生物工程实验指导-课件 02-生物化学实验(上)

生物化学实验(上)实验一

碱性磷酸酶的提纯实验二

碱性磷酸酶的比活性测定实验三

食用菌多糖的制备与含量测定实验四

游离氨基酸的测定———甲醛滴定法实验五

柱层析法分离蛋白质混合物———葡聚糖凝胶层析实验六

蛋白质定量测定———考马斯亮蓝染色法实验七

索氏抽提法测定粗脂肪含量实验八

可溶性糖含量的测定———蒽酮法实验一

碱性磷酸酶的提纯1实验目的学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤,掌握制备碱性磷酸酶(AKP)的操作技术,了解碱性磷酸酶的催化特性。2实验原理本实验采用有机溶剂分段沉淀法从肝匀浆液中分离AKP。利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂降低酶的溶解度,使酶蛋白沉淀析出。有机溶剂能降低溶液的介电常数,从而增加不同电荷的引力,导致溶解度的降低。此外,有机溶剂可与水作用,能破坏蛋白质的水化膜。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异进行分离的方法,称为有机溶剂分段沉淀法。在制备肝匀浆时,采用低浓度醋酸钠可以达到低渗破膜的作用,而醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用。匀浆液中加入正丁醇能使部分杂蛋白变性,再通过过滤,可以除去变性杂蛋白。含有AKP的滤液可进一步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。根据AKP在终浓度33%的丙酮或终浓度30%的乙醇中是溶解的,而在终浓度50%的丙酮或终浓度60%的乙醇中是不溶解的性质,采用离心的方法分离提取,可使AKP得到部分纯化。3实验材料及设备3.1实验材料新鲜猪肝。3.2仪器设备高速冷冻离心机及配套离心管(10mL)、剪刀、玻璃匀浆器(20mL)、试剂瓶(100mL,250mL,500mL棕色瓶)、容量瓶(100mL,250mL,1000mL,500mL)、刻度试管(10mL)、普通试管(20mL)、小漏斗、玻璃棒、移液管(5mL,2mL)、量筒(100mL)、滤纸、试管架、pH试纸(pH=8.8)。3.3试剂及其配制方法①0.5mol/L醋酸镁溶液:称取醋酸镁(相对分子质量214.45)10.723g,溶于蒸馏水中,定容至100mL,倒入试剂瓶备用。②0.1mol/L醋酸钠溶液:称取醋酸钠(相对分子质量82.03)0.82g,溶于蒸馏水中,定容至100mL,倒入试剂瓶备用。③0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液:量取0.5mol/L醋酸镁5mL,0.1mol/L醋酸钠25mL,混合后加蒸馏水稀释至250mL,倒入试剂瓶备用。④正丁醇。⑤丙酮(分析纯)。⑥95%乙醇(分析纯)。⑦生理盐水:称取4.5g氯化钠,溶于蒸馏水中,定容至500mL,倒入试剂瓶备用。⑧Tris缓冲液(pH=8.8):称取Tris0.605g,用蒸馏水溶解,定容至50mL,配成0.1mol/LTris液。取0.1mol/LTris液50mL,加入0.1mol/L醋酸钠50mL和蒸馏水350mL,再用1%醋酸调节pH至8.8,最后用蒸馏水定容至500mL,倒入试剂瓶备用。4实验步骤加95%乙醇至30%:0.95X=(X+V)0.3加95%乙醇至60%:0.3V+0.95X=(X+V)0.6式中

X———加入乙醇的体积,mL;V———溶液原体积,mL。新鲜猪肝2g(6mL醋酸镁/醋酸钠匀浆,标记为A,记录体积)5思考题①阐述有机溶剂分段沉淀蛋白质的原理。②在制备肝匀浆时采用低浓度醋酸钠的目的是什么?③在制备肝匀浆时采用低浓度醋酸镁的目的是什么?实验二

碱性磷酸酶的比活性测定1实验目的掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤,掌握碱性磷酸酶的比活性测定的原理和操作步骤,掌握比活性的计算方法及评价。(1)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量原理考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)是一种双色型蛋白质染料,其游离态呈红棕色,最大吸收峰为465nm。在酸性环境下,CBBG-250可与蛋白质结合,结合态的CBBG-250呈蓝色,最大吸收峰移至595nm。在一定条件下,595nm处的吸光度增加与蛋白质含量成正比。染料与蛋白质能迅速结合,2min内达到平衡,并在1h内保持稳定状态。(2)碱性磷酸酶活性测定原理在一定的pH和温度下,待测液中的碱性磷酸酶作用于基质液中的磷酸苯二钠,使其水解并释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用,并经铁氰化钾氧化,生成红色醌类化合物。以酚作为标准液进行显色比色,可以测定酚的生成量,从而计算酶的活性单位。本法以37℃、15min内生成1mg酚所需的酶量为一个活性单位。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料实验提纯的碱性磷酸酶。3.2仪器设备分光光度计、配套比色皿4个、擦镜纸1本、恒温水浴箱。3.3试剂及其配制方法①CBBG-250溶液:称取50mgCBBG-250,溶于25mL95%乙醇中,加入85%磷酸50mL,用蒸馏水定容至500mL。②0.25mg/mL蛋白质标准溶液:称取小牛血清白蛋白25mg,溶于生理盐水中,定容至100mL。③0.1mol/L碳酸盐缓冲液(37℃时):称取无水碳酸钠1.575g和碳酸氢钠0.84g溶解于蒸馏水中,定容至250mL。④复合基质液:称取二水合磷酸苯二钠1.5g和4-氨基安替比林0.75g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中。两液混合并稀释至250mL,加入1mL氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可使用一周。临用时将此液与等量0.1mol/L碳酸盐缓冲液混合,放入试剂瓶中备用。⑤0.1mg/mL酚标准液:称取100mg苯酚,溶于100mL去离子水中,再稀释至1L。⑥0.5%铁氰化钾溶液:称取铁氰化钾2.5g和硼酸0.75g,分别溶于200mL蒸馏水中。溶解后两液混合,再加蒸馏水至500mL,置于棕色瓶中,暗处保存。⑦pH=8.8的Tris缓冲液:配制方法同“实验一”。4实验步骤(1)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量步骤按表2-1加入试剂,充分混匀。5min后用595nm波长比色,以空白管调零,读取标准管及样品管的吸光度(A)。4实验步骤(2)碱性磷酸酶活性测定步骤按表2-2加入试剂,加入复合基质液后立即混匀。将反应管放入37℃水浴中,准确保温15min,取出各管,立即加入2mL铁氰化钾(终止反应,氧化反应),立即摇匀。放置10min,用510nm波长比色,读取各管的吸光度,计算每毫升酶液中的酶活性单位。按表2-3计算并分析实验结果。5结果与分析

注:比活性=酶浓度/蛋白质浓度纯化倍数=各阶段比活性/A液比活性得率=各阶段总活性/A液总活性×100%①考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么?②测定碱性磷酸酶活性的原理是什么?③测定酶比活性的意义是什么?6思考题实验三

食用菌多糖的制备与含量测定1实验目的掌握食用菌多糖的制备原理与操作步骤,掌握多糖含量测定的原理与操作步骤。2实验原理多糖是极性大分子化合物,易溶于水,而不溶于乙醇,基于此特性,本实验采用水提醇沉法。多糖在硫酸作用下,先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物。糖醛衍生物与苯酚反应生成橙黄色溶液,在490nm处有特征吸收,与标准系列比较定量。3实验材料及设备3.1实验材料新鲜香菇。3.2仪器设备恒温水浴锅,真空抽滤器,分光光度计、配套比色皿、擦镜纸、研钵、普通试管(20mL)、移液管(2mL)、容量瓶(100mL)、试剂瓶(100mL,250mL)。3.3试剂及其配制方法①80%苯酚溶液:称取80g苯酚,加20mL水使之完全溶解,置于冰箱中避光长期贮存。②6%苯酚溶液:临用前用80%苯酚溶液稀释至所需浓度,然后倒入试剂瓶备用。③标准糖溶液:精确称取分析纯恒重葡萄糖50mg,加水溶解后定容至250mL,配制成0.2mg/mL标准糖溶液,倒入试剂瓶备用。④95%或无水乙醇、氯仿、正丁醇、甲醇。4实验步骤(1)香菇多糖的提取①材料预处理称量鲜香菇10克,剪碎后放入研钵中捣碎。②提取将捣碎的香菇置于小烧杯中,边搅拌边加入60mL去离子水,充分混匀,加热至90℃,恒温水浴箱保温60min,同时用玻璃棒搅拌。降温后用四层纱布过滤(或用真空抽滤器过滤),收集滤液。(注:若滤液过多可以继续水浴加热浓缩,将体积控制在10mL左右)。③乙醇沉淀将浓缩液倒入烧杯中,边搅拌边加入1倍体积的乙醇(95%或者无水乙醇),静置1~2h,过滤收集沉淀,滤液再加3倍量乙醇,过滤(或真空抽滤),合并2次沉淀。④除蛋白沉淀分别用少量氯仿(5mL左右)、正丁醇(5mL左右)分别洗涤一次。(注:可将沉淀置于培养皿中洗涤,洗涤后用镊子取出。)⑤除杂质沉淀再依次用少量甲醇(5mL左右)、乙醚(5mL左右)分别洗涤一次,收集沉淀。(2)香菇多糖的含量测定①标准曲线制作取5支试管,分别加入标准糖溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6mL,各以水补足至2.0mL,然后加入6%苯酚1.0mL,摇匀,加入浓硫酸5.0mL,摇匀,室温放置20min,使用分光光度计在490nm波长处用比色法测量吸光度。以糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。②

样品测定取提取的香菇多糖,加入少量热水溶解后定容至50mL,精密量取1.0mL,按标准曲线制作的方法操作,使用分光光度计测490nm波长处的吸光度,从标准曲线计算多糖含量。(注:制作标准曲线宜用相应的标准多糖,如用葡萄糖制作标准曲线应以校正系数0.9校正糖的微克数。)5结果与分析6思考题①多糖提取的原理?②多糖含量测定的原理?实验四

游离氨基酸的测定

———甲醛滴定法1实验目的掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作步骤。2实验原理

3实验材料及设备3.1实验材料0.1mol/L标准甘氨酸溶液:准确称取750.7mg甘氨酸,溶解后定容至100mL。3.2仪器设备25mL锥形瓶、3mL微量滴定管、刻度吸管(10mL)、试剂瓶(100mL)。3.3试剂①0.1mol/L标准氢氧化钠溶液:应在使用前标定,并在密闭瓶中保存,不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。②酚酞指示剂(含0.5%酚酞的50%乙醇溶液):称取0.5克酚酞溶于100mL50%乙醇溶液。③甲醛溶液:在50mL36%~37%分析纯甲醛溶液中加入1mL0.1%酚酞乙醇水溶液,用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红,贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间,则使用前需重新中和。4实验步骤(1)取3个25mL的锥形瓶,分别编号为1、2、3。向1号、2号瓶内各加入2mL0.1mol/L的标准甘氨酸溶液和5mL水,混匀。向3号瓶内加入7mL水。然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2mL甲醛溶液,再混匀。分别用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验2次,记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的体积(mL)。取平均值,计算甘氨酸氨基氮的回收率。式(2-2)中实际测得量:为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积(mL)的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积(mL)之差,乘以标准氢氧化钠的物质的量浓度,再乘以14.007(氮的相对原子质量)。式(2-2)中加入理论量:2mL乘以标准甘氨酸的物质的量浓度再乘以14.007,即为加入理论量的质量(mg)。(2)取未知浓度的甘氨酸溶液2mL,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。

5结果与分析①甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理?②为什么选用酚酞指示剂滴定氨基酸?实验五

柱层析法分离蛋白质混合物———葡聚糖凝胶层析1实验目的掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的基本原理,学习葡聚糖凝胶层析的基本操作过程。2实验原理凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术。这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒,目前应用比较广泛的是:具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)。葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯-1,2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制:交联度越大,网孔结构越紧密;交联度越小,网孔结构就越疏松。网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百(Da)到几十万(Da)不等。葡聚糖凝胶层析是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱,由于各组分分子量不同,在凝胶柱上受到的阻滞作用不同,因此在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质由于完全被凝胶排阻而不能进入凝胶颗粒内部,其受到的阻滞作用较小,因此随着溶剂在凝胶颗粒之间流动,流程较短,从而先流出层析柱;分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内,受到阻滞作用较大,流程较长,因此最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间,则在两者之间从柱中流出,由此就可以达到分离目的。本实验以葡聚糖凝胶G-25作为固定相载体,来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖-2000分子量接近2×106Da,而溴酚蓝分子量为670Da,二者分子量相差较大,前者完全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开。3实验材料及设备3.1实验材料葡聚糖凝胶G-25(Sephadex-G-25)3.2仪器设备层析柱(1cm×20cm,附有一小段乳胶管及螺旋夹)、洗脱液瓶(带下口的三角瓶,250mL)、试管及试管架、量筒10mL、分光光度计。3.3试剂及其配制方法①Tris-醋酸缓冲液(pH=7.0):取0.01mol/LTris溶液(含0.1mol/LKCl)900mL,用浓醋酸调pH至7.0,加蒸馏水至1000mL。②溴酚蓝溶液:称取溴酚蓝10mg,溶于5mL乙醇中,充分搅拌使其溶解,然后逐滴加入Tris-醋酸缓冲液(pH=7.0)至溶液呈深蓝色。③蓝色葡聚糖-2000溶液:称取蓝色葡聚糖-2000粉末10mg,溶于2mLTris-醋酸缓冲液(pH=7.0)中即成。④样品溶液:取溴酚蓝溶液0.1mL,蓝色葡聚糖-2000溶液0.5mL混匀后为上柱样品溶液。4实验步骤(1)实验凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒,使用时需经溶胀处理。称取4g葡聚糖凝胶G-25,加50mL蒸馏水,搅拌均匀,在室温溶胀6h,或沸水浴溶胀2h,一般采用第二种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒,用蒸馏水反复洗涤几次,再以缓冲溶液(pH=7.0Tris-醋酸缓冲液)洗涤2~3次,使pH和离子强度达到平衡,最后抽去溶液及凝胶颗粒内部的气泡,凝胶可保存在缓冲液内。(2)装柱将层析柱洗净,垂直固定在铁支架上,选择有薄膜端作为层析柱下口,将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液,打开下口螺旋夹,让溶液流出,排除残留气泡,最后保留约2cm高度的洗脱液,拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀,用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中,待凝胶沉积到柱床下超过1cm时,打开下口螺旋夹,继续装柱至柱床高度达到8cm,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡,尽可能一次装完,避免出现分层。再用洗脱液平衡1至2个柱床体积,始终保持凝胶面上有一定的洗脱液。平衡后,拧紧下端螺旋夹。(3)加样品打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出,直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口。取溴酚蓝和蓝色葡聚糖-2000混合液0.3mL,小心地加于凝胶表面,切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时,关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区,共洗涤3次。每次等洗脱液完全进入凝胶柱后,再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液,保持高度为3~4cm。4实验步骤(4)洗脱与收集连接好凝胶柱层析系统,调节洗脱液流速为1mL/min,进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象。收集洗脱液,每收集3mL即换一支收集管(试管预先编号),收集约20管左右,样品即可完全被洗脱下来。分别用分光光度计在波长540nm处测定各收集管中洗脱液的吸光度。(5)凝胶回收将样品完全洗脱下来后,继续用3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶。然后,将柱下口放在小烧杯中,慢慢打开,再将上口慢慢松开,使凝胶全部回收至小烧杯中,备用。5结果与分析6思考题①葡聚糖凝胶层析分离样品的原理是什么?②葡聚糖凝胶层析操作时应注意哪些问题?以洗脱管号为横坐标,以吸光度为纵坐标作图即得洗脱曲线。分析曲线图并讨论实验结果。实验六

蛋白质定量测定

———考马斯亮蓝染色法1实验目的掌握考马斯亮蓝染色法进行蛋白质定量测定的原理和操作步骤。2实验原理考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质发生疏水作用后,会变成蓝色,最大吸收波长从465nm转移到595nm处。在一定的范围内,蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。3实验材料及设备3.1实验材料样品蛋白质:准确吸取0.1mL血清(或牛奶),置于50mL容量瓶中,用生理盐水稀释至50mL刻度(此为稀释500倍,其他蛋白样品酌情而定)。3.2仪器设备普通试管(5mL)、刻度吸管(1mL,5mL)、分光光度计。3.3试剂及其配制方法①考马斯亮蓝G-250染色液:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL95%的乙醇中,在上述混合液中加入100mL85%的磷酸,加水稀释至1L。②蛋白质标准液(0.5mg/mL):准确称取50mg牛血清白蛋白,放在100mL容量瓶中,向容量瓶中加生理盐水至100mL刻度处,混匀,放置于-20℃冰箱保存。4实验步骤取7支试管,按表2-4中的剂量在试管中加入试剂,每支试管在加入3mL染色液后,混匀,室温放置15min,用分光光度计在595nm波长处进行比色操作,读出吸光度。(注:高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮等对测定有干扰;显色结果受时间与温度的影响较大,必须确保样品蛋白质与蛋白质标准液的测定控制在同一条件下进行。)5结果与分析6思考题①考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理是什么?②本实验的注意事项有哪些?以各试管的标准蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线,再计算样品蛋白质含量,见表2-4。5结果与分析6思考题①考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理是什么?②本实验的注意事项有哪些?以各试管的标准蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线,再计算样品蛋白质含量,见表2-4。实验七

索氏抽提法测定粗脂肪含量1实验目的掌握索氏抽提法测定粗脂肪的原理与方法,掌握索氏抽提法基本操作要点及影响因素。2实验原理利用脂肪能溶于有机溶剂的性质,在索氏提取器中用无水乙醚或石油醚等溶剂对样品进行反复萃取,提取样品中的脂肪。蒸去溶剂后,所得物质即为脂肪,也称粗脂肪。3实验材料及设备3.1实验材料花生。3.2仪器设备索氏提取器、电热恒温鼓风干燥箱、干燥器、恒温水浴箱、滤纸筒。3.3试剂无水乙醚(不含过氧化物)或石油醚(沸程30~60℃)。4实验步骤(1)样品处理固体样品:准确称取均匀样品2~5g(精确至0.01mg),装入滤纸筒内。液体或半固体样品:准确称取均匀样品5~10g(精确至0.01mg),置于蒸发皿中,加入海砂约20g,搅匀后置于沸水浴上蒸干,然后在95~105℃下干燥。研细后全部转入滤纸筒内,用蘸有乙醚的脱脂棉擦净所用器皿,并将棉花也放入滤纸筒内。(2)索氏提取器的清洗将索氏提取器各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干。脂肪烧瓶在(103±2)℃的烘箱内干燥至恒重(前后两次称量差不超过2mg)(3)样品测定①将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内,连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶,由抽提器冷凝管上端加入乙醚或石油醚至瓶内容积的2/3处,通入冷凝水,将底瓶浸没在水浴中加热,用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口。②抽提温度的控制:水浴温度应控制在使提取液在每6~8min回流一次为宜。③抽提时间的控制:抽提时间视试样中粗脂肪含量而定,一般样品抽提6~12h,坚果样品抽提约16h。抽提结束时,用毛玻璃板接取一滴提取液,如无油斑则表明提取完毕。④提取完毕:取下脂肪烧瓶,回收乙醚或石油醚。待烧瓶内乙醚仅剩下1~2mL时,在。水浴上赶尽残留的溶剂,于95~105℃下干燥2h后,置于干燥器中冷却至室温,称量。继续干燥30min后冷却称量,反复干燥至恒重(前后两次称量差不超过2mg)。※注意事项:①抽提剂乙醚是易燃、易爆物质,应注意通风并且不能有火源。②样品滤纸筒的高度不能超过虹吸管,否则上部脂肪不能提尽而造成误差。③样品和乙醚浸出物在烘箱中干燥时,时间不能过长,以防止极不饱和的脂肪酸受热氧化而增加质量。④脂肪烧瓶在烘箱中干燥时,瓶口侧放,以利空气流通。而且先不要关上烘箱门,在90℃以下鼓风干燥10~20min,驱尽残余溶剂后再将烘箱门关紧,升至所需温度。⑤乙醚若放置时间过长,会产生过氧化物。过氧化物不稳定,当蒸馏或干燥时会发生爆炸,故使用前应严格检查,并采用适当方法除去过氧化物。⑥反复加热可能导致脂类氧化而增重,若出现质量增加的情况,应以增重前的质量作为恒重。5结果与分析(1)数据记录将实验数据记录在表2-5中。(2)计算公式式中

X———样品中粗脂肪的质量分数,%;m———样品的质量,g;m0———