「1图1案例」Masson三色染色一次成功：避开实验雷区轻松做出漂亮切片

「1图1案例」Masson三色染色一次成功：避开实验雷区，轻松做出漂亮切片老板刚刚通知，贪吃的db/dbII型糖尿病小鼠模型就要来了，准备做Masson染色吧。可是上周不是说只做HE吗？唉，我还得查资料。db/db小鼠心肌细胞案例幸运女神总是会眷顾我的！南京医科大学季勇教授团队发表在ActaPharmacologicaSinica（IF7.169）期刊的文章正好采用Masson三色染色检查司美格鲁肽的抗纤维化作用，用到的动物模型也刚好是db/db小鼠。结果显示，与野生型（WT）小鼠的心肌组织相比，db/db小鼠心肌组织中的蓝色胶原沉淀大量增加，胶原容积分数（CVF）显著升高。而司美格鲁肽干预后，胶原沉积减少，胶原容积分数显著降低。图片源自文献：Semaglutideadministrationprotectscardiomyocytesindb/dbmiceviaenergeticimprovementandmitochondrialqualitycontrol.Doi:10.1038/s41401-024-01448-9从图中，我们可以看出Masson不仅能直观的显示心肌纤维的变化情况，还能进行定量统计分析，以及结合I型胶原（ColI）和III型胶原（ColIII）的mRNA表达结果，证实司美格鲁肽可显著缓解db/db小鼠的心肌纤维化。我的研究材料和目的跟这篇文章的非常相近，正好可以借用他们的研究思路。接下来就是落实Masson染色技术的操作步骤了。通过这张Masson三色染色操作示意图，我们可以看出，高质量的切片需要做到：

切片厚度适中一般为3-5μm。切片太厚的话会造成颜色重叠，组织结构难以区分。如果太薄则染色浅，甚至容易碎裂。

分化时间要灵活盐酸酒精分化、磷钼酸分色的时间需要根据实验室自身环境进行调整，不用太死板，必要的时候可以在显微镜下观察。

注意试剂有效期注意试剂有效期：铁苏木素、丽春红、苯胺蓝这些试剂在使用时要先观察是否氧化、失效。如果出现沉淀、变色、分层等情况，建议换新的染色，避免导致染色失败。

对照设置要合理对照类型作用设置频率阳性对照已知纤维化组织，如肝硬化、瘢痕每批次都需要设阴性对照正常肝、肾组织每批次都需要设试剂对照省略磷钼酸或苯胺蓝新批次试剂验证时在完成对Masson实验操作的学习后，我顺便查了查三色染色常踩的雷有哪些，做到有备无患。

胶原纤维呈红色或紫红色，而非蓝色建议按照下表逐项进行核查。

肌纤维呈蓝紫色或蓝灰色，而非红色出现这种情况，我们也要排出个优先级。首要原因是磷钼酸过度分化。其处理时间超过15min或浓度过高（>2%）时，会将肌纤维上的丽春红洗脱掉，与后续的苯胺蓝发生结合。因此，我们在进行实验时，要严格控制时间。如果在常规时间还会出现蓝紫色，建议我们缩短磷钼酸分化时间（5-10min），或将其浓度降到1%甚至0.5%。丽春红染色时间不足或染液失效，红色信号本身不饱和，也会出现这种情况。建议我们延长丽春红染色至15min，或重新配制染液。还有一种情况是苯胺蓝染色过度，可以尝试缩短其浸泡时间。

细胞核染色模糊或褪色细胞核染色不正常，我们首先要考虑Weigert铁苏木素是不是老化或失效了。Weigert铁苏木素A、B液需要现配现用，混合后24小时内用完。如果试剂没有问题，我们可以适当延长5min或者重复染一次看看效果。我们还要注意盐酸酒精分化和返蓝时间。

背景弥漫性蓝染或红染苯胺蓝浓度过高或冰醋酸洗涤不充分会造成切片背景蓝染。建议我们将苯胺蓝浓度降至1%或者延长冰醋酸洗涤时间。丽春红染色后充分去除浮色或磷钼酸分化不够，将会造成切片背景红染，建议我们增加蒸馏水快速冲洗步骤。

切片局部或整体不着色可能原因解决方案脱蜡不彻底延长二甲苯脱蜡时间，或更换新鲜二甲苯染液覆盖不均滴加染液时确保完全覆盖组织，可用枪头轻轻吹匀切片局部干燥整个染色过程中保持切片湿润，各步骤间过渡要迅速组织固定不佳固定液选择10%中性福尔马林，固定时间12-24小时染料滴加顺序错误严格按操作步骤的顺序执行，并做好标记

切片脱落或组织脱落这是一个老生常谈的话题，我们应该不会再出现这种情况了吧？我们可以使用黏附玻片、充分烤片、控制厚度等使切片牢牢黏贴。在染色过程中，我们也要小心操作，比如将水流调至细流，避免直接冲击组织。通过查阅文献、搜集案例和避坑指南，我总算把Masson三色染色的实验思路、操作步骤整理清晰，接下来就是“甩开膀子加油干”了。通过回顾上述常见问题，我们在实操时，要注意试剂的状态、关键步骤的时间以及实验室环境温度。只有我们