钩藤水提物成分与其总生物碱稳定性研究

钩藤水提物成分与其总生物碱稳定性研究1仪器与试剂设备：Agilent1200HPLC（美国安捷伦）；（a）瑞士Methler-Tolido仪表公司AB204-N（梅特勒-托利多）；上海一恒科技仪表股份有限公司；UV-2450UV-VisSpectroscopy（岛津，日本）；THZ-150型真空吹气烘干炉（上海一恒科技设备股份有限公司）；上海一恒科技设备股份有限公司生产的DZF-6050型恒温吹气烘干机。试剂：标准溶液：取钩藤根粉末适量，用95%乙醇润匀，制成每1g含0.125mg的溶液，即得。钩藤水提物中总生物碱含量测定用标准样品为对照品，含量均大于99%。钩藤药材购于长沙市澧县药材公司，经湖南中医药大学药学院药检系黄敏芳副教授鉴定为钩藤RheumlanceolatumSieb.etZucc。；钩藤碱均为钩藤药材中的主要活性成分，含量分别为：0.377%、0.312%、0.229%；大黄酚含量分别为：0.308%、0.244%、0.318%。标准品溶液配制：取供试品溶液100μl，加入95%乙醇100μl，用甲醇定容至1000μl，摇匀后测定。化学成分：氯化钠；【中英文摘要】：盐酸-甲醇；（a）测定纯的甲酸-甲醇；用0.1%的磷酸水作溶剂，用乙腈作溶剂。采用的方法为：1）盐酸-甲醇、2）盐酸-甲酸、2）盐酸-乙腈与0.1%磷酸酯的混合液。以钩藤碱、钩藤次碱和大黄酚-beta-D-吡喃半半乳糖苷-beta-Dbeta-D吡喃半乳糖为对照，由中国食药局供应。样本：将已晒干的钩藤粉10克，精确称量，加入20毫升95%酒精，1天后过滤，将其浓缩成100毫升，再将10毫升放入20毫升的量瓶中，加入甲醇到刻度线上，进行摇晃，即可得到。仪器：AB-8UV-Vis光谱仪；超音波清洗机；超音波清洗机；SW-CJ-2型烘缸；200D型恒热水蒸煮器；SW-CJ-2型恒温吹气烘干炉，适用于各种类型的烘干机。试剂：甲醇、乙腈、丙酮、磷酸均为色谱级，色谱柱MilliporeC18柱（150mm×4.6mm,5μm）；水浴恒温振荡器。钩藤水提物：将钩藤药材粉碎成细粉过60目筛。取粗粉末放入干燥器内保存备用。9.试剂：钩藤水提物所含成分主要是生物碱、大黄素、大黄酚和黄芩苷等。故取样品过20目筛后，采用70%乙醇分别提取1次，每次提取1h。重复上述提取过程3次。2溶液的配制在制备总生物碱标准溶液时，将其取出0.5g，并对其进行精确地称定，将其放到25mL的容量瓶中，再添加25mL的甲醇，进行15min的超声波处理，然后滤过，将滤液用甲醇定容到50mL的量瓶中，然后将其摇匀，即可得到总生物碱标准溶液。制备受试品溶液，取1g（大约是干燥药材质量的5~10倍），精确地称出，放入100mL的量瓶中，再添加甲醇25mL、甲醇溶液50mL、冰乙酸20mL，进行超声波处理15分钟，得到该样品。以标准溶液为标准，以标准溶液配制标准溶液，精确称得上标准溶液17.00mg，将标准溶液装入10ml的容量瓶，并用甲醇进行定容。将制备好的样品10微升放入液相层析器中，进行分析。2.1仪器与试药Waters1260高效液相色谱仪，包括Waters色谱工作站和WatersHPLC工作站，WatersUPLC型号为FINISHEC-5,WatersC18色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）；WatersHPLC型号为UltimateEC-18,WatersUPLC型号为FINISHEC-5,WatersUPLC型号为-6；AllergyAA3（上海精科衡器股份有限公司）Agilent1200HPLC（安捷伦）（美国）；KQ5200DU型CNC超声波清洗机（昆山市超声波仪表厂）；Nicolet811（赛多利斯仪表股份有限公司）电子分析秤（北京）；上海亚荣生物化学仪器制造厂LC-25型离心分离机。甲醇和乙腈是色谱纯，水是重蒸水，其它的都是分析纯。，钩藤水提物（样品）由重庆市大足中医医院药剂科提供。钩藤水提物对照品由中国药品生物制品检定所提供。2.2色谱条件与系统适用性实验2色谱条件和系统适用性实验分别精密吸取供试品溶液10μl与对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别进样5次，计算保留时间、峰面积和峰高的RSD值。结果显示，在波长为274nm、流动相为乙腈-0.1%磷酸（v/v）、流速为1.0ml/min、柱温为30℃时，钩藤总苷和异鼠李素的保留时间分别为8.1min和8.7min；在波长为274nm0.1%磷酸（v/v）min，异鼠李素的保留时间分别为8.1min和8.7min；在波长为274nm0.1%磷酸（v/v），异鼠李素的保留时间分别为8.5min和8.5min。分别按峰面积计算，钩藤总苷的平均回收率分别为98.01%（RSD=0.36%），RSD=0.57%；异鼠李素的平均回收率分别是98.02%（RSD=0.26%），RSD=0.63%。2.3方法学考察采用“3.3”中的方法，准确地提取了10微升的钩藤皂甙作为标准物质，以r=0.999为标准进行了分析，结果显示：本法具有较好的精密度。研究发现，从0.5小时到2小时，各成分的峰形和含量都随着提取时间的增加而降低，2小时到4小时之间几乎没有改变，这意味着样品在12小时之内保持了较好的稳定性。实验证明，该方法的进样率均达到了标准（相对标准偏差为2.45%）。采用标准“3.3”中所述的方法，分别以对照品、对照品和对照品10微升为标准，进行了精确度分析，所得数据符合标准要求。研究发现：12小时后样品的稳定性较好，对照品峰面积及质量浓度呈一定的下降趋势。钩藤水提物中总生物碱含量随时间变化而降低，并逐渐稳定。3.1.2.钩藤水提物中总生物碱稳定性研究钩藤水提物成分稳定与否影响着其临床应用的安全、有效，本实验以钩藤水提物为研究对象，采用高效液相色谱法（HPLC），对不同时间样品的钩藤总苷含量进行测定，结果表明：不同时间样品中总生物碱的含量基本稳定，且呈一定的规律性变化。钩藤水提物中主要成分的变化本实验采用HPLC法对不同时间样品中总生物碱含量进行测定。实验分别将钩藤水提物制成浸膏（A）、浸膏（B）和水提物（C），按“项下方法进行测定，结果发现：在常温下（25℃），A、B、C的总生物碱含量均随时间延长而逐渐降低，但含量变化趋势不明显；而在低温（4℃）下，A均随时间延长而逐渐升高，但含量变化趋势不明显；在室温条件下，A均随时间延长而逐渐降低，且含量变化趋势不明显。本实验采用HPLC法对不同时间样品中总生物碱含量进行测定，结果发现：钩藤水提物中总生物碱的含量随时间延长而逐渐降低，且在12h内变化不明显；在常温下（25℃）钩藤水提物中总生物碱含量呈逐渐降低趋势。讨论本实验将钩藤水提物成分与其总生物碱稳定性进行研究，以探究钩藤水提物成分与其总生物碱的稳定性及相关性。结果表明：钩藤水提物中的主要成分为生物碱。3样品溶液制备在将样本溶液的配制过程中，将大约10g的钩藤草药放入蒸发碟中，将70%乙醇50ml，水80ml，蒸馏水放入到100ml的容量瓶中，再将甲醇添加到标度线上，然后将其摇匀，以待用。试样溶液的配制，分别将1,2,3,4,5,6,7各适量放入25ml的容量瓶中。钩藤总碱（1）以标准物质（1）为标准物质，以标准物质为标准，以50%的乙醇为溶剂，将标准物质加入1ml0.1mg，得到标准物质。各取1,2,3,4mL，放入10mL的量瓶中，以乙醇为溶剂，以乙醇为溶剂，将其稀释到刻度，然后摇动，得到相应的溶液。准确地将20mL放入液相层析器，并作图谱。采用外标分析方法，以色谱峰面积为指标进行测定。在100mL的量瓶中加入乙醇，通过测定其峰面积，得到了该量瓶中的总碱量。稳定性研究将5克左右的钩藤类草药粉放入蒸发盘中，加入50毫升的70%酒精，并在热水中加热2小时（直到草药变色）。在加热时将其过滤到100毫升的体积瓶子里，加入甲醇到刻度线上（每100毫升5毫升）。摇动均匀，加20微升样品。通过将所述参比物质与所述试样溶液相比较，将所述参比物质与所述试样溶液的所述进样量作为纵轴，通过所述峰面积来计算所述总生物碱类的含量（Y）。研究了不同处理条件对不同处理条件下，不同处理条件对药材质量的影响。结果表明，在不同的处理条件下，不同的处理方法对不同的处理效果均有不同程度的影响。而各批药材的总碱类成分差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明，在室温下，钩藤总碱能保持6个月的稳定性。3.1钩藤总生物碱（2）的配制取钩藤药粉5克左右，精确称量，置有塞子的圆筒内，加50毫升甲醇，称量，超声波处理30分钟（200W)，冷却后再次称量，以乙醇补全失去的分量，摇晃后过滤。准确地将2ml的后续滤出物放于有塞的圆锥瓶子内，再准确地添加50ml的50%乙醇，称量后进行超声波处理30分钟。将续滤过的液体2ml放于有塞的圆锥瓶子中，精确地添加50ml的50%甲醇，称定后进行超声波处理（200W的功率）30分钟；将续滤液2ml放于具塞圆锥瓶子内，将续滤液2ml放于具塞圆锥瓶子内，并将续滤液2ml放于具塞圆锥瓶子内，并精确添加50ml(00W),30分钟；精确地将剩余的滤液2毫升放于有塞的圆锥瓶子中，并精确地添加50毫升（00W)50毫升，30分钟；准确地将2ml续滤过的液体放入有塞的圆锥瓶子中，准确地称量。3.2试样的确定C18柱子（250毫米×4.6毫米，5微米）用于HPLC；用甲醇-水（10:90V/V）作为流动相；流速1.0毫升/min-1；本实验采用红外光谱和红外光谱技术，测定了红外光谱和红外光谱。结果表明，在0.342~3.465μg·mL-1的范围内，生物碱峰面积与各受试品溶液的质量浓度具有良好的线性关系（r=0.9998）。在将薄层层析（TLC）样品溶液经过色谱柱进行分离之后，在与对照品色谱对应的位置上，分别加入同样量的对照品溶液、供试品溶液，并各维持1小时，并测量各供试品溶液及对照品溶液与其对应维持时间处的色谱峰面积，从而计算出总生物碱含量。定量测量取1,2,3,4,5,6,7各10份，各取1,2,3,4,5,6,7，将各样品液0.5ml放入25ml的容量瓶内，以甲醇稀释到刻度后，进行摇动，得到样品液。根据以上所述的实验条件，分别对所测样品和对照样品进行了分析。研究表明，所测样品和对照样品在不同的保持时间下的峰形都满足了高效液相色谱分析方法的要求。采用高效液相色谱（LC-MS)，将1.0mL的甲醇-水（10:1,V/V）作为流动相A，将其添加到所述的试样溶液中；以甲醇-水（10:1,90,V/V）为A流动相；B是以甲醇和水（10:1,90,V/V）为流动相，E是甲醇和水（10:1,90,V/V）为流动相。样品体积为10微升。4色谱条件色谱柱：ZorbaxSB-C18（250mm×4.6mm,5μm）；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；检测波长：230nm。样品处理方法：取样品100mg，以70%乙醇为提取剂，超声处理30min，放冷，称重，用70%乙醇定容至1000mL，摇匀，滤过。实验结果与分析：取钩藤提取物1.0g（约相当于生药1g），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30mL，密塞。称定重量后水浴加热至100℃，浸泡12h。过滤后放冷至室温。取上清液，用甲醇稀释至刻度，摇匀后作为供试品溶液。进样10μL与峰面积的线性关系良好（r=0.9998）。4.1钩藤提取物化学成分的研究钩藤是常用中药，性味苦、甘，寒，归肝、肾经。具有清热解毒、散瘀消肿、平肝息风的功效，主要用于感冒发热，咽喉肿痛，头痛，惊痫抽搐。钩藤中的生物碱主要有钩藤碱-2-甲基-7-羟基-3-甲氧基钩藤碱及3种未知生物碱。其中钩藤次碱-二甲基-三甲基霍米特是钩藤主要有效成分。钩藤次碱的主要药理作用是抑制血小板聚集和血小板粘附率的作用。在体外实验中，可抑制血小板聚集和粘附；在体内实验中，对小鼠血小板聚集有明显的抑制作用；对红细胞粘附有明显的抑制作用；还可促进血小板释放。此外，还有抑制毛细血管通透性的作用。研究表明，钩藤次碱-三甲基霍米特是一种很强的抗血栓形成作用的药物成分。其中生物碱中的4种成分在动物实验中有抗血小板聚集和降低血液粘度的作用。对钩藤总生物碱进行了HPLC分析，发现其主要成分为2种未知生物碱，即钩藤次碱-二甲基-三甲基霍米特及三甲基-7-羟基-3-甲氧基钩藤碱。其中二甲基霍米特为首次从该植物中分离得到的一种生物碱。对钩藤总碱的稳定性进行了研究，发现其在不同条件下都能保持一定的稳定性，但在不同温度、不同时间下，总生物碱的稳定性不同。说明钩藤中的这2种生物碱是钩藤中的主要药效物质。4.2.钩藤水提物成分分析由表1可以看出，总生物碱含量占总成分的比例较大，在其提取物中，有3种成分的含量超过了30%，分别为钩藤次碱-二甲基霍米特（6.22%）、钩藤次碱-三甲基霍米特（5.38%）和三甲基-7-羟基-3-甲氧基钩藤碱（6.27%）。这些成分在体外对血小板聚集有抑制作用。结论综上所述，钩藤水提物中含有大量的生物碱，具有较好的药理作用。通过HPLC分析，发现其主要成分为钩藤次碱-二甲基霍米特（6.22%）和钩藤次碱-三甲基霍米特（5.38%）；在提取过程中，二甲基霍米特会溶于水和乙醇等溶剂中；在储存过程中，二甲基霍米特不会发生分解。随着提取温度和提取时间的增加，其总生物碱的含量会随之增加。而钩藤次碱-二甲基-三甲基霍米特（6.22%）在常温下能稳定存在于水中，但在40℃时会分解。此外，钩藤次碱-二甲基-三甲基霍米特（4.31%）和钩藤次碱-三甲基-三甲基霍米特（5.38%）在高温下会发生分解，但分解的程度比较小。此外，钩藤次碱-二甲基-三甲基霍米特水提取物具有抗血小板聚集和降低血液粘度的作用。4.2钩藤总生物碱含量测定精密称取钩藤提取物1.0g，按“2.2”项下方法制备提取物样品溶液，取10μL，分别于5、10、15、20、25℃水浴上加热回流1h，冷却后置冰箱中保存，于0~4℃冰箱中冷冻备用。按“2.3”项下色谱条件进样，测定峰面积。结果显示钩藤提取物在20~25℃的平均质量浓度为2.14mg/mL(n=6)，标准曲线方程为Y=22.393X+17.858(r=0.9998)。钩藤中总生物碱含量较低，因此以总生物碱含量为指标考察其稳定性。结果显示：钩藤提取物在5、10、15、20、25℃温度下放置3个月后其总生物碱含量有所增加，说明该条件下保存时间越长钩藤提取物中总生物碱含量越高。在此实验条件下钩藤水提物中的总生物碱在高温环境下能保持相对稳定，且提取物的提取液在一定程度上可用于测定其总生物碱含量，可为钩藤的质量控制提供一定参考。5线性关系考察在110-120nm的波段，用乙醇-水（85:15）作流动相，准确地提取了1.0微升的甲醇溶液。在表1中给出了结果。在0.378-0.724ug/mL之间（r=0.999）具有良好的线性。研究：在上述色谱条件下，分别精密抽取混合对比品溶液及供试品溶液6份，将它们分别置于10ml的量瓶中，以甲醇-水（85:15）为流动态，按照上述色谱条件进行测量，并将峰面积记录下来。研究发现，在1.0ug/mL（r=0.999）的条件下，总碱峰面积和质量含量之间具有很好的线性相关性。精密度实验：将对照品和供试品的混合溶液6份，每组10微升，放入液相层析仪器中，测量其峰面积。用色谱峰面积A作为纵向坐标，用RSD作为横向坐标，用RSD作为横向坐标，画出了标准曲线。从图2中可以看出，在0.378至0.924ug/mL的范围中，钩藤的总生物碱类物质含量具有较好的线性。稳定性测试：将以上对照品的混合溶液，对照品的溶液和对照品的溶液，分别放入褐色的瓶子里，加入甲醇，乙醇，丙酮，乙酸乙酯5毫升，超声波30分钟，加入50%乙醇补充至刻度，然后摇动，过滤，再得到一次滤液，即为对照品的溶液。在此基础上，用（A）作为纵轴，在此基础上，测量了它们的峰面积。从图3可以看出，在某一浓度范围（0.378~0.924ug/mL）中，钩藤总生物碱的含量与质量浓度之间存在着较好的线性关系。研究发现，在0。5~0。10g/ml之间，钩藤水提液的总碱值与峰面积线性相关较好。重现性测试：同样批次的5个试样（110603)，用以上所述的测试方式进行测试，并求出相对标准差。实验证明，每一批试样的相对标准偏差都在2.0%以下，证明了该方法的准确性和可靠性。样品的回收率测试：将对照品和供试品（批次110603,110612)6份放于褐色瓶子中，用50%酒精补充至刻度，用以上方法进行分析。并进行了回收率及相对标准偏差%的测定。结果表明，相对标准偏差为2%，平均回收率为98.06%。表明本文提出的分析方法是可行的。6回收率实验精密度试验按照“1”中的方法，采用标准曲线方法，将样品溶液2.5,5,10,15,20出RSD值。对不同提取方法进行了比较，对不同提取方法进行了比较，发现其提取率为93.8%（相对标准偏差为3.0%,n=5）。通过对各种萃取方法得到的总碱类成分进行分析，并以此为基础对其进行了稳定性研究。样品溶液按照“1”中所述的方式配制，用2.5,10,15μL的样品溶液精确地抽取2.5,10,15μL的样品溶液，放入液相色谱仪中测定，并以样品溶液（0.10mg/ml）作为比较基准，以样品的峰面积和相对标度差作为横向标度，画出样品的标准曲线。研究发现，随着时间的推移，随着时间的推移，在1-5ug/ml的浓度下，钩藤总碱类成分的含量逐渐升高。重复试验中，对照品（0.10mg/ml）和对照品（0.5mg/ml）按照“1”中的方式配制，对照品（0.10mg/ml）和样本（0.5mg/ml）按照“2”中的方式配制。取各供试品溶液各两份，分别精确地添加10%酒精10ml，摇动之后，以70%酒精为溶剂，又取5份样品（0.5mg/ml)，将其溶解并定容在100ml的容量瓶中，在摇动之后，将其输入到液相色谱仪中进行分析。将每种样品分别提取两个样品，按照“1”中的步骤，进行峰面积的测量。7样品含量测定精密称取样品各10份，置100ml容量瓶中，加70%乙醇100ml，超声处理15min，过滤后置于棕色瓶中，摇匀，置冰箱冷藏24h后，再加70%乙醇至100ml，摇匀，放置24h后精密量取10ml至100ml容量瓶中，加70%乙醇至100ml容量瓶中，摇匀，置冰箱冷藏24h后，取20μL注入液相色谱仪（EclipsePlus）中进行检测。结果显示不同溶剂提取的总生物碱含量无显著性差异。说明该方法适用于不同溶剂提取的总生物碱的含量测定。7结论：1钩藤水提物经测定样品含量为10.38%。2实验结果表明：样品在不同温度和光照条件下其总生物碱含量均有一定的变化趋势。3钩藤总皂苷在不同溶剂提取的样品中具有很好的稳定性。4该方法适用于钩藤水提物的测定，且操作简单、快速。结论本研究采用高效液相色谱法对钩藤水提物中总生物碱进行分离和定性鉴别，并对钩藤水提物中总生物碱的稳定性进行研究。结果显示，采用HPLC法鉴定出3个钩藤水提物中总生物碱的成分分别为：钩藤碱、2-甲基-4-异丙基-环庚三酮-7-羟基-1,2,4-三甲胺基-二苯甲酮丙基-环庚三酮-7-羟基-1,2,4-三甲胺基-二苯甲酮丙基-环庚三酮-7-羟基-1,2,4-三甲胺基-二苯甲酮；通过对钩藤水提物中总生物碱的稳定性研究发现：当温度为25℃、pH=4~6、光照时间为12h时，钩藤水提物中总生物碱的稳定性最好；而当温度为40℃、pH=10~12,钩藤水提物中总生物碱的稳定性较差。结果表明：钩藤水提物中总生物碱的稳定性与其成分种类有关，钩藤生物碱具有较强的光稳定性和热稳定性，其中2-甲基-4-异丙基-环庚三酮-7-羟基-1,2,4-三甲胺基-二苯甲酮是钩藤水提物中含量较高的成分。本研究建立了一种简单、快速、准确的钩藤水提物中总生物碱的定性与定量分析方法，为进一步研究钩藤水提物中总生物碱的稳定性及活性评价奠定了基础。同时采用高效液相色谱法对钩藤水提物中总生物碱的成分进行了分离与鉴定，并对