杨学明微生物与免疫学医学免疫学实验-第三次实验

病原生物学和免疫学实验杨学明微生物与免疫学教研室BEAConfidential.|2【实验内容】

1.酶联免疫吸附试验①双抗夹心法②间接法BEAConfidential.|3凝集反应沉淀反应体液免疫检测免疫标记技术酶免疫技术免疫荧光技术免疫胶体金技术放射免疫技术免疫印迹技术化学发光技术BEAConfidential.|4酶联免疫吸附试验BEAConfidential.|5掌握酶联免疫吸附试验（ELISA）的实验原理和操作方法。【实验目的】BEAConfidential.|6

将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分离。

ELISA检测通常分为直接法、间接法、双抗夹心法和竞争抑制法，间接法适用于各种抗体的检测，双抗夹心法用于检测液相中的可溶性抗原。【原理与用途】BEAConfidential.|7一ELISA双抗夹心法BEAConfidential.|8将已知抗体吸附在固相上，加入待测标本，标本中的抗原与固相上已知抗体结合，再加入酶标抗体，通过洗涤去除未吸附的抗体、未结合的抗原及酶标抗体，加底物后，酶分解底物显色。【双抗夹心法原理】BEAConfidential.|9ELISA（双抗夹心法）BEAConfidential.|101.预包被可拆微孔板条（包被HBsAb）2.阳性对照（基因工程HBsAg）3.阴性对照（正常人血清）4.酶标抗体（HRP标记的HBsAb）5.样品稀释液（含BSA缓冲液）6.洗涤液7.底物A液、底物B液8.终止液9.微量加样器、即时贴、37℃恒温箱、吸水纸等。【材料】BEAConfidential.|11乙型肝炎病毒表面抗原检测（双抗夹心法）1.平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，室温平衡30分钟，微孔板开封，余者即时以自封袋封存。2.编号：取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、空白对照，并按序编号。【实验方法】BEAConfidential.|123.稀释：每孔加入20μl样品稀释液。4.加样：分别在相应的孔中加入100μl阴性、阳性对照血清，空白孔不加。5.温育：盖上即时贴，置37℃温育60分钟。6.洗涤：用洗涤液充分洗涤5次（空白孔也要洗涤），洗涤后扣干（每次保持5-10秒的浸泡时间）。BEAConfidential.|137.加酶：分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体50μl，空白孔不加。8.温育：盖上即时贴，置37℃温育30分钟。

9.洗涤：同前法。BEAConfidential.|1410.显色：每孔加底物A、B各50μl，轻拍混匀，37℃暗置30分钟。11.终止：每孔加入终止液50μl，混匀。

BEAConfidential.|15肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。

（注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变）2.酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。临界值=阴性对照孔OD平均值×2.1【结果判断】BEAConfidential.|161.试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，弃去１－２滴。2.戴手套处理样本及试剂，废弃物集中消毒处理。3.严格按照操作程序依次加入样品及试剂。4.操作需要37℃±1℃温育，最好是水浴箱。5.洗涤要彻底。6.封口膜和吸水纸为一次性使用，勿反复使用。【注意事项】BEAConfidential.|17二ELISA间接法BEAConfidential.|18将已知抗原包被于塑料板上，然后加待测标本，如果标本中有相应的特异性抗体，即与固相上的抗原结合，形成抗原抗体复合物，然后加酶标二抗或酶标SPA，最后加底物显色。【间接法原理】BEAConfidential.|19BEAConfidential.|201.HBsAg包被可拆反应板条。2.抗HBs阳性对照血清。3.抗HBs阴性对照血清。4.酶结合物5.洗涤液6.底物A液、底物B液7.终止液8.微量加样器、即时贴、37℃恒温箱等。【材料】BEAConfidential.|21乙型肝炎病毒表面抗体检测（间接法）1.平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温，微孔板开封，余者即时以自封袋封存。2.编号：取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、空白对照，并按序编号。【实验方法】BEAConfidential.|223.加样：在包被反应板条各孔内，依次加待测样品50μl，空白对照孔不加。4.温育：盖上即时贴，置37℃温育60分钟。5.洗涤：用洗涤液充分洗涤5次（空白孔也要洗涤），洗涤后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。BEAConfidential.|236.加酶：

分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体50μl，空白孔不加。7.温育：

盖上即时贴，置37℃温育30分钟。

8.洗涤：

同前法。BEAConfidential.|249.显色：

各孔内（包括空白对照）加底物Ａ液50μl、底物Ｂ液50μl，置３７℃暗育１５分钟。10.终止反应：各孔内加终止液50μl。BEAConfidential.|25BEAConfidential.|261.肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。（注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变）2.酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定OD值，本实验底物为TMB，最大吸收波长为450nm，因此应测定OD450值。临界值=阴性对照孔OD平均值×2.1【结果判断】BEAConfidential.|271.试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试