免疫组化染色技术

［分享］免疫组织化学染色技术

第一节常规组织学染色技术概述

宏观微观超微结构基因水平

组织形态学研究技术的种类：

一、病理大体组织标本的染色方法

在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方

法对标本进行染色，将病变搭官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以使丁•区分大体标

本的不同成分和病变特点.如：

..脂肪组织染色法

目的：重要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色

试剂：苏丹III或苏丹IV

结果：病变处脂肪组织呈橙黄色

..初期心肌梗死礴法

目的：显示初期心肌梗死的区域

试剂:0.1%NBT(硝基四嚏蓝)/0.2mol/LPBS(pH7.6)

方法：将2-3mm厚新鲜心肌大片放入试剂中，37°C将育20min。

结果：正常心肌呈蓝色，初期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。

注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。

二、光学显微镜下的组织学染色方法

.常规HE染色(hematoxylinandeosinstaining)

.组织学特殊染色

l.Mallor.三染色、Masson三染色

2.神经纤维的镀银染色

3.其他的特殊染色，涉及钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等

上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。

三、超微结构的观测

.光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2Pm

有效放大倍数最高不超过2023倍。

电镜的分辨率最佳可达0/4nm,放大倍率最高可达100万倍。

第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemicaltechnique

由于该技术重要是用于研究和观测细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因

此现又称为免疫细胞化学技术。

根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：

1.免疫荧光细胞化学技术

2.免疫酶细胞化学技术

3.免疫铁蛋白技术

4.免疫金-银细胞化学技术

5.免疫电子显微镜技术

一、免疫组织化学染色方法的原理

.抗原(antigen)

1.定义：是一类在适合条件卜.能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效

应物质(抗体和效应细胞)在体内或体外发生特异性结合反映的物质。抗原具有两种性能：

(1)免疫原性(immunogenicity)指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。

(2)反映原性(rcactogenicity)指抗原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答产物发生特异

性反映的特性。

2.抗原的分类---完全抗原、半抗原

免疫学分类

胸腺依赖抗原与非依赖抗原

外源性抗原：微生物、花粉等

内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等

临床分类同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原

异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原

.抗体(antibody)

1.定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞,

由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反映的球蛋白，称为抗体。

大部分抗体电泳后位于Y区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一

类球蛋白分了一统一命名为免疫球蛋白(immimoglobin,1g)。

2.抗体的种类:五类,即IgA.IgD.IgE>IgG>IgM

免疫组织化学染色技术中.使用的抗体重要是IgG,个别情况下使用IgG的亚型，多为IgGL

.免疫组织化学染色的反映原理及显色原理

1.免疫组织化学染色的反映原理

..染色反映的最基本原理是抗原抗体的反映.

..通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某

种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反映的部位产生肉眼可观测到的颜色以拟定所要

检测的抗原是否存在。

..通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存

在与否。

2.免疫组税化学染色的显色原理

(1)基本原理

荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。

n直接法：是将能直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原

反映，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。

n间接法：是将酣标记在第二抗体上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。

..间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备

的多克隆抗体，单克隆抗体是由小鼠制备的。

•.第二抗体是第•抗体的抗体，所以只要不同的第•抗体均来自同•种属动物，同标记的第

二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体

的麻烦。..通过某种技术增长第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。

IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。

(2)显色的基本程序1抗孵育切片或细胞涂片2抗(酶标抗体)孵育切片发色剂显色(核

复染)

(3)酶标抗体法的显色原理及显色剂

..辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)

HRP+H2O2HRP・H2O2HRP・H2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催化的酶促反映第一步

是特异的，其余反映是非毋异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使反映的终产物

呈现不同的颜色，如:

CN(4-chloro-1-naphthol)为蓝色

TMB(tetramethyl-benzidine)为深蓝色

AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole)为红色

DAB(3,3-diaminobenzidine)为棕色

..碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)是以AS-Mx为底物,FB/FR(Fastblue/Fastred)为发色

剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。

..ALP标记的抗体重:要用于内源性过氧化物的含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。

..由于组织细胞内具有内源性ALP,在显色液中需加入终浓度为2-4mol/L的左旋咪哇

(levamisole),大多数内源性ALP活性可被克制。

..葡萄糖氧化薛(glucoseoxidase,GOD)是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为B-D-葡萄糖

67mg、NBT6.7ing>PMS(phenazinemethyl-sulfate)0.167mg>0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml,

370c孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明

后封片，长期保存。

(4)核复染

在显色后，特别是用DAB显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示

蓝色.与胞质中的DAB棕色形成对比。但用AEC招色后不能用苏木素做核灯奥.由于配制

苏木素染料中使用酒精作为介质，可使AEC的红色终产物褪色，且AEC显色后只能用水溶

性封固剂封片。

第三节免疫组织化学染色环节

(-)ABC或SP法进行石蜡切片染色的重要环节

1.组织材料的采用；

2.组织块的固定；

3.组织块的脱水、透明及石蜡包埋;

4.石蜡切片的制备；

5.石蜡切片的脱蜡及水化;

6.克制内源性过氧化物酶活性；

7.PBS洗涤切片；

8.抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；

9.PBS洗涤切片；

10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特

异性吸附；

II.用特异性一抗（单克隆、多克隆）孵育切片；

I2.PBS（可加入Twee.2（）#,PBST）洗涤切片；

13.用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；

14.用PBS或PBST洗涤切片；

15.滴加SP试剂或ABC试剂；

I6.PBS或PBST洗涤切片；

17.DAB或AEC显色；

18.自来水洗涤切片，终止显色；

19.用苏木素做核复染；

20.切片脱水、透明，树胶封片。

（二）各染色环节的具体懊作及注意事项

1.组织材料的采用

活检组织

组织标本手术切除标本

尸检标本

实验组织或培养细胞

..活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的狙织体积小，因活检钳直接钳取，常

受压过度而变性，因此，活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采用重要的病灶

区。

..抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑切取重要病灶。病灶与正常组

织交界区及远距病灶的正常区。

.JI检组织

由干取材时一般均已超过死亡后2小时以匕组织有不同限度臼溶，其抗原或变性消失或有

严重的弥散现象。法医尸检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响浬重,

而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。

..实验动物标本

新鲜，可按需要取材，特别是很多情况下是在灌流固定后取材，组织结构和抗原保持良好,

非常合用于免疫组织化学染色。

..取材标本的大小

尸检组织材料大小以IcmXlcmX0.2cm为宜。实验动物常用大鼠或小鼠，其脏器体积小,

有助于取材。一般标本体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。

2.组织块的固定、水洗

(1)固定液：种类较多，常用的有以下几种：

..4%甲醛/PBS(pH727.4)

配制方法：10ml40%甲醛(formalin)+90mlPBS

使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，还可形成甲酸，影响染色结果。

..4%多聚甲醛/PBS(pH727.4)

配制方法:40g多聚甲醛(parafonnaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH727.4),搅拌、加热至

60oC,同时滴入INNaOH至溶液完全透明。冷却后用INHC1调PH值至727.4,再用

0.1mol/LPB将溶液加至1000mL

.固定期间：一般根据组织块大小及性质，固定2・24小时，

.固定原理.：甲醛通过使蛋白分了发生交联而产生固定作用。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反

映，并能保存脂类和类脂体。

.不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体

的结合。

(2)水洗

一冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定期间长短有关C尸检组织和大动物绢织一般

冲洗24小时，小动物组织冲洗2-10小时。新鲜标本固定期间短，冲洗时间也相应缩短，固

定期间长的标本，冲洗时间也需延长。冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎紧,

防止组织块漏出。用•根适当的胶管，一端接自来水，•瑞插入瓶底，使水缓慢流出，或将组

织块放入洗涤箧中，放在水盆内冲洗。对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水浸泡

即可。

3.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋

(1)脱水

脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以与水以任何比例混合，脱水

能力强，并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度不久，克•组织有较明显的收缩作用。为避免

组织过度收缩，应从低浓度开始，然后再依次增长其浓度。在常温卜或40c下进行，以减少

抗原的损失。70%80%90%95%100%100%

(2)透明

..为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须通过一种既能与酒精形容，又能溶解与石蜡

的溶剂。通过溶剂的媒介作用而达成石蜡浸入组织块的目的。

..透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。

..一般通过2-3次纯二甲苯溶液透明，每次10-15分钟，同时也应根据组织的种类和组织块大

小以及二甲苯的新鲜限度加以调整，不应机械照搬。

(3)浸蜡

组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充足渗入组织只，常需通过

2-3次石蜡浸渍。用于免发组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在60oC以下浸透。

(4)包埋

浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。

4.石蜡切片的制作

（1）载玻片涂片的制作

防脱片剂:APES（3-aminopropyltriethoxysilane多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）＞甲醛-甘

油明胶。

APES涂片的制作

原理:APES是一种新型玻片粘附剂，与•般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰

作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保存时间

较久。

具体操作方法：

将载玻片用酸解决后，用95%酒精浸泡，再用

绸布擦干，清除表面的污渍：将干净的载玻片放入丙酮内5min；,将我玻片用镶子夹住浸入

APES试剂（1mlAPES+50ml丙酮）1-2次；

纯丙酮内洗2次后，37oC过夜，干燥；

用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。

.多聚赖氨酸（Poly-L-lysine,PLL）

试剂配制：PLL0.5g+蒸溜水100ml也可根据提供的方法配制。可于4oC或-20oC保存备

用，可反复冻存，效果无明显影响。

..涂片前将其稀释10-50倍，均匀涂在解决后干净的载玻片上,37oC下干燥过夜。

..甲醛-甘油明胶

..试剂:40%甲醛2.5ml,明胶0.5g,蒸储水加至100ml。

..配制方法：用一部分蒸馆水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后加入甲醛,最后补充

蒸倒水至100ml,混匀即可。

粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经

抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。

(2)制做切片

..切片机：旋转式或滑动式切片机。

..切片厚度57Um.

..展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展

开切片(水浴锅上加热平皿)。

..捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。

..切片干燥:37oC过夜，干燥。

5.石蟒切片的脱腊及水化

..脱蜡：将切片放入染色筐中，二甲苯I、1【、III各15分钟脱腊，

..水化：100%酒精I、II中各10分钟、95%ALC5分钟、90%ALC5分钟、80%ALC5分钟、

70%

6.清除内源性过氧化物酌活性

由于常规免疫组织化学染色的最后显色是用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和

DAB(3,3-dianiinobenzidinetetra-hydrochloride),而组织口常具有内源性过氧化物酶，为防止

出现假阳性反映和减少背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。

..具体方法：将切片置入甲酥(PBS)-H2O2液中20~3。分绅

..试剂：纯甲醉99ml30%,H2O21ml充足混匀，使最后浓度为0.3%,或0.01mlPBS(pH

7.2~7.4)99ml30%H2O21ml

7.PBS洗涤切片

经甲醇-H2O2或PBS-H2O2解决后的切片先用蒸镭水洗一次5min,再用PBS洗5niinX3次。

..O.Olmol/LPBS(pH7.2~7.4)的配制:

NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23g

NaCl8.0g蒸储水加至100()mi

..为防止抗体与组织发生静电吸附而产生非特异性染色，可在PBS中加入Tween20#,制成含

O.I%Tween2O#的PBS。Tween20#为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。

8.抗原修爱(antigenretrieval,AR)

某些抗原的免疫组化染色不需要此环节即可染色，如横纹肌中的myoglobin(Mb)、actin,

myosin、脑组织中的S-10。蛋白、GFAP、血型抗原ABH、生长激素(growthhormone］、胰

岛素、波形蛋白(vimentin)、降钙素(calcitonin)等。但有一部分抗原物质或检测的因子等于组

织经甲醛固定后，因蛋白质的交联，将抗原封闭或发生变性，因此需要热修复或蛋白酹消

化。

目前机理尚不清楚，但是以高温、高压对常规固定的石喑切片进行抗原修复解决经验表白,

可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性，现已广泛用于技术中。特别对本来仅

表达在冰冻切片上的抗原.运用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。

(1)抗原热修复

..方法

①微波中96℃10-20min

②直接加热法lOOClOmin

③高压锅/消得锅I20℃10min

..其他：水浴锅100℃10minX2及真空加热10min等。

.•热修复的介质

①0.01mol/LpH6.0柠檬酸缓冲液

@0.05mol/LTris-HCI缓冲液(pH1~12)

@0.01mol/LpH7.0PBS

④2%硫酸铝

⑤2%硝酸铅

⑥生理盐水

⑦蒸偏水

文本框：溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而pH值则影响较大，缓冲液以柠檬酸缓

冲液和Tris-HCl缓冲液较常用。溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而pH值则影响较

大,缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液较常用。

..温度与修复时间的关系：

许多的实验结果表白：温度高修复时间短，如Ki-67和P-gp的检测，运用同一切片，达成相

同染色结果需要：①100℃20min；②90c3()min；③8()℃50min；④70℃20h

..操作流程

①微波解决：将切片插入25片塑料架上，在250ml塑盒内加入200ml缓冲液，将微波高档

加温缓冲液至90C+,取出后自然冷却至室温后蒸储水洗,PBS洗。

②水浴锅法：一种传统的抗原修复方法，一方面调节水温达95℃左右，将切片置入内含

200ml缓冲液的塑料盒或烧杯内，放入水浴锅，温度平衡后开始计算时间20min,取出容器

后自然冷却到室温。

③压力锅法：不锈钢高压锅内加入一定量的缓冲液，加热锅使液体煮沸，将切片加入切片架

并置入锅内，盖上锅盖，不加阀，开始冒气计时50min,关闭气阀，使之加压10min。再将压

力锅置于流水槽中冲洗10min,冷却后取出切片，PBS洗。

..最佳修复方法的选择

选择最佳的修复方法设计表

柠檬酸BufferpH12pH6pH10-1ITris-HCIBufferpH12pH7-8pH10-11

微波100℃10minX2slide1slide2slide3

压力锅120℃10minslide4slide5slide6

微波或水浴9(TC30minslide7slide8slide9slide10作对或不作任何解决

..抗原热修复应注意的问题

有些抗体在石蜡或冰冻切片上呈阴性反映，但石蜡切片月抗原修复后却能很好显示，对某些

应表达在胞浆或膜上的抗原，经修复后，绝大部分表达在核内。而有些表达在核内的抗原经

修复后会出现在胞浆内，因此，在使用该方法时一定要小心，对结果的鉴定也要做出客观的

分析，同时在操作过程中还

注意以下问题：

①热解决后应自然冷却切片。

②热解决液不能让其煮干，

③不要任何抗原的检测都使用该方法。

④一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。

⑤一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核的影响

较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。

⑥假如在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，得不出好的染色结果，或经修复后，抗原定位

发生改变，可改用一些不常用的缓冲液或加一些鳌合剂，如EDTA或EGTA等可改变某些抗

原的修复。

(2)蛋白酶消化法

..原理：蛋白酶消化可以去除覆盖在抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而

引起的交联被晦消化打开而引起暴露抗原决定簇的作用，使第一抗体能与抗原部分结合，提

高阳性检测率。

..注意事项：用于IHC消化的酶很多，所选择酶的种类、使用的浓度、pH值、消化时间及温

度等均要视组织固定的不同、所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，通过预实验摸索而

拟定。

..常用的消化酶类：胰蛋白酹和蛋白陋K,此两种酶重要是用于检测细胞内抗原切片的消化,

如Keratin、CEA.GFAP等。另一种是胃蛋白酶，重要是用于细胞间质抗原检测切片的消化，如

纤连蛋白(fibronectin),各型胶原等。

..消化时间及温度：一般讲，消化时间与组织固定的长短呈正比。一般蛋白酶的消化时间

5~10~20min,视切片固定期间的长短而定，一般在常温下进行，也需做预实验进行对比。

(3)酶消化液的配制

除了商业销售的成品，可按说明书使用外，还可自行配制。

①0.1%胰蛋白酶

胰蛋白酶0.1g

0.1%氯化钙(pH7.8)100ml

配制方法：先配制0.1%的CaC12,用O.lmol/L的NaOH将其pH调至7.8,然后加入胰蛋白

能0.1g,溶解之。用前将胰蛋白悔液过滤，并在水浴中预热至37℃,室温下消化时间5~30min,

多用于细胞内抗原的暴露,。

②0.4%胃蛋白酶

胃蛋白酶400mg

0.1NHCI100ml

多用于间质组织免疫组化奥色切片的消化,37℃下消化时间约30min。

③0.06%蛋白酣K

蛋白酶K().06g

0.05mol/LTris-HCI(PH7.5)100ml

用法同上。

在免疫组化染色中，有时通过度固定的标本，影响-■抗与抗原的结合，用蛋白酶溶液消化,

起到暴露抗原部分的作用，消化时间应根据不同组织而异。总之，在保持组织形态不破坏的

前提下，宜尽量消化时间延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。

9.经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。

10.用与制备二抗相同的动物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特异性吸附。

..组织中非抗原抗体反映出现的阳性染色称为非特异性背景染色。

..最常见的因素是蛋白（第一抗体）吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。

..最有效的方法是在用第一抗体孵育切片前，用与制备第二抗体相同动物的非免疫血清封闭

组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合（在室温下进行）。

..非免疫血清的稀释度1:5-1:20,还可加入BSA（bovineserumalbumin）使稀释后的非免疫血

清中含0.1~6%的BSA,可取得更佳的染色效果，阻止非特异性背景染色。该方法是减少非

特异性背景染色的有效方法。

11.用特异性一抗孵育切片

研究组织细胞中的某种抗原是否存在，应用免疫组化染色，就要选用针对这种抗原的特异性

抗体。现在国际上有许多公司生产免疫组化试剂，涉及一抗、二抗、显色剂，并制成了成套

的试剂盒，但一般试剂盒中不涉及一抗，研究者可根据一抗的种属性，选择具有与一抗相匹

配的二抗的试剂盒。

①一抗的种属来源

一抗可来源于各种种属的动物，常见是来自家兔、山羊或小鼠，偶见来自马。一般来自家兔

和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗休，而来自小鼠的多是单克隆的IgG抗休.根据实验动物

或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。

②抗体剂型及滴度检查

我国现在使用的绝大多数都是国外进口的试剂，涉及一抗和含二抗的试剂盒。

..国外生产的一抗一般浓度都是1（）0-200ug/ml,但国内各经销商将进口的原装抗体又进行了

分装，如提成61-0.2ml/瓶等，也经销1ml/瓶抗体，价格各不相同.

..国内各经销商乂根据需要将进口抗体进行稀释，销售的品种乂分为即用型和浓缩型（进口

原装的抗体）两种。

..在免疫组化染色中，使用即用型一抗和试剂盒一般不需稀释，直接在切片上滴加即可。

..浓缩型必须在稀释后才干使用，由于浓缩型抗体浓度高，可引起严重的非特异性染色，因

此，必须在正式染色前先用切片对不同滴度的抗体染色效果进行评价，选择浓度强度最佳,

非特异性反映（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染色。

一抗稀释滴度的评价

切片编号slide1slide2slide3slide4slide5

抗体稀释度1：501:1001:2001:4001:800

特异性染色+++++++++++++++

背景染色+++++--

③・抗体的稀释

一般稀释一抗的液体与洗涤切片的液体相同，即O.OImol/LPBSpH7.2-7A为进一步保证减

少背景染色，用于稀释一抗的PBS中也应加入制备二抗的同种动物的非免疫正常血清，有条

件的还可加入BSA,两者的浓度在1-2%即可。

④一抗的孵育时间及条件

加入适当稀稀的一抗的切片，可在常温下或37℃下保温盒内孵育，在通过正常二抗同种动

物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗涤，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴

加稀释好的第一抗体。孵育时间：30-60分钟或更长。

假如待检的抗原量很少，而增长一抗的浓度又能引起较明显的背景染色，可增长一抗的稀释

倍数，将切片放在保湿盒中置于4℃冰箱内过夜孵育，可达成满意的效果。

12.PBS洗涤切片

将用一抗孵育后的切片用PBST洗涤3次，每次5min,用冷PBS洗涤，可减少非特异性反映。

13.用针对一抗的生物素化二抗孵育切片

根据一抗的种属来源，选择相应的二抗。如：一抗是家兔抗某种抗原抗体，二抗一般选用山

羊抗家兔IgG抗体。二抗分浓缩型和即用型两种。即用型二抗不需稀释，直接使用。浓缩型

者一般用PDS直接以1:200-400倍稀释使用，室温下保湿盒内孵育30-60mino

试剂盒：浓缩型或即用型SP试剂盒、ABC试剂盒

试剂盒中包含：内源性过氧化物酶阻断剂

二抗的同种动物非免疫血清

生物素标记的抗IgG抗体（二抗）

SP试剂或ABC试剂

14.PBS洗涤切片5minX3次

15.滴加SP试剂或ABC求剂

（1）生物素-抗生物素染色（SABC或SP法）的显色原理

..ABC法的染色原理

很早以前人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，会引起明显的“维生素H缺少症”，也称

为“蛋白质伤害”。经研究发现，在鸡蛋白中具有一种碱性蛋白，分子量为68kD,属于糖蛋

白，当时命名为卵白素（avidin）。机体中尚有种物质叫维生素H,又称为生物素（biulin）,

是一种小分子的维生素，广泛分布于动植物组织中，以辅陋的形式参与各种羟化酹反映，分

子量为244Do

卵白素具有4个同VilaminH（生物素）亲和力极高的结合点。给动物饲以大量的鸡蛋白所

致的维生素H缺少，就是由于卵白素和大量维生素H结合所致。研究者根据这两种物质的

特点，提出了卵白素-生物素免疫染色系统。由于习惯上将维生素H称为生物素，为便于理

解，我国免疫细胞化学作者将卵白素称为抗生物素或亲和素，因此卵白素-生物素免疫染色

系统乂称为抗生物素-生物素免疫染色法。

此外，生物素的另一特点是它可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。同时，生物

素经活化后还可同过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。根据上述这些抗生物素-

生物素的反映原理和特性，1981年许世明设计出了免疫组织化学的ABC法

（avidin-biotinperoxidasecomplexmethod,ABC）,并已制成了商品化的试剂盒。

ABC法免疫组化的试剂盒中除涉及制备二抗的同一种属动物的非免疫血清、生物素标记的

二抗外，还涉及:A试剂（抗生物素）和B试剂（生物素.过氧化物酶复合物）。在使用前半小时,

将两种试剂按说明书规定互相混合，形成复合物，一般是在5ml的PBS中加一滴A试剂（约

50n1）,混匀后再加一滴B试剂（约50U1）,混匀，半小时后加至通过生物素标记的二抗孵育

的切片上，室温下保湿盒内孵育30-60分钟。

..SP法的染色原理

基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同，是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗

生物素蛋白连接的过氧化物陋及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

Antigen

BiotinylatcdsecondantibodyP-OP-OP-OP-OBiotinAvidinHRPPrimary

antibodyAvidin-biotin-peroxidasecomplex

文本框：IllustrationofABCmethod

IllustrationofABCmethod

Biotin

AgAgPrimaryanlibodyBiotinylatedsecondaryantibodySPcomplex

文本框：Streptavidin

Streptavidin

文本框：Enzyme:HRPorAP

Enzyme:HRPorAP

文本框：IllustrationofSPmethod

IllustrationofSPmethod

..SABC法的染色原理及特点

(1)基本原理

链酶亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，分子量60kD,不含糖链，等电点PI

6.0。与亲和素相同也有四个生物素结合点，亲和力极高。与亲和素相比是一种更近于完美的

生物素结合蛋白。链酶亲和素同一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链酶亲和素-生物

素-酶复合物。这种复合物中至少存在•个尚未被生物素占据的亲和素结合位点，可以和各

种生物素标记的抗体结合,这种复合物即是SABC(streptavidin-biotincomplex)。

⑵SABC的特点

..高敏感性：.•低背景；..简便快速；..结果稳定

(2)EnVison.系统染色原理

..与ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是将二抗与多聚螯合物酶(HRP或AP)

通过化学方法连接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上具有大展的酶分子和二抗，因

此，比ABC法、SP法和SABC法具有更显著的放大作月，可高出几十倍。由于多聚物

在人或动物体内不存在，因此，无非特异性染色，背景着色极轻。

..染色环节简便，在一抗反映后，切片经PBS洗涤后即可加入EnVison.系统试剂，再经PBS

洗涤后，可进行显色。

AgAgPrimaryantibodySecondaryantibody

文本框：Enzyme,APorHRP

Enzyme,APorHRP

文本框：IllustrationofEnVisionmethod

IllustrationofEnVisionmethod

16.PBS洗涤切片,5minX3。

17.DAB显色或AEC显色，或碱性磷酸酶标记的NBT显色。

(1)DAB显色液配置

DAB20-50mg

O.Olmol/LPBS(pH7.2-7.4)100ml或0.05mul/LTris-HCl(pH7.6)

30%H20220-40g!

配置方法：先以少量PBS或Tris-HQ缓冲液溶解DAB,然后再加入余量缓冲液，在显色前加

入30%H2O2o将洗涤后的切片浸入显色液中5-10-20min,应闭光下反映，并随时在显微镜

下观测结果，随时终止反映，也可使用商品化的即用型DAB。阳性反映部分为棕色，经核复

染后，脱水、透明、树胶封片，但由于有致癌作用，配置时应注意防护。

(2)AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)显色液

AEC20mg

二甲基甲酰胺(DMF)2.5ml

0.05mol/L醋酸缓冲液(pH5.5)50ml

30%H2O25pl

配置方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充足混匀过滤。临显色前加入H2O2,

切片显色时间5-20min.也可使用商品化的AEC显色。该显色液作用后，阳性部分为红色,

如以苏木素或亮绿复染核后，效果更佳，但终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

(3)碱性磷酸酶(AKP)标记的NBT显色液

预先配置以卜.试剂：

A液：5%NBT(Nitro-blue-tetrazolium)

称取0.5gNBT溶于10ml70%的DMF,充足混合，保存于4℃,

也可分装成小份,-20℃保存，用前复至室温。

B液：5%BCIP(5-brorno-4-chloro-3-indolyl-phosphate)

称取BCIP0.5g,溶于10mlDMF内，混匀,4℃成分装，俣存

于-20C,用前复至室温。

显色液：取A液4011I.加入到装有10ml的0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH9.5,含

O.lmol/LNaCl,5mmol/LMgC12)管内充足混匀，再加入B液40mo1,轻轻混匀即可，最佳临

用前就配置.，但在显色液中需加入Levamisole(左旋咪哩)在显微镜下随时观测显色反映，阳

性结果为蓝色或紫色沉淀，

上述所提及的各种显色液目前均有以试剂盒形式出售，只要按说明操作即可，但价格较贵。

18.自来水洗涤切片、核复染、脱水、透明、

树胶封片

经显色后，将切片放入自来水中，流水轻冲洗10分钟，再经蒸镭水洗后，放入苏木素中做核

复染(显色切片)20s-1min,经酒精-HC1分化后，在放入自来水中继续分化细胞核至满意为

止。

经70%、80%、9()%、95%、100%I、100%II酒精脱水各5min,二甲苯透明后，用树胶封

片。

ImmunostainingofGFAPand1L-8GFAP,SPGFAP,SPIL-8,ABCIL-8.ABCx400x400x400x200

ImmunostaininglmmunostainingofFas,FasLandofFas,FasLandCaspasesCaspasesFas,

EnVisonFasL,EnVisonx400x400x400x400Caspase-3.SABCCaspase-6,SABC

第三节免疫组化染色的对照设立

在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反映产物，的确是抗原与相应的特异性抗体

反映所产生的。由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反映的因素很多，因此对免

疫组织化学染色结果的评价必须设立对照组才干做出对的的判断。

常用的对照组有以下几种：

一、阳性对照

用己证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样解决后，进行免疫组化染色，结果应为阳

性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染

色过程中各个环节以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性

结果时，阳性对照呈阳性反映，可排除待检标本假阳性的也许。所以若预期染色结果是阴性

时，就必须设阳性对照。

二、阴性对照

用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对照可证实组织内若不含靶抗原,

就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反映等因素导致的“假阳性”结

果。

三、空白对照

是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一次，染色结果应为阴性，说明染色方

法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酣、碱性磷酸酣、自发荧光等物质引起的非特异性显

色。

四、替代对照

用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对

照中用非免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。这可证明待

检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内

待检抗原的特异性反映的结果。但使用的商品抗体往往不能用同一种动物的免疫前血清做替

代对照，也可用未经免疫的同种动物血清，即非免疫血清替代一抗。

五、吸取实验对照

用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反映，抗体结合点所有被抗原结合，这种被抗原吸取

的抗体不能再与组织内的抗原反映，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。

六、自身对照

用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反映与阴性结构同在一个视野中,

互相印证，这自身就是对•阳性反映的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不

科学的C必须增长如空白对照、替代对照等，才干使染色结果得到认可C现代国际卜发表文

章，一般在免疫组化染色的同时，还须有Westernblotting做相应蛋白质检测的实验结果加以

证实。

冰冻切片的免疫组织化学染色

冰冻切片的免疫组织化学染色也是常用的技术，但一般情况下不用，由于冰冻切片操作较复

杂，不易操作，规定标本必须是深低温快速冷冻，标本不如石蜡块易保存等，但优点是组织

的各种抗原保存好。因此一般情况下，只有在应用石蜡切片进行免疫组化染色，涉及通过抗

原热修复或蛋白酶消化后.仍不能得到阳性染色结果时，才考虑使用冰冻切片染色。

第四节双重免疫组织化学染色

应用免疫组织化学染色方法在同一张组织切片或细胞涂片上同时或先后显示两种抗原成分,

即为双重免疫标记。光镜下通过标记物或其反映生成物的颜色来标记不同的抗原成分，以郡

助研究者了解具有这些不同抗原的各类细胞、组织之间的互相关系。

也许碰到的问题是：后一种免疫染色所用的抗体系统也许与前一种染色所用的抗体系统发

生交叉反映，从而导致叠加污染，失去双重染色的准确性和意义。为避免这种交叉反映，研

究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分为洗脱法和非洗脱法。

一、洗脱法

1.基本原理：

可选用同种动物产生的特异性抗体(如兔抗X和兔抗YIgG抗体)为一抗，另一种动物相

应的抗体(如生物素标记的羊抗兔IgG抗体)为二抗，用ABC.SP或SABC方法，或应用

EnVison方法进行染色，用不同的酶和底物系统呈色。在完毕第一种免疫组化染色后，将抗

原抗体复合物洗脱，再做第二种染色。

2.洗脱液：

(1)甘氨酸-盐酸溶液(pH2.2):0.1mol/L盐酸+0/757%(0.Imol/L)甘氨酸溶液95ml(0.lmol/L

的氯化钠溶液配制)。用该溶液洗切片2h,一般可以消除第一种染色的抗体系统与下一种染

色的交叉反映，但保存显色反映所得的颜色。

（2）高锌酸钾-硫酸洗脱液：1ml2.5%KMnO4,1ml5%H2s04,加140ml蒸馅水混匀。

3.洗脱法的一般环节

..按常规做第一种免疫组化染色，可选用HRP为标记物，显色底物为4-氯蔡酚，阳性部位反

映产物为蓝色。

..开始第二种染色前，先将切片经蒸帽水洗，再用酸性溶液洗脱。如用pH2.2的甘氨酸-盐酸

溶液须浸洗2h左右，如用高钵酸钾-硫酸洗脱液则要5min左右，再将切片移入0.5%的焦亚

硫酸钠（Na2s205）水溶液中还原30s,经水洗10-20min,蒸储水洗5min,

..按常规进行下一种免疫组化染色。第二种染色选用DAB为显色底物，生成物呈棕褐色，与

第一种染色中生成的蓝色可形成比较鲜明的对比。

二、非洗脱法

（-）直接法

假如采用同一种酶标记在不同的第一抗体上，则只能用顺序染色法。即先做第一种染色，用

第一种底物与己定位的酶反映呈色，再进行第二种染色。在酶定位于第二种抗原及抗酶系统,

而特异性抗体及相应的二抗又是从不同动物产生的，则可将双重染色的试剂混合在一起应

用，节省染色时间，仅仅在两种的与各自的底物反映显色时按顺序进行。

（二）标记双抗原法

两种一抗分别来自不同种动物，二抗分别来自此外两种不同动物，且标记两种酶分别作为标

记物做双重染色时，一般第一种染色选用HRP,而在第二种染色中可按需要选择不同的酶。

如选用ALP.还可用不同的底物呈现不同的颜色，如坚固蓝呈现的蓝色可与DAB的棕色形

成良好的对比，坚固红虽然与DAB的棕色对比相对较差，但也可选用。

（三）活性灭活法

是一种新建立的方法，重要是根据通过在溶液中加热灭活第一次染色中的抗原、抗体和酣活

性后再进行第二种染色的原理而设计的。用于灭活的溶液介质一般是柠檬酸缓冲液（pH6.0）,

灭活的温度一般是96℃左右。本法的优点是用于染色的一抗、二抗可分别来自于同一种动

物，大大方便了抗体的选择，只是选用不同的显色酶和底物。但缺陷是所要显示的第二种抗

原必须耐热。

DoubleImmunostainingofFasandFasLDoubleImmunostainingofFasandFas

LEnVisonEnVisonEnVisonEnVisonx400x400x400x400

第五节细胞凋亡的检测技术

一、凋亡细胞的形态学改变

细胞表面：伪足、微绒毛等消失

细胞体形态：细胞皱缩、变形，体积变小

细胞核：染色质浓缩、初期染色质聚集于核膜边，呈新月形或环形，晚期碎裂

细胞器：密集但形态及结构完整，初期内质网短暂扩张

细胞膜：完好.晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体

在组织中表现：经常以单个细胞散在发生

周边组织反映：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞、上皮细胞吞噬、降解，不发生炎症反映

发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官萎缩、细胞介导的免疫杀伤机制、

小剂量毒素作用以及多种病理生理状态

二、细胞凋亡的形态学检;则方法

（一）凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测

1.制片

（1）常规组织学切片，进行脱蜡和水化。

（2）培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离

心制片（250g,离心5min）,并事先将我玻片用l%BSA解决，使细胞易于贴附。离心后涂

片，稍经空气中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4c下固定15-30min.然后转入80%乙醉后固定

l-2h,保存于-20C待用。

2.染色方法

可用多种方法进行染色。

(1)可采用常规的组织学染色方法，如Giemsa染色、HE染色或Mayer苏木素染色。

(2)采用荧光染料染色，如DAPI(4',6'-diamidino-2-phenylindole)、PI(propidiumiodide)

和7-AAD(7-aminoacetinomycinD)o其染色浓度为：DAPI1-2Pg/ml：PI5-10Pg/ml；7-AAD

10-20ug/mL由于PI染料同时也与RNA结合，所以应将细胞先用RNA晦消化(50Kunitz

单位的RNA酶,37℃下作用15min或室温下30min)后，再进行PI染色.

3.结果观测

典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结构，可见核染色

质呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片：在组织切片上可见巨噬细胞或邻近的上皮细胞

吞噬凋亡细胞或凋亡小体，

(-)凋亡细胞的电镜观测

采用电镜的常规方法固定、包埋和制片。可用透射电镜或扫描电镜进行观测。

透射电镜下，凋亡细胞核染色质浓缩、核膜消失，内质网扩张，而细胞器如线粒体等形态仍

保持良好，可见被膜结构包绕的细胞器，即凋亡小体。扫描电镜下，细胞表面结构如伪足、

微绒毛等消失，细胞膜呈现波浪状起伏“

(三)凋亡细胞的原位末断转移酶标记法(insitutcnninaldcoxynuclcotidyl

transferase-niediateddUTP-digoxigenin(biotin)nickend-labeling,TUNED

细胞凋亡的多环节机制作用的最终环节是细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质

DNA双链的断裂。大量DNA片段暴露出的3.羟基在末断转移酶(terminal

deoxynucleotidyltransferase.TdT)或DNA多聚酹的作用下，与生物素或地高辛标记的核昔

酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP,使凋亡细胞被特异性地标

记和显示出来。

1.试剂盒及标记法种类

凋亡细胞检测试剂盒：

Phoenix公司(SanDiego,USA)

BoehringerMannheim公司(Indianapolis,USA)

Imergen公司(Purchase,USA)

Oncor公司(Gaithersburg,USA)

只要按试剂盒中所提供的说明书进行操作，均可获得满意的结果。可根据需要选用荧光标记

还是HRP-DAB标记。

2.标记方法

荧光显色的标记法：..生物素结合的dUTP(biotin-dUTP)标记法；..地高辛结合的dUTP

(digoxigcnin-dUTP)标记法：..澳-dUTP(bromo-dUTP)标记法,一般用结合了avidin的异

硫翅酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)与生物素化的二抗或标记了FITC的抗地高

辛抗体或抗BrdUrd抗体作为发色源，凋亡的细胞核呈绿色荧光。

HRP-DAB标记怯：..dUTP(biotin-dUTP)标记法；

..地高辛结合的dUTP(digoxigcnin-dUTP)标记法，用结合了HRP的生物素二抗或抗地高辛

抗体及DAB作为发色源，凋亡细胞呈棕褐色。

3.操作环节(以地高辛结合的dUTP标记法为例)

⑴试剂

①5K浓度的TdT反映缓冲液，具有以下成分

1mol/Lpotassium(orsodium)cacodylatc125mol/LTris-HCl(4℃,pH6.6)

1.25mg/mlbovineserumalbumin(BSA)1Ommol/Lcobaltchloride

②digoxigenin-dUTP③TdT的©proleinaseK⑤生物素化的抗地高辛抗体

@SABC试剂@DAB

(1)标本的制备

①经福尔马林固定的常规组织石蜡切片;

②冰冻切片,4%多聚甲醛4c下固定10-30min,80%乙醉后固定2h以上（或在80%乙醇内保

存于-20℃冰箱待用）；

③各种临床细胞涂片、刮片、脱落细胞制片及培养细胞的制片等，用1-4%多聚甲醛4c下固

定15-30min,然后在80%乙醇内后固定2h以上。

（2）标本的解决

石蜡组织切片在脱蜡和水化后，先用20ug/ml蛋白酶K作用l0-20min后，再进行其他环节。

其余细胞制片均需水化后,用PBS洗涤三次，每次lOmin,然后进行标记。

（3）新配制的3%H2O2,室温下解决lOmin,蒸储水洗涤切片2minX3次。

（4）滴加用TBS以1:100新鲜稀释的proteinaseK,37c消化5-15min,TBS洗涤2minX3次。

（细胞涂片和冰冻切片消化l-5min；新鲜石蜡切片5-10min；陈旧石蜡切片10-15min）

（5）标本加标记缓冲液20u1/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-dUTP各1

UI,加入18U1标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余的液体后加标记液,20U1/片。置切片

于保湿合中，37℃标记2h,假如阳性结果不强，可采用4c标记过夜，再加37℃标记2h,

（6）TBS洗2minX3次。（假如要封闭内源性生物素，就在此步进行）

（7）加封闭液50U1/片，室温下30min,甩掉封闭液，不洗。

（8）用封闭液1:100稀裁生物素化抗地高辛抗体,50片加至切片，，置样品于保湿合中,

37c反映30min,TBS洗涤2minX3次。

（9）用封闭液1:100稀释SABC:取1ml封闭液加SABC10P1,混匀后加至切片。37c反

映30min。TBS洗涤5minX4次。

（10）DAB显色：取1面蒸馅水分别加入A.B.C试剂各一滴，混匀后加至切片上，显色

I0-30min,水洗。

（II）苏木索轻度复染，水洗，脱水、透明、封片，镜检观测，棕色细胞核为阳性。