T-SAASS 216-2025 中国荷斯坦牛活体采卵技术规程

ICSCCS65.020.30B43体SAASS标准Codeofpracticeforovumpick-upinchineseholsteincattleIT/SAASS216—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东奥克斯畜牧种业有限公司提出。本文件由山东农学会归口。本文件起草单位：山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：马庆涛、张燕、肖遥、王玲玲、李彦芹、赵秀新、李建斌、黄金明、高运东。T/SAASS216—20251中国荷斯坦牛活体采卵技术规程本文件规定了中国荷斯坦牛活体采卵的技术流程、供体的选择、饲养管理、超数排卵、活体采卵条件、活体采卵操作、卵母细胞捡出和档案记录。本文件适用于中国荷斯坦牛活体采卵。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3157中国荷斯坦牛GB/T25915.1洁净室及相关受控环境第1部分：按粒子浓度划分空气洁净度等级GB/T26938牛胚胎生产技术规程GB/T35568中国荷斯坦牛体型鉴定技术规程GB/T40184畜禽基因组选择育种技术规程GB/T45202牛体外胚胎生产和移植技术规程NY/T1335牛人工授精技术规程NY/T1450中国荷斯坦牛生产性能测定技术规范NY/T3445畜禽养殖场档案规范3术语和定义GB/T26938、GB/T35568、GB/T45202和NY/T1450界定的术语和定义适用于本文件。4技术流程中国荷斯坦牛活体采卵流程见图1。图1中国荷斯坦牛活体采卵流程示意图5供体的选择5.1品种应符合GB/T3157要求，三代系谱档案完整。5.2体况评分宜2.75分～3.25分（采用5分制评分）。5.3体质健康，生殖器官和繁殖机能正常，无遗传缺陷和传染性疾病。5.4青年牛月龄宜为12月龄～24月龄，有2次及以上正常发情周期，按照GB/T40184的规定进行个体遗传评估，综合选择指数位于群体前10%。5.5成母牛宜产后60d以上，有2次及以上正常发情周期，按照NY/T1450的规定进行生产性能测定，生产性能位于群体前10%；按照GB/T35568的规定进行体型鉴定，体型总分不小于75。6饲养管理2T/SAASS216—2025供体的饲养管理应符合以下要求：a)保持适宜的饲养环境，提供洁净的饮水；b)制定合理的日粮配方，保证营养全面、均衡，可适量补充维生素A、维生素D、维生素E和微量元素，剂量参见产品说明；c)超数排卵前1月，加强饲养管理，避免调群、运输等应激反应；d)超数排卵前1月，不应注射疫苗。7超数排卵7.1发情处理使用肌肉注射前列腺素（Prostaglandin，PG）法，在发情周期的任意一天注射PG，注射后24h~96h观察发情。未发情供体可间隔11d～14d第二次注射PG，注射后24h～96h观察发情。发情鉴定方法按照NY/T1335的规定执行。7.2超数排卵方法7.2.1开始时间自然发情或使用PG进行发情处理的供体，发情当天记录为第0d，第7d使用活体采卵仪进行去优势卵泡处理，第9d下午开始肌肉注射促卵泡素（Follicle-StimulatingHormone,FSH）进行超数排卵。7.2.2FSH注射方法按照产品说明确定每头牛注射FSH的总剂量，注射时分5次注射（第1次注射时间宜为17:00～19:00每次注射间隔12h，每次注射量根据表1中百分比依次递减，注射方法见表1。表1FSH注射方法去优势卵泡8mm）———7.3重复超数排卵供体可重复进行超数排卵，重复超数排卵的间隔时间宜7d以上，连续采卵次数不超过10次。8活体采卵条件8.1场地活体采卵及捡卵场地应符合以下要求：a)采卵室和捡卵室相邻并设置传递窗，两者均为独立封闭的操作空间；b)采卵室使用面积应不小于20m2，温度保持在18℃~25℃,两侧应留有安全通道，并配备牛保定架、赶牛通道，人员、牛只进出安全方便；c)捡卵室使用面积应不小于15m2，温度保持在20℃~25℃,应配备通风净化设备，洁净等级应符合GB/T25915.1中ISO8级的要求；d)提供稳定电源，配备上下水，冲洗打扫方便。8.2器材活体采卵与捡卵器材按附录A执行。8.3时间T/SAASS216—20253供体牛FSH注射完成后18h～24h内进行采卵。9活体采卵操作9.1采卵前准备9.1.1采卵前将采卵液分装入50mL无菌离心管中，每管10mL～20mL，使用烘箱预热至35℃~37.5℃。9.1.2将活体采卵仪、负压泵以及金属浴等仪器有序摆放到采卵车上，确保正常工作。负压泵的负压调整到100mmHg，金属浴的温度设置为37.5℃,采卵期间温度保持恒定。9.1.3连接负压泵、采卵管和胶塞与采卵针，操作时应在酒精灯火焰附近进行，采卵针和剪刀随时灼烧消毒。9.1.4活体采卵仪探头端部涂抹耦合剂后套上保护套。9.1.5将供体赶入保定架中，保证牛只无法前后挪动和左右摆动，清理直肠宿粪。9.1.6选用5mL盐酸利多卡因（2%）施行荐尾椎硬膜外麻醉，麻醉后将牛尾向前固定于其身体一侧。9.1.7清洁供体外阴，然后喷洒75%酒精消毒，再用纸巾擦净。9.2采卵操作9.2.1将活体采卵仪探头端部涂抹润滑液后，轻缓插到阴道穹窿处，通过直肠隔着直肠壁将卵巢牵拉至采卵仪探头端部。9.2.2根据B超影像，选择清晰可见的卵泡，推进采卵针，采卵针穿过阴道壁，刺破卵泡壁的同时用脚踏开关控制负压泵抽吸卵泡液至离心管中，两侧卵巢的所有卵泡均需穿刺。9.2.3用采卵液冲洗采卵针和采卵管，冲洗液也一同回收到离心管中。9.2.4采卵结束后在离心管上标记供体号、穿刺卵泡数量、采卵结束时间以及采卵人。9.2.5每头牛采卵完成后，均需更换采卵针和采卵管，更换过程参见9.1.3。10卵母细胞捡出10.1回收液过滤记录离心管上的信息，包括供体牛号、卵泡数、采卵结束时间、采卵人，记录到达实验室时间，将回收的液体倒入侧漏式集卵杯中进行过滤，用磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBS）冲洗离心管内部至液体澄清，洗涤液回收到侧漏式集卵杯中。10.2卵母细胞捡出用PBS冲洗侧漏式集卵杯中的液体，至液体清亮。侧漏式集卵杯中保留10mL～20mL液体，置于38℃玻璃热台上，在体视显微镜下依次寻找并捡出卵母细胞。10.3卵母细胞分级捡出的卵母细胞移入培养皿的成熟培养液中，1头供体的卵母细胞应放在1个培养皿内。体视显微镜下按形态学方法将卵母细胞分为4个级别，分级方法按照GB/T45202的规定执行。10.4卵母细胞的洗涤挑选A级、B级和C级卵母细胞在成熟培养液中清洗3遍后，以成熟培养液为载体将每头牛的卵母细胞装入细管中，做好标记。记录回收卵母细胞数、成熟开始时间。10.5卵母细胞的运输捡出的卵母细胞放入胚胎运输箱运输到胚胎培养室中继续下一步操作，胚胎运输箱温度设置为38℃。11档案记录中国荷斯坦牛活体采卵过程中，应记录各项数据，参见附录B。档案管理按照NY/T3445的规定执行，档案保存2年。T/SAASS216—20254（规范性）主要设备、器械与试剂A.1活体采卵与捡卵主要设备采卵车、活体采卵仪、负压泵、金属浴、体视显微镜、烘箱、胚胎运输箱、玻璃热台等。A.2活体采卵与捡卵主要器械采卵管及胶塞、采卵针、探头保护套、温度计、酒精喷壶、酒精灯、打火机、细嘴盐水瓶、注射器、注射针头、水桶、纸板、剪刀、侧漏式集卵杯、移液枪、培养皿、离心管（50mL）、乳胶手套、长臂手套、记号笔等。A.3活体采卵与捡卵主要试剂肝素钠（针剂）、采卵液（见GB/T45202）、