小柴胡汤对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫相关因子的影响

小柴胡汤对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫相关因子的影响

小柴胡汤源于东汉张仲景所著的《伤寒》和《钱荒本要义》。这是少阳和解少阳的代表汤。

由柴胡、黄苓、半夏、人参、甘草、生姜、大枣7味药组成，是和解少阳的代表方剂，临

床应用广泛。现代药理学珊究表明，小柴胡汤具有免疫调节功能。本研究以环磷酰胺

（Cyclophosphamide,CY）腹腔注射制备免疫抑制小鼠模型，并用生理盐水作对照，观察

小柴胡汤及其剂量变化对免疫抑制小鼠免疫相关因子TNF-a、TL-6的影响°旨在

证实小柴胡汤对小鼠的免疫调节作用并初步揭示其作用机制，并为拓展小柴胡汤的临床运

用范围提供理论依据。

1材料和方法

1.1小鼠饲养环境

健康昆明鼠90只，雌雄各半，体重（20±2）g,6~8底龄，由青岛市实验动物和动物实验

中心提供，许可证号:SCXK（鲁）20090007;小鼠常规饲养、自由摄食、饮水，饲养环境温

度18~22℃,湿度40~70鼠自然昼夜节律光照。小鼠经常规饲养7d后，按照随机分组的

原则分为5组，每组18只，雌雄分笼饲养，每笼6只。

1.2主试剂和设备

1.2.1配制0.2mol溶液

注射用环磷酰胺:0.2g/支，枇号:H32020857,由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。月蒸

储水溶解，稀释成2mg/ir.Lo

ELISA试剂盒：由武汉博士德生物工程有限公司提供，TNF-a（货号:EK0527）,IL-2（货

号：EK0398）,IL-6（货号：EK0411）。

1.2.2仪器、设备

电子天平（JA1003B型，上海越平科学仪器有限公司）；恒温水浴箱（SHZ-B型，上海跃进

医疗器械厂）；台式低速离心机（80-2型，上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂）；

超净工作台（SW-CJ-1FD苏州净化设备有限公司）；

酶标分析仪（RT-6000型，美国Rayl。雷杜公司）；微量移液及相应量程吸头等；本实验

在青岛大学医学院公共卫生学院实验室完成。

1.3实验方法

1.3.1味中药的预处理

小柴胡汤的组成为柴胡20g,黄苓10g,半夏10g,人参10g,炙甘草6g,生姜10g,

大枣10g。将上述7味中药，以8倍量蒸储水浸泡30nin,加热保持微沸30min,过滤；

残渣加6倍量蒸镯水，微沸30min,过滤，合并2次滤液，混合后滤液干燥浓缩至100m

L,即低剂量小柴胡汤(0.76g/mL);以类似方法浓缩熬制中剂量小柴胡汤(1.52g/m

L)、高剂量小柴胡汤(3.04g/mL),4℃冰箱保存备用。

1.3.2环磷酰胺的注射

正常对照组腹腔注射生理盐水1mL/d,同时用生理盐水经食道灌胃0.3mL/d,连续7d;

模型对照组用环磷酰胺腹控注射(100mg/(kg・d)),同时用生理盐水经食道灌胃0.3ni

L/d,连续7d;小柴胡汤低、中、高剂量组分别用环磷酰胺腹腔注射(100mg/(kg・d)),

同时分别用不同剂量的小柒胡汤灌胃0.3mL/d(剂量为10g/kg、20g/kg、40g/kg),

连续7do

1.4血清离心分离

木次给药后30皿川称量体重，摘眼球取血2川L,迅速低温离心分离血清(4℃,3000

r/min,10min),标记好后置-20℃保存备用。分离胸腺并测定重量，计算胸腺指数。

1.5elisa检测

血清中TNF-a、IL-2、IL-6含量检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，操作步骤按照

试剂盒说明书操作步骤进行检测。胸腺指数二胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)。

1.6统计方法

用SPSS13.0统计软件，结果以(ue0af±s)表示，以t检验分析组间差异，显著性水平

a=0.05o

2结果

2.1酰胺前急性毒性试验

正常对照组小鼠实验前后无明显变化，未出现小鼠死亡。模型对照组小鼠在应用环磷酰胺

后，出现精神萎靡、活动量下降及摄食量减少，逐渐出现毛色变暗，体型消瘦等表现，有

3只小鼠死亡。小柴胡汤低、中、高剂量组相对于正常对照组小鼠活动鼠及进食星梢微减

少，体型无明显消瘦;小柴胡汤低、高剂量组各有1只小鼠死亡。

2.2明环磷酰胺对小鼠免疫功能的影响

从实验结果可见，与正常对照组比较，模型对照组小鼠的胸腺指数有明显降低(P<

0.01),说明环磷酰胺可使小鼠胸腺明显萎缩，免疫功能下降，使小鼠处于免疫抑制状态。

与模型对照组相比，小柴胡汤高、中、低剂量组小鼠胸腺指数均显著升高(p<0.01),

但与正常对照组小鼠比较，胸腺指数无明显差异(P>0.05);表明小柴胡汤可在一定程度

保护免疫抑制小鼠的免疫器官及功能，见表1。

2.3小柴胡汤对小鼠tnf-的影响

从实验结果可见，与正常对照组比较，模型对照组、小柴胡汤低、中、高剂量组小鼠TNF-

a均有明显降低(P<0.01-0.05);小柴胡汤低、中剂量组与模型对照组比较，小鼠TNF-

a无明显差异(P>0.05);小柴胡汤高剂量组与模型对照组比较，小鼠TNF-a有显著升

高(P<0.05);小柴胡汤低、中、高剂量组之间比较，小柴胡汤高剂量组比小柴胡汤低剂

量组小鼠TNF-a有显著升高(P<0.05),见表2。

2.4小柴胡汤高、中、低剂量对小鼠il-2的影响

从实验结果可见，与正常对照组比较，模型对照组、小柴胡汤低剂量组小鼠IL-2有明显

降低(P<0.01,P<0.05),小柴胡汤高、中剂量组小鼠IL-2无明显差异(P>0.05);

与模型对照组相比，小柴珥汤高、中、低剂量组小鼠IL-2均有显著升高(P〈0.0D；与

小柴胡汤低剂量组比较，小柴胡汤高、中剂量组小鼠IL-2均有显著升高(P<0.01,P<

0.05);但小柴胡汤高、中剂量组之间无明显差异(P>0.05),见表3。

2.5小柴胡汤对小鼠il-6的影响

从实验结果可见，与正常对照组比较，模型对照组、小柴胡汤低、中、高剂量组小鼠IL-6

均有明显降低(P<0.01-0.05);与模型对照组相比，小柴胡汤低剂量组小鼠IL-6无明显

差异(P>0.05),小柴胡汤高、中剂量组小鼠IL-6均有显著升高(P<0.01);与小柴胡

汤低剂量组比较，小柴胡为高、中剂量组小鼠IL6均有显著升高(P<0.01);但小契胡

汤高、中剂量组之间无明显差异(P>0.05),见表4。

3免疫抑制作用

环磷酰胺能降低小鼠血清n-2、IL-6及TNF-a的水平;小柴胡汤能够拮抗环磷酰胺的免

疫抑制作用，对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的胸腺指数有明显的提高作用；能够升高免疫

抑制小鼠血清IL-2、IL-6及TNF-a的水平,其中小柴胡汤中、高剂量组效果更显著;小

柴胡汤在一定程度上能够调节机体的免疫功能。

4小柴胡汤对四氟化碳的影响

环磷酰胺作为一种细胞毒化疗药物，同时也属于烷化剂类免疫抑制剂，其作用主要是破坏

DNA的结构，从而阻断其复制，导致细胞死亡。临床上主要用于多种肿瘤及自身免疫性疾

病的治疗，在杀伤肿瘤细抱的同时，可损伤自身免疫细胞，造成机体免疫功能的低下。而

在免疫毒理学中，环磷酰胺是制备免疫抑制模型的常用药物。对于健康小鼠，经皮下或腹

腔注射环磷酰胺80~150irg/kg,5d后小鼠免疫功能显著下降。本研究选用环磷酰胺作为

免疫抑制剂，所用剂量为100mg/（kg-d）,结果可见环磷酰胺模型组和正常对照组小鼠

实验指标差异具有统计学意义，说明成功制备免疫抑制动物模型。

谢斌等通过小柴胡汤急性毒性实验（改进寇氏法）发现小柴胡汤及加味小柴胡汤80g/

（kg•d）剂量可能对小鼠影响较大，而40g/（kg•d）剂量下对小鼠可能影响较小。邵鸿

娥等通过实验发现小柴胡场加味水煎浓缩剂20、45g/kg可以降低四氯化碳引起的小鼠血

清谷丙转氨酶的升高，具有保护化学性肝损伤作用。故本研究所用小柴胡汤剂量均在40

g/kg/d以下，小柴胡汤低、中、高剂量［10、20、40g/（kg-d）］相当临床成人每日常用

量的10、20、40倍。

模型对照组有3只小鼠死亡;小柴胡汤低、高剂量组各有1只小鼠死亡。究其原因与环磷

酰胺的毒性、实验操作不当、小鼠个体耐受性差等多因素有关。

胸腺是机体重要的免疫器官，胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与

细胞免疫。其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。该实验发现小柴胡汤能

显著提高小鼠胸腺指数，对细胞免疫有增强作用。

Mosmann等依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Thl和Th2两个功能不同的

独立亚群。Thl细胞主要分泌IL-2、IFN-Y和TNF-a等细胞因子，主要介导细胞免疫反

应，在诱发器官特异性自身免疫病，器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调

节作用。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10RIL-13,主要调节体液免疫反应，

在诱发过敏反应中起着决定性的作用。IL-2在体内通过与免疫细胞表达的特异性IL-2R结

合，传导生物信号而发挥作用。IL-2均具有促进T细胞增殖、增强杀伤T细胞、NK细胞

的活性等广泛的免疫调节作用，IL-2水平的高低是机体细胞免疫的重要标志。IL-6是由T

淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等产生的一种多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性，

主要包括：促进B细胞分化，刺激B细胞分泌免疫球蛋白；促进植物血凝素（PHA）或刀豆

球蛋白（ConA）激活的T细胞增殖，刺激未成熟的胸腺细胞分化为成熟的细胞毒性二细

胞（CTL）;扩大自然杀伤（NK）细胞的杀伤能力；诱导肝细胞合成急性期反应蛋白；具有典

型的干扰素样活性，启动抗病毒及抗肿瘤作用等。TNF-a是由单核巨噬细胞产生的内源性

细胞因子，具有调节