DB32／T 5362-2026+饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测+重组酶介导等温核酸扩增法

饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测重组酶介导等温核酸扩增法Recombinase-aidedamplificationassy江苏省市场监督管理局发发出布版Ⅰ前言 Ⅲ 2规范性引用文件 3术语和定义 4仪器与设备 5试剂与材料 6水样富集和核酸提取 7核酸检测 8结果判定 附录A（规范性）RAA基础反应体系溶液 附录B（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针 附录C（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系 参考文献 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省血吸虫病防治研究所。DB32/T5362—20261饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测重组酶介导等温核酸扩增法本文件描述了重组酶介导核酸等温扩增法检测饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫。本文件适用于各类出厂水和末梢水的检测与监测工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1隐孢子虫Cryptosporidium属于真球虫目，隐孢子虫科，隐孢子虫属的重要的机会致病性原虫。注1：生活史有滋养体、裂殖体、配子（体）、合子和卵囊5个发育阶段，其中卵囊是感染阶段，可存在于饮用水中。注2：感染人体后，主要寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内，可引起隐孢子虫病。3.2蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia贾第鞭毛虫，属于双滴虫目，六鞭毛科，贾第鞭毛虫属。生活史包括滋养体和包囊2个发育阶段，其中包囊是感染阶段，可存在于饮用水中。感染人体后，主要寄生于人体十二指肠、小肠上端和胆囊，可引起蓝氏贾第鞭毛虫病。注：贾第鞭毛虫简称蓝氏贾第鞭毛虫，又称肠蓝氏贾第鞭毛虫或十二指肠蓝氏贾第鞭毛虫。3.3重组酶介导等温核酸扩增技术Recombinase⁃aidedamplification；RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温条件下（一般为39℃)进行核酸扩增的技术。注：其原理为重组酶与引物紧密结合扫描双链DNA，当搜索到与引物同源的序列时，使双链DNA解旋，单链结合蛋白防止单链DNA复性，引物在与DNA聚合酶作用下沿模板延伸，合成新的DNA互补链，5min~15min就可实现用仪器检测目的靶标的扩增。4仪器与设备4.1水样富集装置该方法所需装置如下：2DB32/T5362—2026a）过滤器：用于进出水样和承载固定滤膜；b）滤膜：聚丙烯（Polypropylene，PP）纤维滤膜，孔径1μm~2μm，直径8cm~10cm；c）橡胶软管；d）快速接头/口：用于连接各部分组件；e）流量计。4.2核酸提取设备该方法所需设备如下：a）恒温水浴锅：可加热至100℃;b）高速离心机：相对离心力≥12000g；c）超声破碎仪：≥20kHz，500W~700W；d）微量可调移液器：量程为100μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL、0.5μL~10μL以及0.1μL~2.5μL。4.3核酸检测设备该方法所需设备如下：a）RAA恒温核酸扩增检测仪：带有恒温（39±1）℃扩增功能、荧光定量系统及计算机处理系统的荧光检测仪。需具备FAM（6⁃羧基荧光素）和HEX（六氯⁃6⁃甲基荧光素）两种荧光通道；b）恒温震荡混匀仪：带有恒温功能（39±1）℃,且能把固体、液体物质充分混匀，用于核酸样本和反应试剂的恒温混合；c）离心机：相对离心力≥12000g；d）微量可调移液器：量程为100μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL、0.5μL~10μL以及0.1μL~2.5μL。e）掌式离心机：0r/min~2000r/min。5试剂与材料5.1试剂组织核酸提取试剂盒、RAA基础反应体系溶液（也可采用等效的扩增反应试剂盒见附录A的表A.1。乙酸镁溶液（140mmol/L无水乙醇，试验用水（符合GB/T6682要求）。5.2材料科剪、眼科镊、一次性医用手套和一次性医用口罩。5.3引物和探针扩增隐孢子虫属特异性的18SrRNA基因以及蓝氏贾第鞭毛虫β⁃贾第素(β⁃giardin）基因的特异性引物及探针，见附录B的表B.1。6水样富集和核酸提取6.1水样富集6.1.1样本及采样量样本包括自来水厂出厂水、末梢水，且不低于50L。3富集过程采用滤膜拦截过滤的方法，利用自来水压完成富集，按以下步骤采样：a）将滤膜安置固定于过滤器进水口侧；b）将过滤器前后组装完整，确保密封；c）将组装完毕的过滤器通过快速接头/口和橡胶软管连接于自来水龙头后；d）利用快速接头/口和橡胶软管将流量计连接于过滤器后面；e）记录流量计数值，打开水龙头，利用自来水压进行过滤富集；f）关闭自来水龙头，记录流量计数值并计算过滤体积；g）将过滤器从连接处卸下；h）打开过滤器，用镊子夹取滤膜边缘后取出。注1：出厂水是指水源水经水厂集中处理后，即将进入输配水网管的水。注2：末梢水是指经过输配水管网输送至用户水龙头的水。注3：本部分富集方法为现场采样，采集完毕后将滤膜装入50mL离心管中，并尽快送至实验室，运输条件则需确保0℃~4℃冷藏。富集完成后需在24h内完成核酸提取和检测步骤。注4：加标水样和试验用水分别作为本方法的阳性对照和阴性对照，与水样富集步骤一致。6.2核酸提取按照以下步骤进行核酸提取：a）用无菌眼科剪将滤膜剪成碎片，装入15mL离心管中；b）向上述离心管中加入10mL溶菌酶（50mg/mL）和500μL蛋白酶k（20mg/mL充分混匀后置于水浴锅中50℃孵育60min；c）再向上述样品管中加入1mL玻璃珠（直径1mm~2mm并置于超声破碎仪中超声60min（超声功率为25kHz~36kHz工作10s间隔10s；d）将上述样本置于高速离心机，13000r/min离心2min；e）取离心后的上清液，按照组织核酸提取试剂盒的操作说明完成核酸提取；提取的核酸进行下一步核酸检测，或保存至（-20±5）℃备用。注：本步骤是为了将蓝氏贾第鞭毛虫包囊和隐孢子虫卵囊囊壁充分破碎，以释放内部核酸。7核酸检测7.1反应体系扩增反应体系见附录C的表C.1；用双蒸水溶解稀释引物探针至10μmol/L。7.2反应步骤按照以下步骤进行：a）按照附录A的要求配制基础反应体系；b）将配置好的反应体系溶液按照附录C进行混合；c）将上述混合物共40μL转移至200μLPCR管中，并用掌式离心机混匀；d）向PCR管的管盖内侧加入5μL乙酸镁溶液；e）向PCR管中分别加入5μL待测核酸；f）将PCR管置于恒温震荡混匀仪中，39℃下运行4min；4g）将PCR管置于RAA恒温核酸扩增检测仪（也可采用其他等效的荧光检测仪）中进行实时检测；8结果判定8.1阳性判定8.1.230min内，通道一FAM荧光信号扩增曲线的斜率≥20时判定为蓝氏贾第鞭毛虫阳性；否则判定为阴性。8.1.330min内，通道二HEX荧光信号扩增曲线的斜率≥20时判定为隐孢子虫阳性；否则判定为阴性。8.2质量控制8.2.1FAM通道和HEX通道：加标水样检测结果判定为阳性；试验用水检测结果判定为阴性。8.2.2如果检测结果不符合8.2.1的要求，该检测结果视为无效，应检查仪器、试剂等的偏差，确认无误后重新检测。注：加标水样是指在试验用水中加入隐孢子虫卵囊和蓝氏贾第鞭毛虫包囊各100±10个后制成的水样。DB32/T5362—20265（规范性）RAA基础反应体系溶液表A.1给出了RAA基础反应体系溶液的组分和浓度。表A.1RAA基础反应体系溶液组分浓度Tris缓冲液30mmol/L醋酸钾100mmol/L二硫苏糖醇6mmol/L聚乙二醇（PEG⁃35000）质量分数为6%ATP5mmol/LdNTPs0.4mmol/L磷酸肌酸80ng/μL单链结合蛋白500ng/μL重组酶200ng/μLUvsY蛋白200ng/μL核酸外切酶200ng/μLDNA聚合酶150ng/μLDB32/T5362—20266（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针表B.1给出了隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针。表B.1隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针引物/探针序列（5'⁃3'）隐孢子虫正向引物ATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG隐孢子虫反向引物CTCCAATTGATACTYGTWAAGGGGTTTATAC隐孢子虫探针aCGCAAATTACCCAATCCTRAYACAGGGAGG/i6HEXdT/A/idSp//iBHQ1dT/GACAAGAAATAACAAT⁃C3spacer蓝氏贾第鞭毛虫正向引物CTCAGGAAGGAGGCCCTCAAGAGCCTGAACGA蓝氏贾第鞭毛虫反向引物TCTCGCGGGCGATCGTCTCCTTCTCGATSGC蓝氏贾第鞭毛虫探针bTYGCCACGGAGAACGCMGARAGGAAGAAGA/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/AYGACCAGCTCAACGC⁃C3spaceraHEX为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。bFAM为荧光报告基团，idSp为四氢呋喃。DB32/T5362—20267（规范性）隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系表C.1给出了隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系。表C.1隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系组分体积/μL双蒸水反应体系溶液隐孢子虫正向引物隐孢子虫反向引物隐孢子虫探针蓝氏贾第鞭毛虫正向引物1蓝氏贾第鞭毛虫反向引物1蓝氏贾第鞭毛虫探针0.3DB32/T5362—20268［1］周晓农，陈家旭.食源性寄生虫病.北京：人民卫生出版社.2009：139⁃143.［2］吴观陵.人体寄