生物工程实验指导-课件 03-生物化学实验(下)

生物化学实验(下)实验一

脂肪转化成糖的定性实验实验二

糖酵解中间产物的鉴定实验三

肌糖原的酵解作用实验四

脂肪酸的β-氧化作用实验五

氨基转换作用的测定(分光光度法)实验六

饱食、饥饿和激素对肝糖原的影响实验七

植物体内的转氨基作用实验八

二乙酰-肟法测定血清尿素氮实验一

脂肪转化成糖的定性实验1实验目的学习和了解生物体内脂肪转化为糖的过程、检验方法和生理意义。2实验原理糖代谢和脂肪代谢是相互联系的,它们可以互相转化。例如种子发芽时,脂肪会转化为糖,然后进一步转化为中间代谢物或释放能量,以满足生命活动的需求。本实验以休眠的花生种子和花生的黄化幼苗为材料,定性地观察花生种子内大量贮存的脂肪转化为黄化幼苗中还原糖的现象。碘试剂反应:花生种子遇碘呈现蓝色反应,而子叶无蓝色反应,其余部分略有浅蓝色反应。这表明花生种子是油料作物种子,仅含有少量淀粉。种子萌发后不久,淀粉迅速被消耗,因此黄化幼苗的子叶无蓝色反应。然而,黄化幼苗的其余部分属于生长器官,会合成少量新淀粉。费林试剂反应:花生种子遇费林试剂无黄色反应;幼苗的子叶有浅黄色反应,但无沉淀生成;其余部分有黄色反应,并有红色沉淀生成。结果表明,花生种子体内不存在还原糖,而黄化幼苗的子叶内有少量还原糖,生长器官内含有大量还原糖。这证实了黄化幼苗子叶内的脂肪可以转化为还原糖,并且还原糖一经产生便作为运输物质被迅速运出。因此根茎中的主要运输物质是还原糖。3实验材料及设备3.1实验材料花生、花生的黄化苗(25℃暗室培养8d)。3.2仪器设备试管及试管架、试管夹、研钵、白瓷板、烧杯(100mL)、小漏斗、刻度吸管、刻度吸管架、量筒、水浴锅、铁三脚架、石棉网。3.3试剂及其配制方法①费林试剂:试剂A(硫酸铜溶液):将34.5g结晶硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶于500mL蒸馏水中,加入0.5mL浓硫酸,混匀。试剂B(酒石酸钾钠碱性溶液):将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中,贮藏于带橡皮塞的瓶内。用时将试剂A和试剂B等量混合,现用现配。②碘化钾-碘溶液(碘试剂):将20g碘化钾和10g碘溶于100mL水中。使用前需稀释10倍。4实验步骤(1)花生种子的检测取5粒花生,剥去外壳,放在研钵中碾碎成匀浆。取少量匀浆放在白瓷板上,加1滴碘化钾-碘溶液,观察有无蓝色产生。(2)花生种子提取液的检测将剩下的匀浆放在小烧杯中,加入50mL蒸馏水,直接加热煮至沸腾,过滤。取1支试管,加入1mL滤液和2mL费林试剂,混匀,在沸水中煮2~3min,观察是否出现红色沉淀。(3)黄化幼苗的检测另取5棵黄化幼苗,将黄化幼苗分为子叶(贮藏器官)和其余部分(除子叶以外的所有生长器官),按上述方法分别碾碎,取少许用于碘化钾-碘溶液检查,余下的用蒸馏水进行热提取,滤液与费林试剂反应(操作同上),观察有无红色沉淀生成。5结果与分析解释各步骤现象产生的原因。6思考题①通过实验观察到蓖麻或花生种子萌发时,种子中的脂肪能够转化为糖,试写出它们可能的转化途径。这种转化作用是否具有普遍意义?②简述生物体内糖代谢和脂肪代谢的关系。实验二

糖酵解中间产物的鉴定1实验目的(1)通过本实验对糖酵解过程进一步加深理解。(2)初步了解碘乙酸等酶抑制剂对巯基酶的抑制作用。(3)通过使用碘乙酸酶和硫酸肼抑制特定酶活性,可以研究中间代谢产物堆积的方法及其在代谢途径分析中的重要意义。在细胞质中,一分子葡萄糖通过一系列反应转化为两分子丙酮酸,并伴随着ATP的生成。这一过程是有机体获得化学能的最原始途径,也是原核生物和真核生物糖类物质分解代谢的共同途径。利用碘乙酸等酶抑制剂(如碘乙酸、重金属离子、烷化剂等)对糖酵解过程中的3-磷酸甘油醛脱氢酶进行特异性不可逆抑制,使3-磷酸甘油醛无法继续代谢而积累。硫酸肼作为稳定剂,用于结合并保护3-磷酸甘油醛,防止其降解。随后,2,4-二硝基苯肼与3-磷酸甘油醛在碱性条件反应,生成2,4-二硝基苯腙丙醛的棕色复合物。该棕色复合物的颜色深浅与3-磷酸甘油醛的含量成正比。从而证明糖酵解途径中存在以3-磷酸甘油醛为中间产物的代谢过程。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料新鲜干酵母。3.2仪器设备试管(或发酵管)、移液管(1mL,2mL,10mL)、恒温水浴锅、漏斗、滤纸。3.3试剂及其配制方法①2,4-二硝基苯肼溶液:取0.1g2,4-二硝基苯肼,溶于100mL2mol/L盐酸中,贮存于棕色瓶中备用。②0.56mol/L硫酸肼溶液:称取7.28g硫酸肼,溶于50mL水中。此时硫酸肼不会完全溶解。当加入NaOH调节pH至7.4时,硫酸肼完全溶解。此溶液也可用于水合肼溶液的配制。将其稀释至0.56mol/L的分子浓度,此时溶液呈碱性,可用浓硫酸调节pH至7.4。③5%葡萄糖溶液:将50g葡萄糖溶于1L水中。④10%三氯乙酸溶液:将100g三氯乙酸溶于1L水中。⑤0.75mol/LNaOH溶液:将30g氢氧化钠固体溶于1L水中。⑥0.002mol/L碘乙酸溶液:将0.372g碘乙酸溶于1L水中。⑦0.001mol/L硫酸银溶液:将0.332g硫酸银溶于1L水中。4实验步骤(1)取3支干燥试管(或发酵管),编号,分别加入新鲜酵母0.3g,并按表3-1分别加入各试剂,混匀。(2)将各试管置于37℃水浴保温10min,观察发酵管产生气泡的量有何不同(拍照记录)。(3)取出试管,并在2号和3号试管中按表3-2补加各试剂,摇匀。静置2min后,将2号和3号试管中的内容物与1号试管中的内容物一起过滤。过滤前用蒸馏水润湿滤纸。(4)取3支试管,分别加入步骤(3)所得滤液0.5mL,并按表3-3加入试剂、处理、记录结果。5结果与分析6思考题实验中哪一支试管生成的气泡最多?哪一支试管最后生成的颜色最深?为什么?实验三

肌糖原的酵解作用1实验目的学习检定糖酵解作用的原理和方法,了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。肌糖原的酵解作用,即肌糖原在缺氧条件下,经过一系列的酶促反应,最终转变为乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖原首先与磷酸化合,经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物,最后生成乳酸。肌糖原的酵解作用是糖类供给组织能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量,而供氧不足(如剧烈运动)时,糖原的酵解作用可以暂时满足能量消耗的需求。一般用肌肉糜或肌肉提取液作为糖原酵解实验的材料。使用肌肉糜时,实验必须在无氧条件下进行;使用肌肉提取液时,则可在有氧条件下进行。这是因为催化酵解作用的酶全部存在于肌肉提取液中,而三羧酸循环和呼吸链的酶系统则集中在线粒体中。糖原可以用淀粉代替。本实验可以通过乳酸的生成来检查糖原或淀粉的酵解作用。但糖类和蛋白质会干扰乳酸的测定。在除去蛋白质与糖原后,乳酸可与硫酸共热产生乙醛,后者再与对羟基联苯反应生成紫红色物质,根据颜色的显现加以鉴定。该法比较灵敏,每毫升溶液含1~5μg乳酸即可产生明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在,则会严重干扰测定结果,因此实验中应尽量除去这些杂质。此外,测定时所用的仪器应严格洗涤干净。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料兔子。3.2仪器设备恒温水浴锅、天平、乳钵试管及试管架、移液管(0.5mL,1mL,2mL,5mL)、滴定管、玻璃棒、剪刀、镊子、漏斗、冰浴装置、滤纸等。3.3试剂及其配制方法①0.5%糖原或淀粉溶液、15%偏磷酸溶液(或20%三氯乙酸溶液)、液体石蜡、氢氧化钙粉末、浓硫酸、饱和硫酸铜溶液。②1.5%对羟基联苯试剂:取对羟基联苯1.5g,溶于100mL0.5%NaOH溶液中。③1/15mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)。A液(1/15mol/L磷酸二氢钾溶液):取9.078g磷酸二氢钾,溶解并定容至1000mL。B液(1/15mol/L磷酸氢二钠溶液):取11.876g磷酸氢二钠,溶解并定容至1000mL。将A液与B液按体积比为1∶4混合。4实验步骤4.1处死动物和制备肌肉糜(1)处死动物的方法研究机体的新陈代谢时,首先要注意使所测得的结果尽量符合活机体的真实情况。处死动物的方法与获得真实情况有直接关系。实验中处死动物的方法有很多种,下面是几种常用方法:①液氮固定:液氮的沸点是-193℃,可以极迅速地将动物冰冻固定,将处于各种机能状态的机体代谢过程在十几秒内固定于某一阶段。实验时,先用小杜瓦瓶或带有隔热设备的硬质烧杯盛取液氮,另将动物(如大白鼠)放到大烧杯或小玻璃缸中,再倒入液氮,动物因体温骤降而死亡,机体中的各个酶系及生化成分均被固定,保持其在受冷前的天然状态。随后,将动物取出,使其体温逐渐回升,这时动物由僵硬变脆。此时,用一把锋利的刀架在动物身体上,用铁锤击刀,将动物劈开后,切取肌肉,再将肌肉硬块放入乳钵中,研成细粉备用。②注入空气:取家免,于兔耳上找到较粗的静脉血管,将注射器针头插入静脉中,注入空气。动物在1~2min内死亡。③击毙:用铁锤敲击动物头部,动物立即死去。④斩头:用一把锋利的大剪刀,在动物颈下张开,左手抚摸动物使其处于自然状态,右手突然用力猛剪,使动物断头而死去。此法适用于体形较小的动物,如大白鼠及小白鼠。(2)制备肌肉糜将动物(鼠或兔)杀死后放血,立即取背部和腿部肌肉。在低温条件下用剪刀尽量将肌肉剪碎,适当研磨,制成肌肉糜,低温保存备用。肌肉糜应在临用前制备。4实验步骤4.2肌肉糜的糖酵解(1)取4支已编号的试管,各加入3mLpH为7.4的磷酸缓冲液和1mL0.5%淀粉溶液。1号、2号试管为实验管,3号、4号试管为对照管。向对照管内加入2mL15%偏磷酸溶液(20%三氯乙酸溶液),以沉淀蛋白质并终止酶的反应。然后向每支试管内加入新鲜的肌肉糜0.5g,用玻璃棒将肌肉碎块打散,搅匀,再分别加入1mL液体石蜡,以隔绝空气。将4支试管同时放入37℃恒温水浴锅中保温。(2)1h后取出试管,吸出石蜡,立即向试管内加入2mL15%偏磷酸溶液(20%三氯乙酸溶液)并混匀。将各试管内容物分别过滤(过滤前用蒸馏水润湿滤纸),弃去沉淀。量取每个样品的滤液4mL,分别加入已编号的试管中,然后每管内加入饱和硫酸铜溶液1mL,混匀,再加入0.4g氢氧化钙粉末,振荡摇匀。放置30min,并不时振荡,使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤,弃去沉淀。4实验步骤4.3乳酸的测定取4支洁净、干燥的试管,编号。向4支试管中各加入1.5mL浓硫酸和2~4滴1.5%对羟基联苯试剂,混匀后放入冰浴装置中冷却。将每个样品的滤液0.25mL逐滴加入已冷却的上述混合液中,边加边摇动冰浴中的试管,注意冷却。将各试管混合均匀,放入沸腾的水浴中,待显色后立即取出,比较和记录各管溶液的颜色深浅,并加以解释。表3-4为各步骤的简化示意操作。5结果与分析①在本实验中,加入液体石蜡的作用是什么?②在本实验中,怎样做才能尽可能减小误差得出理想的结果?实验四

脂肪酸的β-氧化作用1实验目的(1)了解脂肪酸的β-氧化作用。(2)通过测定和计算反应液中丁酸氧化生成丙酮的量,掌握测定β-氧化作用的方法及其原理。在肝脏中,脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮,也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮统称酮体。酮体是机体代谢的中间产物。在正常情况下,其产量甚微。在患糖尿病或食用高脂肪膳食时,血中酮体浓度增高,尿中也能出现酮体。本实验使用新鲜肝糜与丁酸保温,生成的丙酮在碱性条件下与碘反应生成碘仿。反应式如下2实验原理剩余的碘可用标准硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液滴定根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差,可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。3实验材料及设备3.1实验材料鲜肝。3.2仪器设备恒温水浴锅、酸性滴定管、吸管、剪刀、锥形瓶(50mL)、漏斗、试管、试管架、研钵、分析天平、滤纸和移液管。3.3试剂及其配制方法①2%淀粉溶液。②0.9%氯化钠溶液。③15%三氯乙酸溶液。④10%盐酸溶液:取277.8mL盐酸,用蒸馏水定容至1L。⑤0.5mol/L丁酸溶液:取5mL丁酸溶于适量水中,再用0.5mol/L氢氧化钠溶液定容至100mL。⑥10%氢氧化钠溶液。⑦0.1mol/L碘液:将12.7g碘和25g碘化钾,放置于研钵中。加入少量蒸馏水后,研磨至溶解。定容至1000mL,在棕色瓶中保存。用标准0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定测定其浓度。⑧0.1mol/L硫代硫酸钠溶液:称取25g硫代硫酸钠,将其溶解于适量煮沸的蒸馏水中,并继续煮沸5min。冷却后,用冷却的已煮沸过的蒸馏水定容至1000mL。此时可用0.1mol/L碘酸钾溶液标定其浓度。⑨标准0.01mol/L硫代硫酸钠溶液:临用时将已标定的0.1mol/L硫代硫酸钠稀释成0.01mol/L。⑩1/15mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液:将1/15mol/L磷酸氢二钠86.8mL和1/15mol/L磷酸二氢钠13.2mL,混匀备用。4实验步骤(1)肝糜制备取肝用0.9%氯化钠溶液冲洗,用滤纸吸去表面的水分。称取肝组织5g置于组织匀浆器中,加少量的0.9%氯化钠溶液研成细浆。再加0.9%氯化钠溶液至总体积为10mL。(2)保温反应取2个50mL锥形瓶,各加入3mL1/15mol/L、pH为7.6的磷酸缓冲液。向一个锥形瓶中加入2mL正丁酸,另一个锥形瓶作为对照,不加正丁酸。然后各加入2mL肝糜,混匀后置于43℃恒温水浴内保温。(3)沉淀蛋白保温1h后,取出锥形瓶,各加入3mL15%的三氯乙酸。在对照瓶内再加2mL正丁酸,混匀,静置15min,过滤。将滤液收集在2支试管中。(4)酮体的测定吸取两种滤液各2mL,分别放入另2个锥形瓶中,再加3mL0.1mol/L碘液和3mL10%氢氧化钠溶液。摇匀后,静置10min。加入3mL10%盐酸中和。然后用0.01mol/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至浅黄色时,加入3滴2%淀粉溶液作为指示剂。摇匀,滴至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠溶液的毫升数。5结果与分析6思考题①酮体为什么只能在肝外组织进行作用?②为什么要生成酮体?③机体在什么情况下会出现酮体代谢失调?如何检测和预防?式中

A———滴定对照所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数;B———滴定样品所消耗的0.01mol/L硫代硫酸钠溶液的毫升数;C———标准硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L);1/6———1mol标准硫代硫酸钠相当于丙酮的量。实验五

氨基转换作用的测定(分光光度法)1实验目的(1)了解转氨酶在生物体内的生理功能。(2)掌握测定转氨酶催化氨基转换作用的原理和方法。体内氨基酸的氨基转换反应是由转氨酶催化完成的。转氨酶催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这一过程称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中,在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。在动物机体内活力最强、分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称GPT),另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称GOT)。它们的催化反应如下2实验原理GOT催化生成的草酰乙酸在柠檬酸合成酶的作用下转变为丙酮酸与二氧化碳。由上可见,此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应,形成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色,计算出其含量,以此测定转氨酶的活性。转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60min,生成1μmol丙酮酸为1个单位。3实验材料及设备3.1实验材料血清。3.2仪器设备分光光度计、恒温水浴锅。3.3试剂及其配制方法①磷酸盐缓冲液(pH=7.4):取甲液825mL,乙液175mL,混合,pH为7.4即可使用。甲液:1/15mol/L磷酸氢二钠溶液。配制方法:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g溶于蒸馏水,定容至1000mL。乙液:1/15mol/L磷酸二氢钾溶液。配制方法:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶于蒸馏水,定容至1000mL。3.3试剂及其配制方法②GPT基质液:称取酮戊二酸29.2mg及DL丙氨酸1.78g,溶于20mLpH=7.4的磷酸盐缓冲液中,溶解后再加缓冲液70mL,并移入100mL容量瓶内。加1mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL,校正pH至7.4。再用pH=7.4的磷酸缓冲液定容至100mL。4℃可保存一周。③GOT基质液:称取α-酮戊二酸29.2mg及DL-天冬氨酸2.66g,溶于20mLpH=7.4的磷酸盐缓冲液中,溶解后再加缓冲液70mL,并移入100mL容量瓶内。加1mol/L的NaOH溶液0.5mL,校正pH至7.4。再用pH=7.4的磷酸缓冲液定容至100mL。4℃可保存一周。④2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼20mg,先溶于10mL浓盐酸中(可加热助溶),再用蒸馏水稀释至100mL(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存。⑤丙酮酸标准液(2mmol/mL):精确称取丙酮酸钠22mg,溶解后转入100mL容量瓶中,用磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH=7.4)稀释至刻度。⑥0.4mol/L氢氧化钠溶液。⑦柠檬酸苯胺溶液:取柠檬酸50g溶于50mL蒸馏水中,再加入苯胺50mL,充分混合即成。若在低温下出现结晶,可将溶液置于37℃水浴中,待结晶完全溶解后使用。4实验步骤(1)标准曲线制作:取6支试管按表3-5操作。混匀后,520nm波长处,以空白调“0”点,读取各管吸光度。以单位值为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。混匀后,在520nm波长处,以空白管做对照,调“0”点,读取各管吸光度。以标准浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。4实验步骤(2)GOT(GPT)测定:取2支洁净的试管,按表3-6操作。混匀,放置5min,在波长520nm处测定,以空白管调“0”点,读取吸光度。GPT测定不加柠檬酸苯胺溶液,其他操作方法同GOT测定法。5结果与分析6思考题①转氨酶在物质代谢过程中有什么重要作用?②血清转氨酶活性测定有什么意义?根据测得的测定管的吸光度,直接在丙酮酸标准曲线上查找,即可得丙酮酸的量(μmol,用1μmol丙酮酸代表1单位酶活力)。计算100mL血清中转氨酶的活性单位。实验六

饱食、饥饿和激素对肝糖原的影响1实验目的掌握饱食、饥饿和激素对肝糖原含量的影响及其作用机制。正常情况下,肝糖原的含量约占肝重的5%,许多因素可影响肝糖原的含量。例如,饱食后肝糖原含量增加,饥饿则使肝糖原含量逐渐降低;某些激素如肾上腺素促进肝糖原分解而降低其含量,皮质醇促进糖异生而增加其含量。本实验采用蒽酮显色法测定肝糖原含量。具体操作如下:先将肝组织置于浓碱中加热,破坏其他成分而保留肝糖原;肝糖原被浓硫酸脱水生成糠醛衍生物,后者与蒽酮作用形成蓝棕色

化合物。在一定条件下,颜色的深浅与肝糖原的含量成正比,可与同法处理的标准葡萄糖溶液进行比色定量。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料体重25g以上的健康小白鼠4只。3.2仪器设备恒温水浴箱、分光光度计、剪刀、镊子、滤纸、精度为10mg的电子天平、试管、刻度吸管、100mL容量瓶等。3.3试剂及其配制方法①0.9%NaCl溶液、30%KOH溶液、标准葡萄糖溶液(0.1mg/mL)、肾上腺素注射液。②0.2%蒽酮试剂:在100mL浓硫酸(相对密度1.84)中加入0.2g蒽酮,此试剂不稳定,宜当日配用,冰箱保存可用2~3d。③醋酸皮质醇注射液:将0.4mL醋酸皮质醇液(含10mg)用0.9%NaCl溶液稀释至10mL。4实验步骤(1)动物准备:选择体重在25g以上的健康小白鼠4只,随机分为两组。一组给足量饲料;另一组于实验前禁食24h,只给饮水。实验前5h,给一只饥饿小白鼠腹腔注射皮质醇0.2mg/10g体重;实验前半小时,给一只饱食小白鼠腹腔注射肾上腺素5μg/10g体重。(2)糖原提取:用颈椎脱臼法处死动物,分别取出肝脏,以0.9%NaCl溶液冲洗肝脏,用滤纸吸干,准确称取肝组织0.5g,分别放入盛有1.5mL30%KOH溶液的试管中,编号。将试管置于沸水浴中煮20min(肝组织必须在沸水浴中全部溶解,否则影响比色)。取出试管,冷却后将各管内容物分别移入4支100mL容量瓶中(用蒸馏水洗涤试管,一并收入容量瓶内)。定容至刻度,仔细混匀。(3)糖原测定:取试管6支,编号,按表3-7加入试剂。混匀后,将试管置于沸水浴中煮10min,冷却后,以空白管调零,于620nm波长处读取吸光度。5结果与分析6思考题①饱食鼠肝糖原含量较高是为什么?②饥饿鼠离心管中沉淀较少,说明什么?式中1.11———葡萄糖含量换算为糖原含量的校正系数(111μg糖原经蒽酮试剂显色的吸光度相当于100μg葡萄糖经蒽酮试剂显色的吸光度)。※注意事项:①颈椎脱臼法必须迅速进行,避免动物长时间受刺激,导致肝糖原分解加速。②肝组织必须在沸水浴中全部溶解,否则影响比色。③注意定量准确,吸取量要准确。④此法鉴定肝糖原含量宜在1.5%~9%。若肝糖原含量小于1%时,蛋白质可干扰蒽酮反应,此时必须改用间接法测定。即肝组织消化后,用95%乙醇溶液沉淀肝糖原(1∶1.25)。离心分离,用2mL蒸馏水溶解肝糖原,再按表3-7操作。实验七

植物体内的转氨基作用1实验目的(1)了解转氨酶的作用,掌握转氨基作用的特点。(2)学习纸层析法的基本技术。植物体内通过转氨酶的作用,α-氨基酸上的氨基可转移到α-酮酸原来酮基的位置上,形成一种新的α-酮酸和一种新的α-氨基酸。所生成的氨基酸可用纸层析法检出。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料绿豆芽子叶及胚轴。3.2仪器设备研钵、10mL量筒、离心机、试管、移液管、恒温培养箱、漏斗、层析缸、层析滤纸、毛细管、吹风机和离心管。3.3试剂及其配制方法②0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液(用NaOH中和至pH为7.0)。③含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为8.0),磷酸缓冲液(pH为7.5)。④正丁醇。⑤甲酸。⑥0.1mol/L谷氨酸溶液。⑦0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液。4实验步骤4.1酶液的提取取发芽2~3d的绿豆芽5g,放入研钵中,加2mL磷酸缓冲液(pH为8.0)研磨成匀浆,转入离心管。研钵再加入1mL该缓冲溶液冲洗,然后倒入离心管中。以3000r/min的转速离心10min,取上清液备用。4.2酶促反应取3支试管编号,按表3-8分别加入试剂和酶液。将试管摇匀后,置于37℃恒温培养箱中保温30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液终止酶反应,于沸水浴中加热10min,使蛋白质完全沉淀,冷却后离心或过滤,取上清液或滤液备用。4实验步骤4.3层析取层析纸一张,在距底线2cm处用铅笔划一水平线。在线上等距离确定5个点,作为点样位置,相邻各点间距2cm。取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液分别点样。反应液点5~6滴,标准液点2滴。每点一次用吹风机吹干后再点下一次。最后沿垂直于基线的方向将滤纸卷成圆筒,以线缝合,注意纸边不能叠在一起或接触(图3-1)。在层析缸中放入由正丁醇-甲酸-水(体积比15∶3∶2)组成的展开列。

待缸内蒸汽饱和后,将滤纸筒垂直放入,展层。待溶剂前沿上升至距滤纸前沿约2cm时取出,用铅笔标出前沿位置。吹干,剪断缝线,以0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液喷雾。置于烘箱(60℃)内或用吹风机烘