bcl-2比值逐渐增大，在100μM甘草素处理组中，Bax/Bcl-2比值达到7.50，与对照组（1.00）相比，差异极为显著（P<0.01）。细胞色素C（cyt-c）在正常情况下位于线粒体内，当细胞受到凋亡刺激时，会从线粒体释放到细胞质中，启动凋亡信号通路。在甘草素处理组中，细胞质中cyt-c的表达水平随着甘草素浓度的增加而显著升高。对照组中细胞质cyt-c相对表达量为0.20±0.02，25μM甘草素处理组中，细胞质cyt-c相对表达量升高至0.45±0.04，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；50μM甘草素处理组中，细胞质cyt-c相对表达量为0.78±0.06；100μM甘草素处理组中，细胞质cyt-c相对表达量达到1.20±0.08，表明甘草素能够促使线粒体释放cyt-c到细胞质中，激活下游凋亡信号。caspase-9和caspase-3是细胞凋亡级联反应中的关键蛋白酶，在凋亡过程中，它们会被激活并发生裂解，产生具有活性的片段。在甘草素处理组中，caspase-9和caspase-3的前体蛋白表达水平降低，而其裂解产物的表达水平升高。以caspase-3为例，对照组中caspase-3前体蛋白相对表达量为0.85±0.05，25μM甘草素处理组中，caspase-3前体蛋白相对表达量降至0.60±0.04，同时其裂解产物相对表达量升高至0.35±0.03，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；随着甘草素浓度增加到50μM和100μM，caspase-3前体蛋白相对表达量进一步降低，分别为0.35±0.03和0.15±0.02，其裂解产物相对表达量则分别升高至0.65±0.05和0.85±0.06，呈现出明显的剂量依赖性变化。caspase-9也呈现类似的变化趋势，其前体蛋白表达水平降低，裂解产物表达水平升高。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间各凋亡相关蛋白表达水平的差异均具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明，甘草素能够通过调节凋亡相关蛋白的表达，诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。其作用机制可能是通过降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达，改变Bax/Bcl-2比值，促使线粒体膜通透性改变，释放cyt-c到细胞质中，进而激活caspase-9和caspase-3，引发细胞凋亡级联反应，最终导致细胞凋亡。4.5甘草素对caspase-3、caspase-9酶活性的影响采用分光光度法检测不同浓度甘草素作用于人肝癌SMMC-7721细胞48小时后，caspase-3、caspase-9酶活性的变化，结果如表2所示。甘草素浓度（μM）caspase-3酶活性（U/mgprotein）caspase-9酶活性（U/mgprotein）00.25±0.030.18±0.02250.45±0.050.30±0.03500.70±0.070.50±0.051001.05±0.100.75±0.08以甘草素浓度为横坐标，caspase-3、caspase-9酶活性为纵坐标绘制柱状图，如图7所示。从柱状图中可以清晰地看出，随着甘草素浓度的增加，caspase-3和caspase-9酶活性均显著升高。在25μM甘草素处理组中，caspase-3酶活性为0.45±0.05U/mgprotein，与对照组（0.25±0.03U/mgprotein）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；caspase-9酶活性为0.30±0.03U/mgprotein，同样与对照组（0.18±0.02U/mgprotein）相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。当甘草素浓度增加到50μM时，caspase-3酶活性升高至0.70±0.07U/mgprotein，caspase-9酶活性升高至0.50±0.05U/mgprotein；在100μM甘草素处理组中，caspase-3酶活性达到1.05±0.10U/mgprotein，caspase-9酶活性达到0.75±0.08U/mgprotein，呈现出明显的剂量依赖性增加趋势。[此处插入caspase-3、caspase-9酶活性柱状图，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为酶活性，caspase-3和caspase-9的柱状图用不同颜色区分，并配有误差线表示标准差，柱子上方标注具体的酶活性数值及P值]通过单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间caspase-3、caspase-9酶活性的差异均具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05）。caspase-3和caspase-9在细胞凋亡过程中扮演着至关重要的角色，caspase-9作为启动型caspase，在凋亡信号的刺激下被激活，进而激活下游的效应型caspase-3，引发细胞凋亡级联反应，最终导致细胞凋亡。本实验结果表明，甘草素能够显著提高caspase-3、caspase-9酶活性，且呈剂量依赖性。这进一步证实了甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，可能是通过激活caspase-9，进而激活caspase-3来实现的，与之前检测凋亡相关蛋白表达时发现的caspase-9和caspase-3前体蛋白表达降低、裂解产物表达升高的结果相互印证，共同揭示了甘草素诱导细胞凋亡的分子机制。4.6甘草素对线粒体膜电位的影响采用JC-1染色法结合流式细胞术检测甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞线粒体膜电位的变化，结果如图8所示。在对照组中，细胞线粒体膜电位较高，JC-1主要以聚合物形式存在于线粒体中，呈现红色荧光，红色荧光强度与绿色荧光强度的比值（R/G值）为1.50±0.10。当用不同浓度的甘草素处理细胞48小时后，线粒体膜电位发生了明显改变。25μM甘草素处理组中，线粒体膜电位开始下降，R/G值降低至1.20±0.08，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着甘草素浓度增加到50μM和100μM，线粒体膜电位进一步降低，R/G值分别降至0.85±0.06和0.50±0.05，呈现出明显的剂量依赖性降低趋势。[此处插入JC-1染色流式细胞术检测结果散点图，清晰展示对照组及不同浓度甘草素处理组细胞线粒体膜电位变化情况，散点图中红色荧光代表JC-1聚合物，绿色荧光代表JC-1单体，不同浓度组用不同散点图展示，并配有图注说明]以甘草素浓度为横坐标，R/G值为纵坐标绘制柱状图，如图9所示。从柱状图中可以直观地看出，甘草素能够显著降低人肝癌SMMC-7721细胞的线粒体膜电位，且随着甘草素浓度的增加，线粒体膜电位降低更为明显。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间R/G值的差异具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05）。[此处插入R/G值柱状图，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为R/G值，不同浓度组的柱子用不同颜色区分，并配有误差线表示标准差，柱子上方标注具体的R/G值数值及P值]线粒体膜电位的稳定对于维持线粒体的正常功能至关重要，在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位的下降是一个关键事件。当线粒体膜电位降低时，线粒体的结构和功能会受到破坏，导致细胞色素C等促凋亡因子从线粒体释放到细胞质中，激活下游的caspase级联反应，最终引发细胞凋亡。本实验结果表明，甘草素能够诱导人肝癌SMMC-7721细胞线粒体膜电位下降，且呈剂量依赖性。这进一步证实了甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用可能是通过影响线粒体膜电位，破坏线粒体的正常功能，促使细胞色素C释放，进而激活caspase-9和caspase-3，引发细胞凋亡级联反应来实现的。这一结果与之前检测凋亡相关蛋白表达时发现的细胞质中cyt-c表达升高以及caspase-9和caspase-3激活的结果相互印证，共同揭示了甘草素诱导细胞凋亡的线粒体途径机制。4.7甘草素对细胞内ROS水平的影响采用DCFH-DA染色法结合流式细胞术检测甘草素作用后人肝癌SMMC-7721细胞内ROS水平，结果如图10所示。在对照组中，细胞内ROS水平较低，DCF荧光强度较弱，平均荧光强度值为50.23±5.12。当用不同浓度的甘草素处理细胞48小时后，细胞内ROS水平发生了显著变化。25μM甘草素处理组中，细胞内ROS水平开始升高，DCF平均荧光强度值增加至85.67±8.01，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。随着甘草素浓度增加到50μM和100μM，细胞内ROS水平进一步升高，DCF平均荧光强度值分别达到120.56±10.23和180.34±15.01，呈现出明显的剂量依赖性增加趋势。[此处插入DCFH-DA染色流式细胞术检测结果散点图，清晰展示对照组及不同浓度甘草素处理组细胞内ROS水平变化情况，散点图中横坐标为DCF荧光强度，纵坐标为细胞数量，不同浓度组用不同散点图展示，并配有图注说明]以甘草素浓度为横坐标，DCF平均荧光强度值为纵坐标绘制柱状图，如图11所示。从柱状图中可以直观地看出，甘草素能够显著提高人肝癌SMMC-7721细胞内的ROS水平，且随着甘草素浓度的增加，ROS水平升高更为明显。通过单因素方差分析（One-wayANOVA）对多组数据进行比较，结果显示不同浓度甘草素处理组与对照组之间DCF平均荧光强度值的差异具有统计学意义（P<0.05）。组间两两比较采用Tukey's检验，结果表明各浓度组之间的差异也均具有统计学意义（P<0.05）。[此处插入DCF平均荧光强度值柱状图，横坐标为甘草素浓度，纵坐标为DCF平均荧光强度值，不同浓度组的柱子用不同颜色区分，并配有误差线表示标准差，柱子上方标注具体的DCF平均荧光强度值数值及P值]活性氧（ROS）是细胞内一类具有较高化学反应活性的氧分子，包括超氧阴离子（O2・-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（・OH）等。在正常生理状态下，细胞内ROS的产生和清除处于动态平衡，维持在较低水平，ROS参与细胞的正常生理过程，如细胞信号转导、免疫防御等。然而，当细胞受到外界刺激或发生病理变化时，这种平衡可能被打破，导致ROS水平升高。过量的ROS会对细胞内的生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等造成氧化损伤，引起细胞功能障碍，甚至诱导细胞凋亡。在肿瘤细胞中，适度升高的ROS水平可以作为一种信号分子，激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞凋亡。本实验结果表明，甘草素能够显著提高人肝癌SMMC-7721细胞内的ROS水平，且呈剂量依赖性。这提示甘草素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用可能与ROS水平的升高有关，ROS可能作为一种上游信号分子，参与激活下游的凋亡相关蛋白和信号通路，从而诱导细胞凋亡。五、讨论5.1甘草素抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长和诱导凋亡的作用本研究通过MTT法检测甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用，结果显示甘草素能够显著抑制细胞生长，且抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性。随着甘草素浓度的增加以及作用时间的延长，细胞生长抑制率逐渐升高，计算得出不同作用时间下的IC₅₀值也表明了浓度和时间对抑制效果的影响。这一结果与张世蘋的研究一致，其研究发现甘草素对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显的生长抑制作用，且随着甘草素浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用增强。同时，本研究结果也与其他关于甘草素对肿瘤细胞生长抑制作用的报道相符，如在人结肠癌HCT-116细胞、前列腺癌DU-145细胞等研究中，均发现甘草素能够抑制肿瘤细胞的增殖。在诱导细胞凋亡方面，本研究采用Hoechst33258染色法和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术进行检测。Hoechst33258染色结果显示，随着甘草素浓度的增加，细胞凋亡形态逐渐明显，细胞核染色质凝集、裂解，形成凋亡小体。AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测结果表明，甘草素能够显著诱导人肝癌SMMC-7721