医学生物化学实验教案

《医学生物化学实验》教案

第1次课2学时

3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖

实验项目

实验性质设计性实验

1.了解糖的还原性

教学目的和2.掌握还原糖定量测定的原理和方法。

要求3.熟悉分光光度计的使用方法°

3、熟悉分光光度计的使用方法。

重点:绘制标准曲线的方法，分光光度计的使用原理和使用方法。

教学重点与

难点：标准曲线的应用。

难点

难点：标准曲线的应用。

1.试剂

（l）lmg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖lOOmg,力口

少量蒸馋水溶解后，以蒸储水定容至100mL,即含葡萄糖为

1.Omg/mLo

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：称取6.3g3,5-二硝基水杨酸并量

取262mL2mol/LNaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182g酒石酸钾

纳溶于500nL水中），再加5g结晶酚和5g亚硫酸氢钠溶于其中，搅

实验材料1

拌溶解，冷却后定容到1000mL贮于棕色瓶中。

（3）未知浓度还原糖。

2.材料

小麦淀粉或玉米淀粉。

3.器材

分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

分光光度计，天平，水浴锅，甩炉，试管若干等。

一、实验原理★:在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸

实验内容

（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性

溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓

度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样

品中的含糖量。

NO2NO2

（DNS）（3-氨基-54醒水杨酸）？

黄色桔红色

二、实验步骤：

1.取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为Img/mL的葡萄糖

标准液、蒸镭水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

lmg/ml葡萄蒸储葡萄糖光密度值

DNS

管号糖标准液水含量(0D-540nm

(mL)

(mL)(mL)(mg))

100.50.50

20.10.40.50.1

30.20.30.50.2

40.30.20.50.3

50.40.10.50.4

60.500.50.5

7（未知浓

0.500.50.5

度还原糖）

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸镭

水补足至5mL,加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长

540nm,用1号管调零点，分别测出2、6号管的光密度值。

2幺会制标^曲上

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标

准曲线（电脑Excel完成最好）。计算7号管还原糖的百分含量。

三、结果与计算▲:

计算出7号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原

糖亳克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

查曲线所得葡萄糖毫克数X提取液总体积/测定时取用体

积

还原糖闾

=----------------------------------------------------X100%

样品毫克数

教学过程中师生活动设计

糖的还原性，具有还原性的糖结构有何特点？

提纲、板可设计

实验原理与反应方程式，实验步骤中表1与计算公式

实验原理与反应方程式，实验步骤中表1与计算公式

1、为什么要设置空白对照？

作业2、标准曲线的定义？

3、标准曲线的定义？

[1]《生物化学实验》，何幼鸳、汤文浩，华师出版社，2013

主要

[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

参考资料

[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

1、让学生理解糖定量测定的原理与方法；

总结分析2、强调标准曲线的绘制要点；

3、需要和学生一起推导还原糖浓度的公式

《医学生物化学实验》教案

第2次课2学时

实验项

糖的呈色反应和还原糖检验

目

实验性

验证性实验

质

教学目1.了解糖类某些颜色反应的原理

的和要2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法

求

教学重重点：颜色反应鉴别糖的方法

取1支试管，只加2滴莫氏试剂作为空白对照，倾斜4支试管，沿各试管

壁缓慢加入浓硫酸约1.5mL,慢慢立起试管，切勿摇动。试管中液体

分成两层，浓硫酸在试液下面。在两液分界处有紫红色环出现。观察、记

录各管颜色。

间苯二酚反应：取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、

1%果糖溶液各0.5mL0再向各管分别加入塞氏试剂2.5mL,混匀。将3

支试管同时置于沸水浴中，注意观察颜色的变化与变化时间。

托伦反应：取3支试管，分别加入幽阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液、

1%葡萄糖溶液各0.1mL,再向各管分别加入托伦试剂1mb,混匀。将3

支试管同时置于沸水浴中，观察、记录颜色的变化与颜变化的时间。

教学过程中师生活动设计

观察和记录各管颜色与颜色变化的时间后，说出各管颜色变化的原因。

提纲、板书设计

原理与操作步骤

1.简述a—蔡酚反应原理。

作业

2.可用何种颜色反应鉴别酮糖存在。

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

料

1.让学生掌握糖显色反应的原理；

总结分

2.给学生强调注意观察各管颜色变化的时间

析

2、给学生强调注意观察各管颜色变化的时间

《医学生物化学实验》教案

第3次课2学时

实验项目蛋白质等电点和沉淀反应

基础性实验

实验性质

1.了解蛋白质的两性解离性质。

教学目的和2学.习测定蛋白质等电点的方法。

要求3.了解蛋白质变性与沉淀的关系与沉淀蛋白质的方法以与其实用意

义。

重点：学习测定蛋白质等电点的方法与沉淀蛋白质的方法。

难点：蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性；

变性的蛋白质不一定表现为沉淀。

教学重点

难点：蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性：

与难点

变性的蛋白质不一定表现为沉淀。

难点：蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性；

变性的蛋白质不一定表现为沉淀。

（・）材料

新鲜鸡蛋

实验材料（二）试剂

1.0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL

2.1.00mol/L醋酸溶液100mL

3.0.10mol/L醋酸溶液300mL

4.0.01mol/L醋酸溶液50mL

5.蛋白质溶液500mL

5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:水二1:9）

6.PH4.7醋酸一醋酸钠的缓冲溶液100mL

7、3%硝酸银溶液10mL

8、5%三氯乙酸溶液50mL

9、95%乙醇250mL

10、饱和硫酸铉溶液250mL

11.硫酸镂结晶粉末10000mL

12.0.Imol/L盐酸溶液300mL

13.0.Imol/L氢氧化钠溶液300mL

14.0.05mcl/L碳酸钠溶液300mL

15.甲基红溶液20mL

（三）器具

水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管与试管架

1.实验原理★:

蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在卜列平衡：

实验内容COOH

P

量白及分子

4|

1

COOH

COO-+H-/°°'+H-

PPj.............1P

OHOH

NH2*NH;*'NH;

阴离子

pH>p!pH=plpH<pI

最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

蛋白质的沉淀反应可分为两类。

(1)可逆的沉淀反应

(2)此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起

沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并俣持其天然

性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙

酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。

(3)不可逆沉淀反应

此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉

淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与

重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并

不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也

未必都已变性。

二、实验步骤：

(一)酪蛋白等电点的测定

(1)取同

样规格的

0.01mol/L

试管4蒸储水0.1mol/L蜡1.0mol/L

蜡酸

支，按下(mL)酸(mL)蜡酸(mL)

(mL)

表顺序分

别精确地

加入各试

剂，然后

混匀。

试管号

18.40.6一—

28.7一0.3—

38.0——1.0—

47.4————1.6

（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL,加一管，摇匀

一管。此时L2.3.4管的pH依次为5.9、5.5.4.7,3.5。观察其混浊

度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白

的等电点。

（二）蛋白质的沉淀与变性

1.蛋白质的盐析

无机盐（硫酸钱、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白

质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。

如球蛋白可在半饱和硫酸铁溶液中析出，而清蛋白则在饱和

硫酸铁溶液中才能析出。

由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解,

故蛋白质的盐析作用是可逆过程。

加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸镂溶液，混匀

后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水,

观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸锈粉

末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。

取出部分清蛋白，加少量蒸锵水，观察沉淀的再溶解。

3、2、重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水

的复合物。

4、取1支试管，加入蛋白质溶液2mL再加3%硝酸银溶液1—2滴,

振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量

的水，沉淀是否溶解？为什么？

5、某些有机酸沉淀蛋白质

取1支试管，加入蛋白质溶液2矶，再加入1疝5%三氯乙酸溶液,

振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量

水，观察沉淀是否溶解。

4.有机溶剂沉淀蛋白质

5、取1支试管，加入2矶蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。观

察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl,混匀。

6、乙醇引起的变性与沉淀

取3

支试

0.Imol/L0.Imol/

管，蛋白质PH4.7缓

氢氧化钠L盐酸溶95%乙醇

编溶液冲溶液

溶液液

号O

依下

表顺

序加

入试

剂：

试剂

(mL

)

管号

11——11

211—1—

31—11—

振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水8mL,

然后在第2,3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.Imol/L醋酸溶液

与0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。

每管再加0.Imol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生

的全部现象。

教学过程中师生活动设计

蛋白质沉淀原理，什么是蛋白质变性？根据性质推测其应用

提纲、板可设计

原理与简要操作步躲

1.什么是等电点？

作业

2.临床上为什么可以用蛋清或牛乳解救误服金属盐的病人?

2.临床上为什么可以用蛋清或牛乳解救误服金属盐的病人？

[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

主要

2010

参考资料

[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

2010

1、通过原理分析，帮助学生理解“沉淀的蛋白质不一定表现为变性；

变性的蛋白质不一定表现为沉淀”；

总结分析

2、重点区别：“可逆沉淀”与“不可逆沉淀”

3、重点区别：“可逆沉淀”与“不可逆沉淀”

《医学生物化学实验》教案

第4次课2学

时

实验项蛋白质和氨基酸显色反应

目

实验性基础性实验

质

教学目1.学习和了解常用的儿种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。

的和耍

.了解蛋白质与氨基酸的显色反应原理。

求2

教学重重点：蛋白质与氨基酸的显色反应原理。

点与难难点：鉴定蛋白质与氨基酸的方法。

占

/、、、难点：鉴定蛋白质与氨基酸的方法。

试剂：0.5%醋酸铅1mL、10%Na0H>1%CUSO4

器具：水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管与试

实验材

管架

料

器具：水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管与试

管架

一、实验原理★:

1.双缩胭反应（biurotreaction）

蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或

红色，此反应称为双缩服反应，双缩股反应可用来检测蛋白质水解程度。

2.苯环的黄色反应-----------------

Tyr（Trp）+浓硝酸一►黄色

Phe+少量浓硫酸+浓硝酸一a黄色

3.醋酸铅反应（半胱氨酸和胱氨酸）

R-SH+2NaOH—►R-0H+Na2S+H20

Na2S+Pb2+—>PbS+2Na+

PbS+2HCl—►PbC12+H2S

二、实验步骤▲:

实验内1.双缩胭反应（biuretreaction）

取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清:水=1：9）约1mL和10%Na0H约2mL,

容

摇匀，再加1%CUS04溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。

2.苯环的黄色反应

向6123456

个试管中

按下表加

试剂，观

察现象并

记录。鸡

蛋清溶液

（蛋清：

水=1:9）

管号

材料鸡蛋清指头0.5%苯0.3%色氨0.3%酪氨酸

发

液甲酚酸

（滴）4少少444

许许

浓硝酸22020444

（滴）

现象

逐滴加

10%NaOH

后现象变

化

3.醋酸铅反应

0.5%醋酸铅1mL、10%Na0HlmL、卵清蛋白1mL三样试剂混匀加热,观察现

象。然后冷却至20~30℃,加10滴浓HCL,再将湿润的醋酸铅试纸放于管

口，加热，嗅其气味同时观察试纸颜色变化。

教学过程中师生活动设计

含苯环的氨基酸有哪些？双缩胭反应颜色与什么相关？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

I.在实验室如何区分核酸和蛋白质？

作业2.黄色反应中为何会出现深浅不一的黄色？

2.黄色反应中为何会出现深浅不一的黄色？

[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

主要[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

参考资2010

料[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

2010

总结分1、实验过程中让学生重点观察颜色变化的过程；

析2、醋酸铅反应的每一步都要记录现象

《医学生物化学实验》教案

第5次课2学

时

实验项糖的薄层层析

目

基础性实验

实验性

质

教学目1.了解薄层层析的基本原理。

的和要2.熟悉薄层层析的操作过程。

求

重点：掌握薄层层析的吸附原理。

教学重

难点：掌握分配系数，Rf值。

点与难

难点：掌握分配系数，Rf值。

八卢、、

难点：掌握分配系数，Rf值。

实验材

四种糖样品、突色液、扩展剂、层析缸、层析板等

料

一、实验原理★:

薄层层析（值称TLC）是在吸附层析基础上发展起来的一种微量而快速的

层析法，它是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层

实验内

析。为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅

容

胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，在吸附剂或支持剂中添加合适

的粘合剂后再涂布，可使薄层紧贴在玻璃板上。

糖是多羟基化合物在硅胶G薄层上展层时，被吸附的强弱有差异，同时在

展开剂中溶解性质也有差异。吸附力主要与糖的相对分子质量和羟基数有

关，一般为三糖〉二糖〉单糖，醛糖〉酮糖〉脱氧糖。经过适当的溶剂展

开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖,己糖〉双糖〉三糖。

薄层层析与其他方法比有明显的优点：层析时间短、样品用量范围大（1口

g-0.5g）,观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高

10-100倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。而且薄层层析法操作方便,

设备简单，所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。

二、实验步骤▲:

1.点样

选取制备好的薄板一块，在距底边L5cm的直线上均匀选4个点。用毛

细管分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5T0ug,斑点直径不

超过3mm。点样完毕，立即用电热吹风机吹干样点。

2.展层

将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达

离薄板顶端约1cm处时取出薄板，在溶剂前沿处作一记号，于80C下烘干

5mino

3.显色

除尽溶剂后，向薄层板上喷雾糖显色剂，于80℃下烘干lOmin,则各种糖

分别显出不同的颜色。

三、实验结果▲:

（1）记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值。

（2）鉴定混合糖中糖的种类，并绘出层析图谱。

教学过程中师生活动设计

还有哪些层板方法？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

何谓Rf值？Rf值与什么因素有关？

作业

[1]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

主要参

[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010

考资料

1、点样是本实验的关键，教师在指导学生操作时，强调点样要轻、快，

总结分稳、小并且点样点要集中；

析2、放展板时，点样点不要浸如展层溶液中

3、放展板时，点样点不要浸如展层溶液中

《医学生物化学实验》教案

第6次课2学

时

实验项酶的特性

目

基础性实验

实验性

质

教学目掌握酶促反应速度的几个主要影响因素

的和要了解淀粉水解程度的鉴定。

求

教学重重点：唾液淀粉酶催化的酶促反应；淀粉水解程度的判断。

点与难难点：酶活性的影响因素。

点难点：酶活性的影响因素。

仪器：水浴锅、电炉、白瓷板、试管、量筒、漏斗、脱脂棉。

试剂:0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%NaCl溶液、1%CUS04溶液、

l%Na2S04spH=5.0、pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。

实验材

试剂：0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%Na淀溶液、1%CUS04溶液、

料

l%Na2S04.pH=5.0>pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。

试剂：0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl>0.85%NaCl溶液、1%CUS04溶液、

l%Na2s04、pH=5.0、pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。

一、实验原理★:

温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完

全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到

最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下

实验内降。人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。

容pH值也会影响酶促反应速度。因为酶本身是蛋白质，pH不仅影响酶

蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物

的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pHo

不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如

唾液淀粉酶的最适pH值为6.8o

凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激活剂。例

如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。

凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质

称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度不同，可由水解混合物

遇碘显现的颜色不同来判断：

淀粉（蓝色）红色糊精（红色）无色糊精（不显色）麦芽糖（不显色）葡萄糖（不

显色）

二、实验步骤：

1.制备稀释50倍的唾液淀粉酶：用蒸镯水漱口清除食物残渣，再含一口

蒸储水一分钟

后使其流入量筒并稀释50倍，混匀备用。

2.温度对酶促反应速度影响实验

（1）取试管3支，编号，各管按下表依次加入各种试剂。

温度对酶促反应速度影响实验加样表

管号12

3

0.1%淀粉溶液（mL）1.51.5

1.5

稀释唾液（ml）11

1

煮沸唾液一一

1

摇匀

水浴温度37℃0℃

37℃

（2）水浴8min后，向各管中各滴加1滴KIT2溶液，混匀，观察各管颜

色并解释结果▲

3.pH对酶促反应速度的影响实验

（1）取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。

pH对酶促反应速度影响实验加样表

管号12

3

0.2%淀粉液（mL）22

2

PH5.0缓冲液（矶）3—

PH6.8缓冲液（mL）—3

PH8.0缓冲液（mL）——

3

稀释唾液酶（mL）22

2

（2）混匀后，将各管置于37℃水浴5分钟后，取2号管中混合液1滴于

点滴板上，加1滴KTT2溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄

色，则继续保温，然后每隔Imin继续取2号管的混合液1滴于点滴板上,

加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管内依次滴加2滴

KIT2溶液显色。观察各管颜色并解释结果

4.激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

(1)取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。

激活剂和抑制剂对能促反应速度影响实验加样表

管号123

4

0.1%淀粉液(mL)1.51.51.5

1.5

l%NaCl溶液(mL)2——

l%Na2s04溶液(mL)—2—

1%CUSO4溶液(mL)——2

—

蒸储水(mL)———

2

稀释唾液酶(mL)0.50.50.5

0.5

(2)混匀后，将各管置于37℃水浴8分钟后，取1号管中混合液1滴于

点滴板上，加1滴KI-12溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄

色，则继续保温，然后每隔Imin继续取1号管的混合液1滴于点滴板上，

加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管依次滴加1滴

KI-I2溶液显色。观察各管颜色并解释结果

教学过程中师生活动设计

随着淀粉水解，为什么与碘有颜色反应变化？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

1在作离子对醒活的影响时3.4号管有何作用？

2.在激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响实验中如何证明C1-是唾液淀

作业粉酶的激活剂？

3.酶的抑制剂与变性剂有何区别？

3.酶的抑制剂与变性剂有何区别？

[1]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

[2]《生物化学实验教程》，工金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

主要参

2010

考资料

[2]《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，

2010

1.对照实验要注意同步性；

总结分2、不同人的唾液淀粉酶活性不尽相同，让学生注意到样本差异；

析3.重点分析激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

3、重点分析激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响

《医学生物化学实验》教案

第7次课2学

时

实验项目Folin-酚试剂法测蛋白质浓度

综合性实验

实验性质

教学目的L学习会用Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的方法。

和要求2.巩固分光光度计的使用。

1、重点：分光光度计的使用

教学重点

2、难点：标准曲线的绘制

与难点

3、难点：标准曲线的绘制

试剂：标准蛋白溶液，Folin-酚试剂，样品液蛋白质

实验材料器材：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管

器材：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管

一、实验原理支

Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理与双缩胭方法是相同的，

只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提

身了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在

实验内容

碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成芨合物。Folin酚试剂中

的磷铝酸盐-磷鸨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产

生深兰色（钥兰和鸨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋

白的量成正比。

二、实验步骤上

1.曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其

余试管分成两组，分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升

标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后

每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合：于室温

（20〜25C）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin-酚

试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减

弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作

为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量

为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20^250微

克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸储水代替样品作为空白对

照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即

在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、

10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，

从而计算出样品溶液的蛋白质浓度

教学过程中师生活动设计

测定蛋白质浓度其他方法有哪些？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

作业简述Folin-酚试剂法比较其他蛋白质测定方法的优点。

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资料[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

1、强调Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理；

总结分析

2、巩固分光光度计的使用

《医学生物化学实验》教案

第8次课2学

时

实验项血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

基础性实验

实验性

质

教学目1.了解电泳技术的一般原理。

的和要2.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。

求

教学重重点：掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。

点与难难点：电泳技术的原理。

点难点：电泳技术的原理。

器材.：DYYTH6型常压电泳仪、醋酸纤维薄膜（2cmX8cm）、.培养皿、盖

玻片、滤纸、镜子。

1.试剂：

巴比妥缓冲液（川8.6,离子强度0・07）:巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,

实验材

用蒸储水定容至1000mL。

料

染色液：氨基黑10B0.25g,用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可

重复使用）。

3.漂洗液：甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL,混匀。

4.透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇7份，冰醋酸3,分，混匀。

一、实验原理★:

电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。

醋酸纤维薄膜电泳（CAME）是一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜

匕在pH8.6的缓冲液中电泳时，而清蛋白质均带负电荷移向正极.由于

血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形

实验内状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。

容影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强

度和电渗现象。

影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。

本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，它是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤

维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）

后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的

结构，厚度约为120um,有很强的通透性，对分子移动阻力很小。醋酸纤

维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现

象等优点。

本实验中用于电泳分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、。-球蛋白、P

-球蛋白、Y-球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质在电场中的迁移速度不

同。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中

清蛋白的泳动速度最快，其余依次为、。2-、B-与丫-球蛋白。

二、实验步骤：1）预处理；2）点样：3）电泳；4）染色；5）漂洗，吸干。

1.预处理：用镜子取醋酸纤维薄膜2张，识别出光泽面与粗糙面，将粗糙

面朝上放在电泳槽中的缓冲液中浸泡20mino

2.点样：事先月点样器在滤纸上点几个样，熟悉一下点样器的用法。然后

把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸内用手指快速捋一下，以吸干表面

多余的液体，随即将粗糙面朝上平铺在玻璃板上。注意，切勿将膜条长时

间放在滤纸上，以免膜条中的缓冲液过度吸出。用盖玻片蘸一点血清，使

血清均匀地分布在盖玻片切面。将盖玻片在膜条一端2〜3cm处轻轻地垂直落

下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品，每张膜点一个

样。（要求：轻、匀、直、细）

3.电泳：预先要在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，

做好滤纸桥。用锻子将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，要平直。膜条

光面朝上，点样端靠近负极、且悬空（可用锻子再将膜条两端压服帖一些）。

盖严电泳室，检查一下电泳槽和稳压电源是否已经连接好。通电，调节电

压至110V,电泳时间约为30min。

4.染色：电泳完毕后，关上电源开关，用银子将薄膜条取下并放在装有染

色液的培养皿中浸泡3~4min（注意盖好培养皿的盖子，以免溶剂挥发）。

5.漂洗：将膜条从染色液中取出，在培养皿的边缘上沥去表面多余的染

色液，依次放入装有漂洗液的培养皿（共有2套）中漂洗2次（未漂洗时

注意盖好培养皿的盖子，以免溶剂挥发），至色带清晰的电泳图谱。

三、分析结果▲:

实验采用小牛血清故出现三条色带：清蛋白；球蛋白；a2球蛋白，且

清蛋白颜色最深。

（本实验由于时间有限，授课时间安排首先由教师简单讲解实验步骤并向

学生演示操作方法后指导学生操作，在电泳的30min里教师给学生详尽讲

解实验原理，操作步骤与其注意事项。）

教学过程中师生活动设计

蛋白质颗粒为什么能电泳？依据什么性质？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

1.电泳时，醋酸纤维薄膜点样的一端应靠近哪一极？为什么？

作业2.血清醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带？

2.血清醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带？

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

料

L需要强调点样方法，避免点样过多，重复点样等；

总结分

2.重点讲解迁移速率的因素；

析

3、结合血清电泳在医学检验领域的应用，便于学生更好的理解

3.结合血清电泳在医学检验领域的应用，便于学生更好的理解

3、结合血清电泳在医学检验领域的应用，便于学生更好的理解

《医学生物化学实验》教案

第9次课2学

时

实验项血清ALT活性测定

目

综合性实验

实验性

质

教学目掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理、具体操作方法

的和要了解其临床意义。

求

教学重重点：血清谷丙转氨酶活性测定的原理

点与难难点：血清谷丙转氨酶活性测定的方法。

点难点：血清谷丙转氨酶活性测定的方法。

试剂：0.Imol/L磷酸盐缓冲溶液、0.4mol/L氢氧化钠溶液、lmol/L氢氧

实验材化钠溶液、ALT底物液、2,4-二硝基苯助溶液、丙酮酸标准液。

料材料：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管、容量瓶、量筒。

材料：分光光度计•、恒温水浴锅、试管、移液管、容量瓶、量筒。

实验内一、实验原理★:

容内酮酸可与2,4-二硝基苯月并在酸性溶液中反应形成相应的2,4-二硝基

苯腺，呈黄色，后者在碱性条件下呈红棕色。通过测定其在520nm波长处

的光吸收来了解丙酮酸的生成量，借此测定血清ALT的活力，故该类方

法又称比色测定法。该法虽然也有缺点，但操作简便，不需要特殊仪器和

试剂，故在临床上被广泛应用。

★该法的单位定义是：每1血，血清在PH7.4,37c保温条件下与底物作用

30分钟，每生成2.5ug丙酮酸为一个单位。人血清的丙氨酸氨基转移酶

正常值为2~40U。

二、实验步骤：

1.酶活反应体系的配制

试剂测定管测定对照管(2)标准管标准对照管

(1)(3)(4)

ALT底物(mL)0.50.50.5

37度保温5min(预热，可略)

血清(mL)0.20.2———

丙酮酸标液——0.2—

(200ug/ml)

磷酸buffer(mL)—————0.2

混匀，37度保温30min

2,4-二硝基苯骈0.50.50.50.5

(mL)

混匀，37度保温20min

ALT底物(mL)——0.50.50.5

0.4mol/Na0H(mL)5.05.05.05.0

2.反应后吸光值的读取▲

以dH2O为空白对照测四管的A值

3.酶活性的计算▲

公式：

教学过程中师生活动设计

什么是酶的比活力？

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

混浴各管后，为何要在lOmin后,30m"内测其吸光值?

作业

主要[1]《生物化学实验》，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，2013

参考资[2]《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

料

1、原理讲解要结合血清ALT活性测定在医学检验领域的应用；

总结分

2、整个实验过程中加样和操作过程需规范，否则数据差距较大；

析

3、帮助学生推导酶活性的计算公式

《医学生物化学实验》教案

第10次课2学

时

实验项维生素C含量测定

目

实验性基础性实验

质

教学目学习测定VC含量的原理和方法

的和要掌握微量滴定管使用方法

求

教学重重点：滴定操作

点与难难点：计算方法

点难点：计算方法

①试剂：辣椒匀浆（样品VC）、标准VC,2,6-二氯酚靛酚溶液。

实验材②器材.：容量瓶，微量滴定管、小三角瓶、1%草酸、2%草酸、移液管。

料②器材;容量瓶，微量滴定管、小三角瓶、1%草酸、2%草酸、移液管。

②器材：容量瓶，微量滴定管、小三角瓶、1%草酸、2%草酸、移液管。

一、实验原理★:

氧化型2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈粉红色，在中性或碱性溶液中呈

蓝色，还原型2,6-二氯酚靛酚无色。当用此染料滴定含有Vc的酸性溶

实验内液时，在Vc未全部氧化前，滴下的染料立即被还原成无色；一旦溶淀中

容的Vc全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液显示粉红色，此时即为滴

定终点，表示溶液中的Vc刚刚被氧化完全。因此，从滴定时2,6—二氯

酚靛酚标准液的消耗量，可以计算出被检物质中Vc的含量。

二、实验步骤：

1.辣椒匀浆的稀释

取辣椒匀浆7nL（计为5.0g）,装入小容量瓶，用2%草酸稀释定容至

50mL刻度线。

2.标准VC的滴定

吸取标准VC（0.lmg/mL）1.0ml置于锥形瓶中,加9mL1%草酸混匀,

用装有2,6-二氯酚靛酚的微量滴定管滴定至淡红色（保持5s不褪去）

为终点，记下所用体积V标

3.样品VC的滴定

从1中取10mL,放入锥形瓶，用2,6-二氯酚靛酚滴定，方法同上,

作两次平行实验。取消耗体积的平均值，记下体积V样

三、样品VC浓度的计算▲:

经草酸稀释后的辣椒匀浆中VC浓度为：

每100g纯辣椒中含VC的mg数为：

注意：整个实验要迅速，以防VC氧化。

教学过程中师生活动设计

VC作用与缺乏症

提纲、板书设计

原理与简要操作步骤

作业本实验中为何月草酸稀释VC,而不用纯水？

［1］《生物化学实验》，董晓燕主编，化学工业出版社，2010

主要参［2］《生物化学实验教程》，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社,

考资料2010

［2］《生物化学实验教程》，王金亭，