免疫组化(IHC)标准化

免疫组化（IHC）标准化

免疫组化（IHC）是病理诊断的主要协助手段之一。虽然免疫组化在各个试验室已常常规开

展，但是由于各个试验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化

试验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简

洁，但步骤较多且环环相扣，而且很多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否娴熟

驾驭整个试验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修

复及修复液的PH值等众多因素。所以，完成一张满足的免疫组化切片并非那么简洁。20

世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的

干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化试验室广泛应用。当前，免疫组化技术标准

化的探讨是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并运用非生物素型聚合物检测方法

的基础上而绽开的。

1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。

（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物

质，以保持组织和细胞固有形态和结构。对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原,

防止抗原破坏和弥散。需高度重视的是手术或穿刺离体组织必需立刻放于标本袋固定，固定

后应与病理申请单刚好送交病理科。病理医生有责任与手术送检科室进行必要的协作与沟

通，避开手术后的病理标本随意丢放。

曰于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不

同固定剂的特征。常采纳甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性缓冲福尔马林渗透

刀强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此

学荐作为病理标本的首选固定液。应避开运用含重金属的固定剂。

10%中性缓冲福尔马林配制方法：

40%甲醛100ml

磷酸二氢钠4g

磷酸氢二钠6.5g

蒸镭水900ml

同定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标木为18-24

小时。固定时间不宜超过24小时，以防止组织经甲醛过度固定造成的组织抗原损失和抗原

活性降低。

(2)取材：组织标本的取材厚度一般为0.3cm(不应>0.5cm),面积一般为(1.015)cmx

(1.0-1.5)cm«

(3)脱水：组织在脱水机中的处理需非常恰当，大量的试验室阅历公认加热抗原修复过程

中组织脱片的主要缘由是取材过厚以及脱水浸蜡处理无当所致。

(4)包埋与切片：组织经过脱水、透亮及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度

过高简洁导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡(熔点

<60℃)o

(5)切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5um之间，淋巴结/

淋巴组织和肾穿组织切片应当更薄些。切片要求完整，厚薄匀称，无皱褶无刀痕，太厚会影

响免疫组化染色结果和推断，还简洁在染色过程中发生脱片。展片可采纳二次展片，所谓二

次展片：是指在展片过程中，先将组织切片漂移在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展

片，然后将切片捞起放入45-5CTC的温水中进行其次次展片。此方法的优点是酒精溶液于水

之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较

小的组织接触酒精后会散开，不建议采纳此法。

(6)烤片：举荐58-6CTC恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片，因为在干燥的条件

下加热切片可以加速组织内抗原的氧化而破坏组织中的抗原，使抗原定位不明确。

(7)暂不染色切片的保存：进行免疫组化染色最好采纳新切片。在实际工作中，蜡块面端

可以采纳蜡封来避开抗原损失以便长期保存。假如切好暂不染色的切片，应当将切片放置于

4°C冰箱短时间保存。

(8)脱蜡：免疫组化的脱蜡过程与常规HE脱蜡步骤相同。

2、免疫组化抗体的选择、稀释和保存

(1)选择:

选择抗体应先了解其反应谱和适用条件（包括适用切片V石蜡切片或冰冻切片＞、稀释度及温

育时间等）。运用一种新抗体时，必需首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳

特异反应所需抗原的最低浓度。或者依据有关说明书的提示。

（2）稀释:

①一般用0.01MPBS,PH值7.2；

②或用0.05MTBS,PH值7.6；

③必要时可按须要加适量小牛血清清蛋白。

（3）保存：

合理地保存运用抗体非常重要，这样才能最大限度地发挥抗体的作用，使抗体不致在短期内

失去活性。

O浓缩型抗体：应先依据厂家供应的效价，将其分类。可按53、103、203等至1003为

一单位分装入安甑或0.25ml带盖塑料离心管中，并注明标记（批号、名称、效价、量），

密封后放入-20。0—・40。0低温冰箱中保存，用时按需用量取出，稀释后置4°C冰箱保存运

月，切勿反复冻存，以免效价降低。

②即用型抗体可置于4℃冰箱中保存。

远程运输，路途携带，邮寄抗体时，应加冰、干冰、防湿材料，以免影响效价。

3、免疫组化中被测组织的抗原修复

（1）组织细胞经10%中性缓冲福尔马林固定后，其切片中的抗原确定簇因醛的交联作用而

被封闭，抗原结构的理化性质发生显著的变更，表位空间结构变更而导致很多抗原免疫活性

去失，影响了抗原的定位。目前在免疫组化试验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素

之-O

常用的抗原修复方法是加热抗原修复法和酶消化法。有些抗体不须要进行抗原修复，有些抗

体须要酶消化法，有些抗原须要加热修复法，有些抗体则须要几种抗原修复技术的联合应用

（抗原双重修复法），至于哪种抗体是否须要抗原修复以及如何修复，一般试剂公司在产品

书目或说明书上会予以说明。

（2）酶消化法：现免疫组化试验室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法。

②APES玻片的制备：

APES1份

丙酮50份

配制方法：取APES1份，丙酮50份，置于干净的玻璃容器中，充分搅拌匀称。将洗净的

玻片放入稀释好的APES液中20-30秒后取出，稍停，在放入纯丙酮液洗去多余的APES

液，置通风橱中晾干即可。留意，用APES防脱玻片史理玻片捞片时组织应一步到位，不要

留有气泡。浓缩液室温（18-26。0贮存，有效期12个月。

Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用且效果最好的一种防脱片剂,

多聚赖氨酸溶液也可按1：10稀释成工作液，适合于须要酶消化、微波、高压的防脱片处理。

5、免疫组化染色：

（1）内源性过氧化物酶的阻断：在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等，它们能使

H202分解，DAB沉积而着色，最常见的是红细胞（血红蛋白），另外还有横纹肌细胞（肌

球蛋白）、粒细胞和单核细胞（细胞色素）、肝细胞和肾细胞（过氧化氢酶），假如不进行

处理，组织中红细胞、粒细，泡等会干扰染色结果的推断，消退内源性过氧化物酶干扰的方法

就是将组织切片浸泡在3%的H2O2中10分钟。

（2）内源性生物素的阻断：抗原修复对组织中内源性生物素受到不同程度的封闭，在加热

抗原修复增加抗原表位暴露的同时，也增加了组织中内源性生物素的呈现。内源性生物素指

的是组织内能够与抗生素蛋白结合的分子或基团，运月生物素-链霉菌抗生素蛋白的结合形

成足以以假乱真的阳性。

周小鸽等人2002年采纳组织芯片技术对大范围的正常组织和肿瘤组织进行的系统性探讨显

示：①冰冻组织中存在生物素，②经福尔马林固定石蜡包埋后的组织中生物素被封闭，③加

热抗原修复可造成生物素暴露，④生物素暴露的强度各不相同，强者可到强阳性（+++）,

⑤生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有充满分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆

口，⑥生物素在组织中的分布形式，特殊是腺上皮组织，包括正常组织和肿瘤组织，亦存在

部分非上皮组织，⑦生物素暴露的强弱与修复液亦有关，PH9.0EGTA的暴露实力比

PH8.0EDTA和PH6.0的柠檬酸更强；⑧加热抗原修复暴露的生物素可以被蛋清液封闭。

周小鸽等人提出建议：凡采纳加热抗原修复和生物素相关检测系统，应进行生物素常规封闭,

冰冻切片做免疫组化染色时亦应进行生物素常规封闭，或者采纳非生物素检测系统，如

Envision等，坚持运用阴性比照。

在试验室中一般凡进行加热抗原修复处理并打算运用生物素-抗生素辣根过氧化物酶检测系

统，免疫组化染色的组织都须要进行内源性生物素封闭处理。阻断内源性生物素的方法是采

纳卵白素•生物素（Avidin-biotin）加以封闭，在常温下孵育20・30分钟即可,Avidin-biotin

订以与组织中内源性生物素结合，以消退影响。但最简便的方法是运用非生物素的酶聚合物

检测系统。

（3）血清封闭：作为检测试剂的抗原蛋白带有肯定的负电荷，免疫组化染色时，易与带正

电荷的组织（特殊是纤维组织、变性和〈或〉坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等）发生静电吸引而

导致非特异性染色（试验室运用的封闭血清，一般在加一抗之前运用，选择的血清种属一般

与二抗的种属相同），去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于

制备其次抗体动物的非免疫血清或滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓

度为1：5—1：20,正常血清爱护作用时间10-20分钟。

（4）冲洗缓冲液：试验室中常用冲洗缓冲液为PBS和TBS（PH7.2-7.4）°冲洗缓冲液中

加入0.025%Tween-20可以增加缓冲液的效果。

（5）一抗孵育：①即用型第一抗体可依据厂家供应的试验操作条件进行试验（迈新试验室

针对即用型抗体稳定性与长期有效保存条件的问题进行了长达1年时间比照追踪试验视察，

结果表明:即用型抗体在4°C冷臧条件下存放14个月是稳定的）；②浓缩型抗体一般依据厂

家供应的建议稀释度进行成倍稀释预试验，以选择最佳稀释度。抗体的最佳稀释度是指:在无

背景染色的状况下，获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度。一般染色背景深大多是抗体浓度

过浓所致。③抗体孵育时的温度一般以259±8（为准，在此区间内，一抗的孵育时间为

30-60分钟。若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当削减孵育时间，或者在4。（3冰箱

过夜，冰箱4。0下孵育常须要留意的是：抗体孵育应在潮湿密封闭的环境中进行，避开抗体

水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥，致使染色背景产生。高质量的孵育盒是免疫组化的必要试

验用品。

免疫组化染色过程的试剂浓度，孵育时间是相关联的，浓度与温度和时间基本呈反比，即浓

度过高孵育，温度应越低，孵育时间应当越短，反之亦然，因此，每个试验室应依据各自的

状况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件。

（6）常用检测系统：目前常用的检测系统为辣根过氧化物酶检测系统，主要为两类：①以

生物素-链霉菌抗生物素蛋白链接的辣根过氧化物酶（Biotin-Streptavidin-HRP）检测系统，

如：SP、ABC、SABC等；②以聚合物（Polymer）链接的辣根过氧化物能检测系统，如：

MaxVision.日ivision、EnVision等。这两类检测系统都是在国内外临床广泛采纳的检测方

法。非生物素型酶聚合物检测系统敏感性较高、操作便捷、无内源性生物素干扰，己成为免

疫组化的常规检测系统。

（7）显色系统：由于通常采纳的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）或AEC（红色）

作为酶底物显色。若采纳的是碱性磷酸酶检测系统则选择BCLP/NBT（蓝紫色）作为酶底物

显色。

①DAB阳性部位呈棕色，一般以苏木素复染。配制DAB时应留意：v1>DAB具有致癌性，

可诱发皮肤癌和膀胱癌，运用过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此状况应马

上用大量的水冲洗，用过的DAB应倒入清洁液中集中消毒处理；v2>DAB肯定要簇新配制，

如有沉淀可过滤后运用，否则未溶的DAB颗粒会沉积在切片上，影响结果的视察，配制好

的的溶液避光保存，30分钟内有效；v3>DAB的浓度不宜太高，否则会增加背景染色。H2O2

浓度也不宜太高，否则会加速反应，也可增加背景染色。

室温下染色约为3-5分钟，可在显微镜下视察限制染色时间。DAB试剂盒冰箱4-8。0避光

保存。

②AEC阳性部位呈红色，如以苏木素或亮绿等作为背景染色，则效果更好，配制AEC时应

留意：v1>配制AEC过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此状况应马上用大

量的水冲洗；<2>由于终产物溶于乙醇中，不能用酒精处理，因阳性棕红色产物能溶于究酒

精中，故需甘油明胶封片，不能长期保存。

<3>若出现沉淀可过滤后运用，配制好的溶液避光存放，30分钟内有效，染色结果为红色，

室温下染色约为8-20分钟，可在显微镜下视察限制染色时间。AEC试剂盒冰箱4-8。0避光

保存。

显色时间不宜过长，过长可导致背景着色，但也不宜过短，过短可导致假阴性染色。

（8）复染、脱水、透亮、封固

免疫组化复染一般只需苏木素浅淡的染色（1-3分钟），苏木素的配方不同，但首选的是Harris

苏木素衬染。在经0.1%盐酸酒精分化，自来水蓝化，常规脱水透亮后封片。

6、标准化试验比照的设立

免疫组化比照试验的设立在免疫组织化标准化中是极其必要的，正确设立阳性、阴性比照，

才能确保免疫组化染色过程的精确性、抗体及相关试剂有效性，是对技术人员试验操作和试

剂供应商供应试剂质量的验证，也是对患者的负责。比照的设立包括试剂比照和组织比照，

分别作为阳性和阴性比照。

（1）试剂比照：主要是为了确定所运用的一抗和检测试剂盒的特异性，替代比照是运用与

一抗相同种属来源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或运用PBS代替一抗进行染色。

Vimentin抗体可以作为免疫组化染色中一种很有用的阳性比照试剂，在每次免疫组化染色中

加入Vimentin染色作为阳性比照，可以视察甲醛固定后抗原表达的敏感性，对甲醛固定后

抗原损伤的程度进行分析。

(2)组织比照：组织比照试验有阳性比照、阴性比照和组织内部比照。

①阳性比照：比照组织中含有已知的抗原，常用的阳性比照有多组织蜡块、组织芯片等

②阴性比照：用确定不含有待测抗原的组织作为阴性比照组织

③组织内部比照：待测组织自身含有某种相关抗原，如淋巴结内肯定含有血管内皮细胞，在

视察外部阳性和阴性的同时，也要留意到内部的表达状况，有时候可以起到相当关键的作用。

当然，有不少染色或病例缺乏内阳性比照，若对染色反应有疑问，只能选用另外的阳性比照

片核实，若内(或外)阳性比照是组织免疫反应阴性，瘤组织阳性则表达假阳性：瘤组织阴

性则表明假阴性，只有阳性比照染色阳性，瘤组织反应才属真实，除了视察内阳性比照外，

还要看内阳性比照是否有非特异性反应。

7、免疫组化染色结果正确判读

试验室染色结果的视察、染色结果的判定须要丰富的阅历，免疫组化染色最终是否能得到正

确的结论，关键还要看对染色结果如何评价，在推断免疫组化染色结果时，为确保其精确性,

必须要留意：

①首先应视察常规石蜡切片，形成初步诊断看法，在视察免疫组化染色结果时，应以7T意义

的组织/细胞为准，即主要视察有意义的组织/细胞的反应是阳性反应还是阴性反应；

②免疫组化染色结果必需建立在组织阳性比照和阴性比照试验有效的基础上，这是正确推断

染色结果的前提。只有当阳性比照呈阳性反应，阴性比照呈阴性反应，且背景清楚时才能从

正反两面说明抗体的稀释度和效价精确、染色方法和步骤精确无误、无交叉反应及非特异性

染色;

③染色阳性结果应在预期的组织/细胞结构上定位清楚精确。阳性表达有强弱之分，只要在

抗原的特定部位上，即使有少数细胞有抗原表达，也应视为阳性表达；

④阴性结果是组织细胞内预期区域中未见抗原表达；

⑤免疫组化染色结果为病理诊断协助信息，当免疫组化染色结果与HE诊断不相符或发生冲

突时，应以HE诊断为标准，而不能简洁的用免疫组化染色结果推翻、否定HE诊断，应在

多做抗体标记并结合临床资料及试验