第十章-吸光光度法S

第十章吸光光度法S2、吸收光谱产生的原理*吸收光谱分为：原子吸收光谱和分子吸收光谱。是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。*原子吸收光谱

Atomicabsorptionspectrum由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的，为线状光谱。线状光谱-Linespectrum*分子吸收光谱-带状光谱

molecularabsorptionspectrum

→由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差在1~20(eV)]，为紫外及可见分光光度法。

UV/VisSpectrophotometry→由分子振动能级(能量差约0.05~leV)和转动能级(能量差小于0.05eV)的跃迁而产生的吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结构的研究。

InfraredSpectrophotometry→带状光谱

Bandspectrum3、可见光区中光的互补原理单色光：具同一波长的光。复合光：由不同波长组成的光。如白光。紫外光：波长200~400nm。可见光：人眼能感觉到的光，波长在400~750nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。光的互补原理：按一定比例混合，得到白光。混合前的这两种色光称为互补色光。4、物质对光的选择性吸收（1）机理：分子外层价电子的跃迁引起。（2）物质呈现颜色与光吸收的关系：物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。注：物质浓度的大小决定了溶液颜色的深浅。5、吸收光谱：以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。*最大吸收波长：光吸收程度最大处的波长，用λmax表示。*吸光度（absorbance）在可见光区，KMnO4溶液对波长525nm附近绿色光的吸收最强，而对紫色和红色的吸收很弱。λmax=525nm。浓度不同时，光吸收曲线形状相同，λmax不变，吸光度不同。6、特点（1）灵敏度高（2）准确度高（3）应用广泛（4）操作简便，设备简单二、光吸收的基本定律1、朗伯-比尔定律（Lambert-Beerlaw）

当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。如图6-3所示，设人射光强度为I'0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。

在吸光光度分析法中，试液和空白溶液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，然后让强度为I’0的单色光分别通过这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。

透射比或透光度（Transmittance）

透过光强度It与人射光强度Io之比称为透射比或透光度，用T表示溶液的透射比愈大，表示它对光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它对光的吸收愈大。

朗伯(LambertJH)和比尔(BeerA)分别于1760和1852年研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。

当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到均匀非散射的长度为b的液层、浓度为c的溶液时，由于溶液中吸光质点(分子或离子)的吸收，通过溶液后光的强度减弱为I：朗伯-比尔定律：当一束平行单色光垂直照射到均匀非散射的含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分析的理论基础。比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。

（1）成立前提入射光为平行单色光，且垂直照射吸光物质为均匀非散射体系吸光质点之间无相互作用辐射与物质之间的相互作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。（2）适用范围所有电磁辐射和吸光物质（3）吸光度的加和性含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。A总=A1+A2+…2、K的讨论Ⅰ吸收系数a

当浓度c用g·L-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K用另一符号a来表示。a称为吸收系数，单位为L·g-l·cm-1，它表示质量浓度为lg·L-1，液层厚度为lcm时溶液的吸光度。Ⅱ摩尔吸收系数molarabsorptivity

当浓度c用mol·L-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K用另一符号κ来表示。κ称为摩尔吸收系数，单位为L·mol-l·cm-1，它表示物质的量浓度为lmol·L-1，液层厚度为lcm时溶液的吸光度。最大吸收处的摩尔吸收系数κmax讨论：λ一定，T一定，溶剂一定时，不同的物质κ不同。相同的物质，T一定，溶剂一定时，λ不同时，κ不同。λmax下的κmax表示该物质吸光能力可以达到的最高极限。Ⅲ桑德尔(Sandell)灵敏度SS是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2，S与κ及吸光物质摩尔质量M的关系为：例：用氯仿将纯胡萝卜素（C40H56，Mr=536）配成浓度为2.5mg·L-1的溶液，在λmax为465nm，吸收池厚度为1cm时，测得溶液的吸光度为0.550，计算胡萝卜素的κ，a，S。三、引起偏离朗伯-比尔定律的因素在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。偏离朗伯－比尔定律的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯—比尔定律所要求的理想条件不一致。（1）非单色光引起的偏离*朗伯-比尔定律只适用于单色光，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯－比尔定律的偏离。

1、物理因素*克服非单色光引起的偏离的措施◎使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的“单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。◎入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的κ值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。◎测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。5cm，lcm，2cm，3cm和5cm。络合物丁二酮肟镍的最大吸收◎入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的κ值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。由原子外层电子选择性地吸收某些波长的电磁波而引起的，为线状光谱。*最大吸收波长：光吸收程度最大处的波长，用λmax表示。S是指当仪器的检测极限A=0.这些基团中的π电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的可见光而显色。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。光电池photocellE显色反应的条件应易于控制。助色团是含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。（1）适用情形：各组分吸收曲线相互重叠（2）非平行光引起的偏离当入射光为非平行光，就不能保证光全部垂直通过吸收池，导致光束的实际光程大于吸收池的厚度，实际的吸光度大于理论值，从而产生正偏离。b显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。B络合：显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。（1）非单色光引起的偏离利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态朗伯-比尔定律：当一束平行单色光垂直照射到均匀非散射的含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。加入掩蔽剂选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。复合光：由不同波长组成的光。2、吸光度范围的选择接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。（4）显色反应温度：显色反应大多在室温下进行。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。*影响显色剂的平衡浓度和颜色d显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。Ⅱ测试样的示差吸光度Af：相当于两者的差值（3）介质不均匀引起的偏离朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲，引起正偏离。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。（4）溶液浓度过高引起的偏离浓度过高使得吸光物质分子或离子之间的平均距离减小，质点之间的相互作用改变电荷分布，继而改变了物质的吸光能力。

溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。A解离：大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱)解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。B络合：显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。2、化学因素——溶液本身的化学反应引起的偏离

c缔合：例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。

在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯－比尔定律的偏离。§10.3吸光光度法的仪器一、目视比色法colorimetry

用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析。灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。二、分光光度计及其基本部件

分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光束和双光束两类。以可见分光光度计为例介绍。

分光光度计的基本部件:光源、分光系统、吸收系统、检测系统和信号显示系统。1、光源（lightsource）

用6~12V钨丝灯作可见光区的光源，发出的连续光谱在400~2500nm范围内。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。2、分光系统分光系统的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅。棱镜（prism）：根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝（slit）照射到吸收池上。由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。光栅（grating）是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。3、吸收系统——比色皿或吸收池用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5cm，lcm，2cm，3cm和5cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。4、检测器detector接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。光电池photocell光电管（phototube）：光电倍增管（photomultiplier）5、信号显示系统

作用是把放大的信号以吸光度A或透射比T的光度分析法的设计方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。

三、吸光度的测量原理借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被测物质的浓度或含量。步骤：调0→调100（参比溶液）→测A（待测溶液）四、分光光度计的类型1、按波长范围分：紫外-可见；可见；红外2、按仪器的结构：单光束；双光束；双波长§10.3吸光光度法分析条件的选择1、显色反应（colorreaction）待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。（1）类型按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。一、显色反应及其条件的选择（2）显色反应的选择A

选择性好，干扰少，或干扰容易消除;灵敏度高，有色物质的κ应大于104L·mol-l·cm-1

。B有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。C有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60nm。D有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。E显色反应的条件应易于控制。2、显色剂（1）无机显色剂：不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。（2）有机显色剂：分子中含有生色团和助色团。生色团是某些含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中的π电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上的可见光而显色。助色团是含孤对电子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生色团上的不饱和键作用，使颜色加深。3、显色条件的选择实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。（1）溶液的酸度

M+HR===MR+H+*影响被测金属离子的存在状态*影响显色剂的平衡浓度和颜色*影响络合物的组成*pH与吸光度关系曲线确定pH范围*应为A最大且恒定的区间（2）显色剂的用量

M(被测组分)+R(显色剂)==MR(有色络合物)为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。

（3）显色反应时间有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。（4）显色反应温度：显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。（5）溶剂：有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。（6）干扰及其消除方法影响因素：试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。消除方法：a.控制溶液酸度

b.加入掩蔽剂选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态d.利用校正系数e.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。f.选择适当的波长g.当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。h.分离以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。对波长525nm附近绿色光当入射光为非平行光，就不能保证光全部垂直通过吸收池，导致光束的实际光程大于吸收池的厚度，实际的吸光度大于理论值，从而产生正偏离。适于常量分析（2-5%）对波长525nm附近绿色光干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。偏离朗伯－比尔定律的原单色光：具同一波长的光。波长为470nm，但试样中的铁光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。吸光度差Af与这两种溶液的浓度差成正比。S是指当仪器的检测极限A=0.d显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。1、测量波长和吸光度范围的选择为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”。但是，在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应根据“吸收最大，干扰最小”的原则入射光波长。二、测量条件的选择例丁二酮肟光度法测钢中镍，络合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为470nm，但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在470nm处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选择波长520nm进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。2、吸光度范围的选择从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.15~0.80范围内。可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池来达到目的。吸光度测量的误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。

要使测量相对误差最小，则TlnT必须取最大值。d（TlnT）=0即lnT+1=0T=0.368

3、参比溶液的选择利用参比溶液