2026年高考生物终极冲刺：压轴题05 基因工程与PCR压轴必考 （ 6 大题型精析）（全国适用）（解析版）

/压轴题05基因工程与PCR压轴必考（6大题型精析）命题预测基因工程与PCR是高考生物压轴核心模块，选择+非选择双重考查，非选择常以科研情境大题形式出现，是拉开分数差距的关键，需重点突破。核心考向：1.基因工程核心工具与步骤；2.PCR技术原理与操作；3.目的基因的检测与鉴定；4.基因工程与育种、疾病治疗的实践结合；5.基因工程的伦理与安全问题；6.基因工程与其他生物技术（如细胞工程、胚胎工程）的综合应用。2026命题趋势：强化科研真实情境创设，多取材于基因编辑、转基因作物培育、基因治疗等前沿领域，跨模块、跨学科融合趋势明显，侧重考查科学思维、实验设计与知识迁移能力。备考关键：夯实核心概念与操作流程，精练情境类真题，熟练“步骤分析、原理阐释、实验设计”三类答题模板，规范术语表达，提升压轴题解题效率。高频考法1.基因工程核心工具辨析2.基因工程核心步骤分析3.PCR技术原理与操作4.目的基因的检测与鉴定5.基因工程的实践应用与伦理6.基因工程与其他生物技术综合知识·技法·思维题型01基因工程核心工具辨析类别具体内容重点知识1.限制酶：识别特定核苷酸序列，切割磷酸二酯键，产生黏性末端或平末端，具有特异性；2.DNA连接酶：连接DNA片段的磷酸二酯键，区分E・coliDNA连接酶（仅连黏性末端）和T4DNA连接酶（连黏性末端和平末端）；.载体：常用质粒（小型环状DNA，含启动子、终止子、标记基因、目的基因插入位点），此外还有噬菌体、动植物病毒，需具备自我复制、多克隆位点、标记基因等条件答题技巧1.工具功能区分：限制酶“切割”、DNA连接酶“连接”、载体“携带目的基因”，避免功能混淆；2.标记基因答题要点：明确其作用是“筛选含目的基因的受体细胞”，常见类型（抗生素抗性基因、荧光蛋白基因）及筛选原理；术语规范：表述时需明确酶的具体作用对象（如“限制酶切割特定核苷酸序列”），载体的关键组成部分不可遗漏题型02基因工程核心步骤分析类别具体内容重点知识1.目的基因获取：从基因文库中获取、PCR扩增、人工合成（化学合成法，适用于已知核苷酸序列的短基因）；基因表达载体构建（核心步骤）：目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在、复制、表达和发挥作用，构建过程为“限制酶切割载体和目的基因→DNA连接酶连接→形成重组载体”；3.目的基因导入受体细胞：植物（农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法）、动物（显微注射法）、微生物（感受态细胞法，用Ca²⁺处理）；4.目的基因的检测与鉴定：分子水平（DNA分子杂交→检测目的基因是否导入；分子杂交→检测目的基因是否转录；抗原-抗体杂交→检测目的基因是否翻译）、个体水平（抗虫、抗病等性状鉴定）答题技巧1.步骤逻辑梳理：按“获取→构建→导入→检测”顺序记忆，明确每一步的核心目的；2.导入方法匹配受体细胞：看到“双子叶植物”优先想到农杆菌转化法，“动物细胞”对应显微注射法，“微生物细胞”对应感受态细胞法；3.检测方法区分：“是否导入”看DNA分子杂交，“是否转录”看分子杂交，“是否翻译”看抗原-抗体杂交，答题时明确“检测对象→检测方法→结果判断”题型03PCR技术原理与操作类别具体内容重点知识1.原理：DNA半保留复制，需模拟体内DNA复制的条件（模板、引物、原料、酶）；2.核心条件：模板DNA（含目的基因）、一对引物（分别结合目的基因两端，方向相反）、dNTP（原料）、Taq酶（热稳定DNA聚合酶，耐高温）、缓冲液；3.过程：变性（90-95℃，DNA双链解旋为单链）→复性（55-60℃，引物与单链结合）→延伸（72℃，Taq酶催化子链合成），循环多次实现目的基因扩增；>4.特点：特异性强（依赖引物与模板的特异性结合）、快速高效（循环30次可扩增数百万倍）答题技巧1.条件答题模板：“物质+作用”，如“Taq酶——耐高温，催化DNA子链合成”“引物——定位目的基因，启动DNA复制”；2.过程温度与结果对应：变性（高温解旋）、复性（中温结合）、延伸（适温合成），避免温度与过程混淆；>3.扩增倍数计算：若初始模板为n个，循环n次后，目的基因数约为n×2ⁿ（不考虑误差）；4.与体内DNA复制对比：突出PCR的“耐高温酶”“人工合成引物”“体外恒温循环”特点题型04目的基因的检测与鉴定类别具体内容重点知识1.分子水平检测（核心）：DNA分子杂交：探针与受体细胞DNA杂交，检测目的基因是否导入；-分子杂交（RNA杂交）：探针与受体细胞mRNA杂交，检测目的基因是否转录；抗原-抗体杂交：检测目的基因是否翻译出蛋白质；.个体水平鉴定：通过观察受体细胞或个体的性状（如抗虫性、抗病性、产特定蛋白质），验证目的基因是否发挥功能；3.探针特点：放射性同位素或荧光标记的、与目的基因互补的单链DNA或RNA答题技巧1.检测层次区分：“导入→转录→翻译→功能”，层层递进，答题时明确检测的层次和对应的方法；2.探针答题要点：明确探针的“标记方式”和“特异性结合对象”（如“与目的基因互补的单链DNA探针，用放射性同位素标记”）；3.结果表述规范：如“DNA分子杂交出现杂交带→目的基因已导入”“抗原-抗体杂交出现杂交带→目的基因已翻译”题型05基因工程的实践应用与伦理类别具体内容重点知识1.实践应用：-农业：培育抗虫（Bt毒蛋白基因）、抗病、抗逆（耐盐碱、抗除草剂）、优质（高产、高品质）转基因作物；-医药：生产胰岛素、干扰素等药物，进行基因治疗（治疗遗传病，如血友病、先天性免疫缺陷病）；-环保：培育降解污染物的转基因微生物；2.伦理与安全问题：食品安全（转基因食品的安全性）、生态安全（转基因生物对生态系统的影响）、伦理争议（如基因编辑婴儿），相关法规与监管答题技巧1.应用情境匹配：看到“抗虫作物”想到Bt毒蛋白基因，“胰岛素生产”想到基因工程菌，“遗传病治疗”想到基因治疗；2.伦理问题答题模板：“观点+理由”，如“支持转基因作物培育——可提高粮食产量，缓解粮食短缺问题；需加强监管——避免对生态环境造成潜在影响”；3.表述客观：分析应用价值时突出优势，讨论安全问题时不绝对化，体现科学辩证思维题型06基因工程与其他生物技术综合类别具体内容重点知识1.与细胞工程结合：转基因植物培育需结合植物组织培养（将导入目的基因的受体细胞培育为完整植株）；转基因动物培育需结合动物细胞培养、胚胎移植；2.与胚胎工程结合：转基因动物培育中，将含目的基因的受精卵培育为早期胚胎，再进行胚胎移植获得转基因个体；3.与基因编辑技术结合：CRISPR-Cas9技术编辑目的基因后，通过基因工程导入受体细胞，实现基因的定向改造答题技巧1.综合题逻辑梳理：明确不同技术的“角色”，如“植物组织培养——为转基因植物培育提供完整植株培育技术”“胚胎移植——为转基因动物培育提供胚胎着床和发育的途径”；.流程表述规范：按“技术顺序+核心步骤”作答，如“转基因抗虫棉培育流程：获取Bt毒蛋白基因→构建基因表达载体→导入农杆菌→农杆菌转化棉花细胞→植物组织培养→抗虫鉴定”；关键技术关联：突出不同生物技术之间的衔接点（如“受精卵”是转基因动物培育与胚胎工程的核心衔接对象）典例·靶向·突破题型01基因工程核心工具辨析聚乙烯型塑料应用广泛，但其难降解的特性带来了诸多环境问题。聚酯酰胺(PEAs)的可水降解性使其有望成为聚乙烯的替代品。某科研团队利用大肠杆菌构建能合成PEAs的工程菌，如图1表示合成PEAs相关基因连接形成的DNA片段，其中①②③④为引物，图2为载体质粒结构示意图。回答下列问题：注:P1、P2表示启动子;“-1”表示抑制作用。(1)利用PCR技术扩增PEAs合成串联基因时，为保证PEAs基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的_____端与引物____连接，另一个用于扩增的引物是____。在PCR反应体系中，一般要添加Mg²⁺，目的是____________。(2)研究人员将强启动子修饰后的PEAs合成串联基因插入图2载体质粒的位点1和位点2之间。图中的LacZ基因编码产生的酶可以分解X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。为了筛选出含有PEAs合成串联基因的大肠杆菌，应在培养基中加入_____________，并选择_______的菌落。(3)为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9系统为工程菌增加了自毁保护体系，机理如图2所示。研究结束后，在培养液中加入B物质，B物质通过________，使gRNA基因和Cas9基因表达，gRNA和Cas9蛋白形成复合物后，gRNA通过________识别目标DNA，Cas9蛋白对目标DNA进行剪切，最终使大肠杆菌死亡。gRNA基因可设置为______(填“毒蛋白基因”或“生长必需基因”)的特异性序列。(4)有人提出还可以在A蛋白基因上游增加一个温度诱导自毁体系，这样做的优点是___________。【答案】(1)3′③②激活DNA聚合酶(2)X-gal和四环素白色(3)解除A蛋白对P2启动子的抑制作用碱基互补配对生长必需基因(4)当B物质诱导途径未能杀死工程菌时，可通过调节温度杀死逃逸的工程菌，避免造成环境污染【详解】（1）转录过程中子链沿着5'→3'的方向进行，启动子是RNA聚合酶结合的位点，可驱动下游基因的转录，为保证PEAs基因能高效表达，应将强启动子碱基序列的3′端与引物③连接，根据子链延伸方向可知，另一个扩增引物是②；在PCR反应体系中，一般要添加Mg2+，Mg2+的作用是激活DNA聚合酶，提高酶活性。（2）研究人员将强启动子修饰后的PEAs合成串联基因插入图2载体质粒的位点1和位点2之间，此时目的基因插入LacZ基因内部，会破坏LacZ基因，未插入目的基因的质粒LacZ完整，可表达酶分解X-gal使菌落变蓝；插入目的基因的质粒LacZ失活，菌落为白色，同时质粒携带四环素抗性基因，因此培养基需要加入X-gal和四环素，筛选出白色菌落即为含有目的基因的大肠杆菌。（3）为了避免工程菌在使用后逃逸造成环境污染，研究人员利用CRISPR/Cas9系统为工程菌增加了自毁保护体系，机理如图2所示。原本A蛋白基因的表达被抑制，在培养液中加入B物质后，B抑制了该抑制作用，即B物质解除了A蛋白对P2启动子的抑制作用，A蛋白激活启动子P2，使gRNA基因和Cas9基因表达；gRNA通过碱基互补配对特异性识别目标DNA序列，Cas9蛋白对目标DNA进行剪切，最终使大肠杆菌死亡；要使工程菌自毁，需要Cas9剪切大肠杆菌生存必需的基因，使工程菌死亡，因此gRNA的识别序列对应大肠杆菌的生长必需基因。（4）有人提出还可以在A蛋白基因上游增加一个温度诱导自毁体系，即可以设计温度敏感型启动子实现，这样操作的优势为：当B物质诱导途径未能杀死工程菌时，可通过调节温度杀死逃逸的工程菌，避免造成环境污染。题型02基因工程核心步骤分析香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题：注：pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、50bp，bp表示碱基对。(1)图1过程①需要在______酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含______（答出2点）。(2)为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的______（3'或5'）端添加限制酶的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶______、______的识别序列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是______个。(3)图1的④过程，通常先用______将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是______。受体菌应筛选出______（填“具有”或“不具有”）氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。(4)为了检测目的基因是否插入到pET32a质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图2。样品______最可能是插入了目的基因的重组质粒。【答案】(1)逆转录内含子、启动子和终止子等(2)5'XhoⅠBamHⅠ2n-2(3)Ca2+处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态具有(4)2【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。2、分析题图：①②是目的基因的获取，③是基因表达载体的构建，④是将目的基因导入细胞，⑤目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）①过程是以RNA为模板合成cDNA的过程，被称为逆转录，需要逆转录酶催化。①②过程获得的目的基因不含内含子、启动子和终止子等。（2）在设计PCR引物时可将引物的5'端添加限制酶的识别序列，扩增后的产物两端会包含该序列，从而被相应的限制酶切割。目的基因上有SalⅠ和MunⅠ两个限制酶的酶切位点，若选用它们，目的基因因切割破坏基因的结构而失去活性，pET32a质粒上也有多个酶切位点，但两个标记基因中有EcoRⅠ的酶切位点，若选用它，会破坏两个标记基因，因此不能选，由于Lp-11基因的b链为转录的模板链，结合质粒上PO(启动子)所在位置，可推知与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶XhoⅠ和BamHⅠ。当DNA在进行PCR扩增时，每个子链的延伸都需要引物，1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，共有2n条链，两条母链不需要引物，所以PCR过程中消耗的引物总量是2n-2。（3）④过程是将目的基因导入受体细胞中，通常先用Ca2+将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。限制酶XhoⅠ和BamHⅠ切割质粒而插入目的基因，会导致卡那霉素抗性基因失活，而氨苄青霉素抗性基因保持活性，作为标记基因在筛选中起作用。因此，重组大肠杆菌的质粒上必须含有氨苄青霉素抗性基因，即选用具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌进行进一步检测。（4）pET32a质粒长度为5900bp，用限制酶XhoⅠ和BamHⅠ进行切割，会切割掉长度为120bp（30bp+90bp）的片段，剩余的质粒的长度为5780bp，然后再与长度为357bp的目的基因连接。这样插入了目的基因的重组质粒用两端添加的限制酶切割，会出现长度为5780bp、357bp的片段，故样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。题型03PCR技术原理与操作某自花、闭花传粉植物的花瓣末端展开如匙，称为匙瓣，具有较高的观赏价值。研究人员通过诱变获得一个纯合平瓣突变体甲，并对其进行了相关研究。回答下列问题：(1)为确定匙瓣野生型（W）和平瓣突变体甲未发生染色体变异，可通过分析其_______来判断。将纯合匙瓣野生型和平瓣突变体甲杂交得到F1，若F1的表型为_______，则可确定该突变为显性突变。(2)若已确定平瓣为显性性状，控制该植物花瓣形状的基因为B/b，将F1与突变体甲等量间行种植，且二者产生后代的过程中不发生变异，每株收获等量的后代，利用图1PCR技术扩增这些后代的基因B/b，电泳检测PCR产物，得到的电泳条带不可能是图1中的泳道_______（从泳道1～5中选择），子代中基因型不同的个体的比例为_______，其中表现为平瓣的个体所占比例为_______。(3)图2为研究人员对基因B、b编码链的部分测序结果。据图可知，基因B是基因b发生碱基对的_______导致的，使_______，导致基因b编码的肽链变短、蛋白质功能下降，最终导致花瓣由匙瓣变成平瓣。注：终止密码子：UAA、UAG、UGA【答案】(1)染色体组型平瓣(2)4、5bb:Bb:BB=1:2:57/8(3)缺失终止密码子提前出现/翻译提前终止【详解】（1）染色体变异包括染色体结构变异和数目变异，通过分析染色体的形态和数目，即染色体组型，可以判断是否发生染色体变异；若为显性突变，纯合匙瓣野生型（隐性纯合子）和平瓣突变体甲（显性纯合子）杂交，F1为杂合子，杂合子表现出的性状为显性性状，所以F1表型为平瓣。（2）若已确定平瓣为显性性状，控制该植物花瓣形状的基因为B/b，则F1的基因型为Bb，突变体甲的基因型为BB，依据电泳条带可知，1100bp为B基因条带，1960bp为b基因条带，F1的基因型为Bb，则具有两个不同条带，即1100bp、1960bp，所以利用PCR技术扩增这些后代的基因B/b，电泳检测PCR产物，得到的电泳条带不可能是图1中的泳道4和泳道5；该植株为自花、闭花传粉，所以当F1与突变体甲等量间行种植时，植株仍进行自交，bb的概率为1/2×1/4=1/8，Bb的概率为1/2×2/4=2/8，BB的概率为1-1/8-2/8=5/8，分别对应的是泳道2、泳道3、泳道1，比例关系为1：2：5，表现为平瓣的个体所占比例为2/8+5/8=7/8。（3）据图所示可知，序列为b基因的正常基因序列为编码链，b基因发生突变，编码多肽链的DNA序列中发生碱基对的缺失，导致原本的第223-225位的碱基序列由GTA变为了TAG，其对应密码子由GUA变为了UAG，而UAG是终止密码子，即突变导致终止密码子提前出现（或翻译提前终止），进而使得肽链变短，蛋白质功能下降，最终导致花瓣由匙瓣变成平瓣。题型04目的基因的检测与鉴定异丁胺是一种重要的化工原料，其胞内合成代谢途径见图8。通过微生物发酵生产异丁胺时常难以兼顾菌株生长和产物合成间的平衡，研究人员尝试利用基因工程技术提高菌株的生产能力。回答下列问题：(1)据图8推测，真核细胞中TCA循环发生在线粒体______（填“基质”或“内膜”）。将asgltA基因导入菌株中，其转录形成的RNA能与gltA基因的mRNA结合形成部分双链，gltA基因表达的_____（填“转录”或“翻译”）过程受阻，减少丙酮酸进入TCA循环，积累丙酮酸用于异丁胺的生产，但此时菌株的生长未受明显影响。(2)为实现利用温度对大肠杆菌代谢的调控，研究人员构建了两种质粒（图），并分别以红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP为模式蛋白，检测质粒的调控能力。注：PRM为持续性表达启动子，PR和Pire-box为特异型启动子（分别被CI蛋白二聚体和pdhR蛋白识别并抑制），符号代表抑制，代表终止子。①为了使细胞中质粒1中mCherry蛋白的表达同时受到温度和丙酮酸的调控，可在质粒2的___处（填“A”或“B”）插入pdhR基因，将改造后的质粒1和质粒2导入敲除pdhR基因的大肠杆菌获得菌株L1，菌株L1在30℃时会发出____色荧光。②pdhR蛋白无法结合天然启动子Ptre。在Ptre后插入box序列即可得到质粒1中的启动子Ptrc-box。研究人员通过右图实验（如图）证明pdhR蛋白可以直接结合启动子Ptrc-box，由此推测，实验中P是指无荧光标记的_____（填“Ptrc-box”或“无关启动子”），并在泳道5的方框中补充可能的条带宽度_____。(3)已知丙酮酸在细胞内积累到2g/L时，才能解除pdhR对Ptrc-box的抑制作用；asgltA转录形成的RNA的抑制作用可长时间维持。请完善以下表格，以实现动态调节大肠杆菌的代谢途径从而提高异丁胺的产量。操作目的对菌株L1的质粒和遗传物质进行改造：______获得在生长阶段（37℃）积累丙酮酸并抑制生产，而在生产阶段（30℃）抑制生长的工程菌。控制发酵温度先为37℃，当监测到______时将温度切换为30℃。【答案】(1)基质翻译(2)B红Ptrc-box(3)①用vlmD酶基因替换质粒1中的mCherry基因；②asgltA基因替换质粒2中的GFP基因；③敲除菌株L1的vlmD基因丙酮酸浓度≥2g/L【分析】基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）真核细胞的TCA循环发生在线粒体基质，线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所。asgltA转录的RNA与gltA的mRNA结合形成双链，会阻碍核糖体与mRNA结合，使翻译过程受阻，减少丙酮酸进入TCA循环，为异丁胺合成积累原料。（2）①将pdhR基因插入质粒2的B处，使pdhR表达受温度调控，进而通过pdhR调控质粒1的mCherry，实现温度和丙酮酸的控制，30℃时CI蛋白形成二聚体，抑制pdhR表达→无pdhR抑制Ptrc→mCherry（红色荧光）持续表达，故菌株发红光。②实验为凝胶迁移实验，P是无荧光标记的Ptrc-box，用于验证pdhR与该启动子的直接结合，实验仅检测荧光标记的Ptrc-box，与泳道2相比，泳道5的pdhR与标记Ptrc-box的结合效率完全相同，因此条带1的宽度与泳道2一致，条带2的宽度也与泳道2一致，补充可能的条带宽度如图：。（3）对菌株L1的质粒和遗传物质进行改造，可以替换mCherry为vlmD，将异丁胺合成关键酶置于温度+丙酮酸调控下；替换GFP为asgltA，将抑制生长置于温度调控下；敲除内源VlmD，避免原有酶干扰，确保产物合成受控。37℃asgltA表达，菌体正常生长，丙酮酸逐步积累，当丙酮酸浓度≥2g/L时，切换至30℃，asgltA表达抑制生长，vlmD持续表达，丙酮酸全部用于合成异丁胺，实现产量最大化。题型05基因工程的实践应用与伦理下图为某家系中甲病(基因为A、a)和乙病(基因为B、b)两种单基因遗传病的系谱图，已知Ⅱ-5无乙病致病基因，乙病在男性中的发病率为0.2，不考虑基因突变和染色体变异，请回答下列问题：(1)甲病的遗传方式为___________，调查此病的发病率关键是___________。Ⅲ-5的基因型为___________。(2)若Ⅲ-1与人群中正常女性婚配，生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为___________；若Ⅲ-1与Ⅲ-7婚配，生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为___________。(3)运用生物学所学知识结合此题分析，优生优育的措施___________。(答2点)(4)已知甲乙病有关基因碱基序列情况，及限制酶M和限制酶N作用位点，现探究某位患甲病的女性的基因型，请设计基于PCR和电泳技术的实验方案，简要写出实验过程、预期结果及结论。①请写出该实验的主要操作步骤中的四个关键阶段：______________________→___________→___________→___________。②预期结果及结论：若电泳得___________种条带，则其基因型为___________。(请写出所有的情况)【答案】(1)常染色体显性遗传在人群中随机抽样调查，保证样本量足够大(合理即可)或(2)1/241/16(3)禁止近亲结婚、进行遗传咨询、开展产前诊断(如基因检测)、适龄生育(第1点必答，最少答2点)(4)DNA提取→PCR(双)扩增→酶切处理→电泳检测(合理即可)4、5、6、7、、、(前后顺序要对应)【分析】“无中生有为隐性，隐性患病看女病，父子患病为伴性，有中生无为显性，显性患病看男病，母女患病为伴性”。【详解】（1）Ⅱ-4和Ⅱ-5均是甲病患者，后代Ⅲ-7不患甲病，说明甲病为显性遗传病，Ⅱ-3是甲病患者，其母亲Ⅰ-1正常，说明甲病致病基因不可能位于X染色体上，只能位于常染色体上，说明甲病的遗传方式为常染色体上显性遗传病。调查此病的发病率关键在人群中随机抽样调查，保证样本量足够大。Ⅱ-4和Ⅱ-5均不患乙病，其后代Ⅲ-6患乙病，说明乙病为隐性遗传病，且Ⅱ-5无乙病致病基因，说明乙病为X染色体上隐性遗传病。分析可知，Ⅱ-4基因型为AaXBXb，Ⅱ-5基因型为AaXBY，Ⅲ-5患甲乙两病，基因型为A_XbY，即AAXbY或AaXbY。（2）Ⅱ-2不患甲病和乙病，基因型为aaXBX_，Ⅱ-3患甲乙两病，基因型为A_XbY，

后代Ⅲ-1患甲病，其基因型为AaXBY，人群中正常女性基因型为aaXBX_，二者后代患甲病Aa的概率是1/2，乙病在男性中的发病率为0.2，说明Xb=1/5，XB=4/5，根据遗传平衡公式可知，XBXb=4/5×1/5×2=8/25，XBXB=16/25故正常女性基因型为XBXb的概率为（4/5×1/5×2）÷（8/25+16/25）=1/3，Ⅲ-1AaXBY与正常女性aaXBXb二者后代患乙病的概率是1/3×1/4=1/12，二者生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为1/2×1/12=1/24。分析可知，Ⅱ-4基因型为AaXBXb，Ⅱ-5基因型为AaXBY，Ⅲ-7不患甲病和乙病，故其基因型为1/2aaXBXB、1/2aaXBXb，若Ⅲ-1AaXBY与Ⅲ-7(1/2aaXBXB、1/2aaXBXb)婚配，生育一个同时患甲乙病的孩子的概率为1/2×1/2×1/4=1/16。（3）优生优育的措施包括禁止近亲结婚、进行遗传咨询、开展产前诊断(如基因检测)、适龄生育。（4）现探究某只患甲病的女性的基因型（A_XBX_），先提取该女性的DNA，根据目的基因A、a、B、b两端的序列设计引物，然后进行PCR扩增，在用限制酶M、N对电泳产物进行切割处理，将切割得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切位点分析可知，A基因含有1个限制酶M的酶切位点，经切割得到2种DNA片段，a基因不存在限制酶M、N的酶切位点，无法完成切割，产生1种DNA片段，B基因含有1个限制酶N的酶切位点，经切割得到2种DNA片段，b基因有2个限制酶N的酶切位点，经切割产生3种DNA片段（其中一个片段大小和B基因的一致），故如果只同时存在B、b，共4种不同的DNA片段。预期结果及结论：若电泳得4种片段，说明只含有A和B基因，其基因型为AAXBXB；若电泳得到5种片段，说明含有A、B、a基因，其基因型为AaXBXB；若电泳得到6种DNA片段，说明含有基因A、B、b，其基因型为AAXBXb；若电泳得到7种DNA片段，说明含有A、B、b、a基因，其基因型为AaXBXb。题型06基因工程与其他生物技术综合顺铂是一种抗肿瘤药，普遍用于肺癌等癌症的治疗，但长期使用会使癌细胞产生耐药性。科研人员研究了miRNA、糖酵解与乳腺癌细胞（MCF7）耐药性之间的关系。(1)在氧气充足条件下，正常细胞主要通过有氧呼吸第_______阶段产生ATP。但某些肿瘤细胞即使在有氧条件下，也主要通过糖酵解产生ATP，被称为有氧糖酵解。(2)为获得耐药性较强的MCF7细胞，可在MCF7培养液中加入顺铂，当存活的细胞达到一定数量后，用_______处理并传代培养。每次传代时，增加培养液中顺铂的剂量。(3)检测MCF7耐药株与非耐药株在顺铂处理后的乳酸产量，结果如下图1。由图1可知，耐药株的有氧糖酵解强度_______非耐药株。(4)耐药株中miR-485-5p（一种miRNA，可与靶基因的mRNA结合）的表达量明显低于非耐药株。为研究miR-485-5p与M基因的关系，在MCF7细胞中过表达或敲低miR-485-5p后，电泳分离细胞裂解物，用抗M蛋白抗体检测，结果如下图2。图2结果表明miR-485-5p_______，得出此结论的依据是_______。(5)在MCF7细胞中过表达或敲低M基因，检测乳酸产量，结果如下图3。过表达M基因时非耐药株对顺铂的抗性增强，敲低M基因时耐药株对顺铂的抗性减弱。综合上述研究，说明MCF7产生耐药性的机制_______。【答案】(1)三(2)胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）(3)高于(4)抑制M基因表达非耐药株中敲低组M蛋白含量明显高于对照组，耐药株中过表达组M蛋白含量明显低于对照组(5)MCF7耐药株中miR-485-5p下调，使细胞中M蛋白含量增加，促进了有氧糖酵解，提高了对顺铂的抵抗【分析】在氧气充足条件下，正常细胞能够进行有氧呼吸，在有氧呼吸的第一、二阶段可以产生少量的ATP，第三阶段可以产生大量的ATP。【详解】（1）在氧气充足条件下，正常细胞能够进行有氧呼吸，在有氧呼吸的第一、二阶段可以产生少量的ATP，第三阶段可以产生大量的ATP。故在氧气充足条件下，正常细胞主要通过有氧呼吸第三阶段产生ATP。（2）为获得耐药性较强的MCF7细胞，可在MCF7培养液中加入顺铂，当存活的细胞达到一定数量后，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞，继续进行传代培养。（3）分析题图可知，耐药株的乳酸产量远高于非耐药株，说明耐药株的有氧糖酵解强度高于非耐药株。（4）分析题图可知，非耐药株中敲低组M蛋白含量明显高于对照组，耐药株中过表达组M蛋白含量明显低于对照组，说明miR-485-5p抑制M基因表达。（5）分析题图知，过表达M基因时非耐药株对顺铂的抗性增强，敲低M基因时耐药株对顺铂的抗性减弱，说明MCF7产生耐药性的机制，MCF7耐药株中miR-485-5p下调，使细胞中M蛋白含量增加，促进了有氧糖酵解，提高了对顺铂的抵抗。1．关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述错误的是（）A．根据待分离DNA片段的大小，需用缓冲液配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化C．将PCR产物和载样缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察【答案】B【详解】A、琼脂糖凝胶的浓度决定凝胶孔径大小，需根据待分离DNA片段的大小配制对应浓度的琼脂糖溶液，0.8%～1.2%为分离常规大小DNA片段的常用浓度范围，A正确；B、先将琼脂糖溶液沸水浴加热熔化，待冷却至50~60℃左右再加入核酸染料，避免高温破坏染料结构使其失效，B错误；C、载样缓冲液可增加样品密度，使样品能沉入加样孔，同时含有指示剂可指示电泳进度，因此PCR产物需与载样缓冲液混合后，用微量移液器缓慢注入加样孔，C正确；D、指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需及时断电，避免待分离DNA片段跑出凝胶，结合了核酸染料的DNA在紫外灯下可发出荧光，便于观察条带，D正确。2．小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3'端。相关过程如图1所示。(1)gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循___________原则，Cas9蛋白作用的化学键是___________。(2)为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'___________3'(写出12个碱基)。(3)利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有___________，最终表达载体还应具备的基本元件有___________(写出两点)。表达载体导入农杆菌后，利用含___________的培养基筛选出阳性菌落。(4)对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测。电泳时需要用___________缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因___________(填“敲除”或“未敲除”)的植株。【答案】(1)碱基互补配对磷酸二酯键(2)AGAUUGGGUCCU(3)SpeI和NheI复制原点、终止子潮霉素(4)电泳敲除【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的筛选和获取从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。【详解】（1）gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循碱基互补配对原则。gRNA能够识别DNA特定序列，引导Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用，即Cas9蛋白作用的化学键是磷酸二酯键。（2）观察图2，目标DNA序列为5′-AGATGCATATCCCGGAGATTGGGTCCTGCGTGACGG-3′，其3′端PAM右侧序列是“AGATTG”；复合体首先会定位目标DNA序列3'端的PAM序列，然后gRNA上的靶向序列与目标DNA的另一条链（3′端-5′端）互补配对，接着Cas9会切割目标DNA某位点，实现基因敲除；可见gRNA靶向序列应该与目标DNA序列（5′端-3′端）序列基本一致，但需要将DNA序列上的T换成U，又在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'-AGAUUGGGUCCU-3'。（3）通过限制酶SpeⅠ和NheⅠ将载体1启动子a和gRNA基因剪切，该片段两端的黏性末端相同，因此再用SpeⅠ将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段连接到载体2即可成为最终载体。基因表达载体除了图中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。由于载体中含有潮霉素抗性基因，所以可用含潮霉素的培养基筛选出阳性菌落。（4）对小麦植株M基因进行PCR扩增后，用电泳缓冲液来配制琼脂糖凝胶。AvaⅡ酶切位点存在于M基因中，若M基因未被敲除，AvaⅡ酶切后会产生两个条带；若M基因被敲除，M基因序列改变，AvaⅡ酶切位点消失，酶切后会出现1个条带，所以检测结果出现1个条带时，该植株为M基因敲除的植株。3．苏氨酸是常用工业原料，目前主要通过大肠杆菌发酵生产。当细胞中苏氨酸含量较高时，会抑制苏氨酸合成酶基因的转录。A基因编码的A蛋白位于大肠杆菌细胞膜上，可将苏氨酸运出细胞。我国研究者尝试利用基因工程技术提高菌株生产能力。注：限制性内切核酸酶BsaⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点如图1所示。(1)BsaⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsaⅠ酶切图1中载体产生的末端________（填“相同”或“不相同”或“不完全相同”）。(2)为构建A基因—RFP（红色荧光蛋白）基因表达载体，需在图1中载体的BsaⅠ酶切点处插入基因A。为保证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列，则引物2的序列为5′________3′（写出前12个碱基）。若要通过PCR检测A基因—RFP基因表达载体构建是否成功，应选择图1中的引物组合________。(3)筛选导入A基因—RFP基因表达载体的大肠杆菌工程菌时，若选用缺少苏氨酸的完全培养基能否达到目的，请做出判断并说明原因_________________________________。(4)为探究外源A基因表达水平对工程菌苏氨酸产量的影响，分别将利用三种具有持续表达活性的启动子的A基因—RFP基因表达载体导入大肠杆菌菌株W中，获得三种工程菌，相关处理及结果如图2。①图中菌株W-01、菌株W-02、菌株W-03三组实验的荧光强度相对值可反映________。②工程菌W-01苏氨酸产量显著高于菌株W的原因是________。【答案】(1)磷酸二酯键黏性不相同(2)GGTCTCNAAACC引物2和引物3(3)否，大肠杆菌自身能合成苏氨酸(4)A基因的表达水平（三种启动子的活性不同）W-01荧光最强，A基因表达最高，A蛋白产量高，苏氨酸运出速率高，（菌体中苏氨酸浓度低）对苏氨酸合成酶基因转录的抑制弱【详解】（1）限制性内切核酸酶（限制酶）的作用是断裂DNA分子中特定位置相邻核苷酸之间的磷酸二酯键。观察图中载体的两个BsaⅠ切点：正向链（5′→3′）：识别序列（5’-GGTCTC-3’）后第1个N后切割，反向链（3′→5′）：识别序列（3′-CCAGAG-5′）后第5个N前切割，分别产生5’-GTTT-3’和5’-AAAC-3’的黏性末端，两者末端序列不同。（2）为保证基因A对应的基因序列与载体正确连接，应在扩增该基因时通过引物添加相关序列：酶切位点序列+对应质粒黏性末端互补的片段，即5’-GGTCTCNAAAC...3’（N代表任意碱基），但题目只要求前12个，再加1个与3’第1个碱基G配对的C，所以引物2的序列为5’-GGTCTCNAAACC...3’。选择一个在载体上、一个在插入片段上的引物组合，这样只有插入成功时才能扩增出条带。图中引物2在基因A的下游，引物3在载体RFP基因上游的启动子区域，所以用引物2和引物3可以跨越插入位点，扩增出预期片段，验证是否成功插入。（3）大肠杆菌作为原核生物，自身具备完整的苏氨酸合成代谢途径。在缺少外源苏氨酸的培养基中，大肠杆菌会启动自身合成途径产生苏氨酸。因此，无论是否导入A基因（A蛋白负责运出苏氨酸），大肠杆菌在缺苏氨酸培养基上均能生长，无法据此筛选出工程菌。（4）RFP基因与A基因共享同一启动子（I-01/I-02/I-03），其表达量与荧光强度正相关，因此荧光强度相对值可反映A基因的表达水平（转录或翻译水平）；W-01荧光最强，A基因表达最高，A蛋白最多，苏氨酸运出速度最快，胞内苏氨酸浓度最低，解除对“苏氨酸合成酶基因”的转录抑制，合成酶持续表达，苏氨酸产量显著升高。4．低温逆境胁迫是造成农作物减产的主要因素之一。植物冷诱导基因（COR）是由冷胁迫调节的一类基因，能在低温等条件下被激活产生冷调节蛋白，提高植物的抗寒性。研究人员欲借助农杆菌转化法将COR基因导入马铃薯细胞，以获得抗冻的马铃薯品种。结合下列图解，回答下列问题。(1)若采用PCR技术对n个COR基因进行扩增，第3次循环需要_______个引物1和_______个引物2。(2)启动子可分为组成型启动子（每种组织器官中均发挥作用）、组织特异型启动子（特定组织器官中才能发挥作用）和诱导型启动子（特定条件刺激才能发挥作用）。为使马铃薯块茎在低温刺激下才启动COR基因的表达，构建的基因表达载体中含有的启动子类型应包括_______。终止子相当于一盏红色信号灯，可使_______停止催化相关核苷酸链的延伸。(3)构建基因表达载体时，若遇到平末端与黏性末端无法连接，可先用Klenow酶（具有与DNA聚合酶作用相似的特性）将黏性末端补平，或先用T4DNA聚合酶将3'-黏性末端切平，然后再与平末端连接。现已知COR基因的A端已被限制酶KpnⅠ切割，B端已被限制酶EcoRⅠ切割。为使COR基因与质粒正确连接，需选用_____酶对COR基因的_____端进行加工处理；不选用另一种酶的原因是_______。(4)筛选被农杆菌成功转化的马铃薯细胞时，需使用含_______的选择培养基。【答案】(1)04n(2)（块茎）组织特异型和（低温刺激）诱导型RNA聚合酶(3)T4DNA聚合（酶）A端Klenow酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有链的3’末端，不能按3’→5’方向延伸脱氧核苷酸链，故不能将COR基因的A端补平(4)潮霉素【详解】（1）若采用PCR技术对n个COR基因进行扩增，图中磷酸端为5’端，子链延伸的方向为5’→3’因此需要利用的引物是引物2和引物3；不需要引物1和引物4，由于第3次循环是以第二次循环得到的产物为模板的，且第二次循环得到的DNA片段为22=4个，则在第3次循环过程中需要合成的子链数为8个，因此采用PCR技术对n个COR基因进行扩增，第3次循环需要消耗的引物2和引物3的数目均为4n个；即需要0个引物1和4n个引物2。（2）启动子可分为组成型启动子（每种组织器官中均发挥作用）、组织特异型启动子（特定组织器官中才能发挥作用）和诱导型启动子（特定条件刺激才能发挥作用）。为使马铃薯块茎在低温刺激下才启动COR基因的表达，构建的基因表达载体中含有的启动子类型应包括（块茎）组织特异型和（低温刺激）诱导型。终止子相当于一盏红色信号灯，可使RNA聚合酶停止催化相关核苷酸链的延伸。（3）构建基因表达载体时，若遇到平末端与黏性末端无法连接，可先用Klenow酶（具有与DNA聚合酶作用相似的特性），能够使子链由5’→3’延伸，因而可将黏性末端补平，或先用T4DNA聚合酶将3'-黏性末端切平，然后再与平末端连接。现已知COR基因的A端已被限制酶KpnⅠ切割，该部位暴露出来的是3’端，B端已被限制酶EcoRⅠ切割，该部位暴露出来的是5’端。为使COR基因与质粒正确连接，需选用T4DNA聚合酶对COR基因的A端进行加工处理；Klenow酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有链的3’末端，不能按3’→5’方向延伸脱氧核苷酸链，因而不被选择。（4）筛选被农杆菌成功转化的马铃薯细胞时，需使用含潮霉素的选择培养基，因为潮霉素抗性基因和目的基因一同转入到受体细胞中，据此可进行鉴定。5．弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）最具代表性的特异性抗原是CD20，超过95%的DLBCL病例强表达CD20。抗原蛋白CD19在正常B细胞和DLBCL细胞表面都可稳定、高密度表达，也是B细胞受信号通路的重要组成部分。双靶点嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）疗法是未来治疗DLBCL的发展方向，科学家将患者T细胞改造成同时表达CD19抗原受体和CD20抗原受体（对应基因简称为CAR基因）的CAR—T细胞。其基本流程如图1、2所示：(1)从患者体内获取的T细胞主要有辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc），由Th细胞改造完成的CAR—T细胞受到抗原刺激后，可分泌______，促进正常B细胞的增殖分化；由Tc细胞改造完成的CAR—T细胞裂解DLBCL细胞需要受到_______的双信号刺激才能进行。(2)CD19CAR—T细胞长期激活可能导致正常B细胞耗竭，影响体液免疫功能。为降低该风险，结合题目信息，从图2和图3中选择部分或全部元件，设计新的基因表达载体，在答题卡相应位置画出元件排列顺序示意图（一个基因单独或多个基因拼接共用一个启动子为一个元件），并辅以必要的文字说明_______。(3)图4为利用无缝克隆（In—Fusion）技术构建含CAR基因的重组质粒流程图，其中In—Fusion酶可以将任何具有相同15~20bp末端序列的线性DNA分子进行无缝连接，实现高效稳定的同源重组。①图中过程Ⅰ是利用PCR技术将质粒线性化，为了保证扩增后的产物是图中所示的线性质粒，应该选择引物_______。CAR基因序列可以由生物科技公司合成，扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据_______的末端序列设计。②为了筛选、鉴定构建成功的重组质粒，科研人员进行了如下操作：将重组质粒导入大肠杆菌，菌液涂布到含_______的培养基中，培养适宜时间后，挑取菌落并加入_______等进行菌落PCR，并通过电泳鉴定PCR产物。③与传统构建重组质粒的方法相比，In—Fusion技术的优点有_______。（答出两点即可）【答案】(1)细胞因子肿瘤细胞表面抗原和辅助性T细胞（Th）释放的细胞因子(2)方案一：载体中出现元件组合1和元件组合2，根据需要服用四环诱导CAR基因表达：方案二：载体中出现元件组合1和元件组合2，治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡：(3)引物2和引物3CAR基因（目的基因）和线性化质粒氨苄青霉素Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP、特异性引物（F和R）不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切和连接，简化实验流程等【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。【详解】（1）辅助性T细胞（Th）受抗原刺激后，会分泌细胞因子，这些细胞因子可以促进B细胞的增殖分化，形成浆细胞和记忆细胞。细胞毒性T细胞（Tc）的活化需要双信号刺激，第一信号来自肿瘤细胞表面抗原与之接触，第二信号来自辅助性T细胞（Th）释放的细胞因子。（2）为了降低CD19CAR-T细胞长期激活导致正常B细胞耗竭的风险，我们可以设计一个控制细胞凋亡的机制，在需要时清除过度激活的CAR-T细胞。降低CD19CAR—T细胞长期激活导致正常B细胞耗竭的风险，元件排列顺序如图：方案一：载体中出现元件组合1和元件组合2，根据需要服用四环诱导CAR基因表达：方案二：载体中出现元件组合1和元件组合2，治疗完成后服用四环素诱导CAR-T细胞调亡：（3）①引物选择与设计：应选择引物2和3，扩增产物在图示位点断开。PCR扩增时，引物需要与模板链的3'端互补，从而保证扩增产物是图中所示的线性化质粒。扩增CAR基因时，引物F和R序列要依据线性化质粒和目的基因的末端序列设计，这样才能保证扩增出的CAR基因两端与线性化质粒的末端序列相同，以便In-Fusion酶进行无缝连接。②筛选与鉴定：菌液应涂布到含氨苄青霉素的培养基中。因为重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），只有成功导入质粒的大肠杆菌才能在该培养基上生长。挑取菌落并加入TaqDNA聚合酶、dNTP、特异性引物、Mg2+等进行菌落PCR，通过电泳鉴定PCR产物的大小，判断CAR基因是否成功插入。③In—Fusion技术的优点：不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏；无需酶切和连接，简化实验流程等。6．吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)可能与免疫排斥反应、病原体感染、中枢神经系统疾病等有关，因而受到热烈关注，为进一步研究其表达的相关特性，现利用质粒pEGFP-C1、RAW264.7细胞等构建重组表达载体,以便对IDO基因表达阳性细胞特性进行进一步研究。其基本过程如图，图中GFP基因为绿色荧光蛋白基因，回答下列问题：

(1)步骤①中，培养RAW264.7细胞的培养基需添加___________以满足动物细胞对未知营养物质的需求。将RAW264.7细胞在适宜条件下培养适宜时间，接着进行步骤②——提取细胞的总RNA，此后还需经___________过程合成cDNA，将合成的cDNA作为模板，利用PCR技术扩增IDO基因。(2)为使IDO基因与质粒pEGFP-C1正确连接，在步骤③时使用的两种引物的5'端需分别添加限制酶___________识别的序列。步骤④构建重组表达载体时，需要利用___________酶将IDO基因与质粒pEGFP-C1连接起来。(3)Kan'/Neo'是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。将重组表达载体加入________________的大肠杆菌细胞培养液中，一段时间后将大肠杆菌转移到含有________________的培养基中进行筛选和扩大培养，这一步骤的主要目的是________________。(4)研究人员将(3)中获得的重组表达载体利用脂质体介导转染法转染受体细胞，该方法的原理是_______________，利用荧光显微镜观察受体细胞是否有_________________，初步筛选出转染成功的细胞。【答案】(1)动物血清逆转录(2)BglⅡ、KpnⅠDNA连接(3)感受态或钙离子处理卡那霉素含重组载体的大肠杆菌，并使其数量增多(4)生物膜具有一定的流动性绿色荧光【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。【详解】（1）为满足动物细胞对未知营养物质的需求，常在动物细胞培养液中加