3.2 基因工程的基本操作程序（第3课时）课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序（第3课时）第二步：基因表达载体的构建(核心工作)1.目的①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代②使目的基因能够表达和发挥作用目的基因复制原点启动子终止子位置：基因的上游作用：RNA聚合酶识别和结合的部位，起始转录位置：基因的下游作用：终止转录2.基因表达载体的组成标记基因DNA复制的起始位点作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。目的基因位置：必须插到启动子和终止子之间一段有特殊序列结构的DNA片段启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的比较编码区（基因）编码区上游启动子终止子编码区下游密码子密码子密码子3'5'mRNA启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能DNA片段目的基因上游目的基因下游RNA聚合酶识别和结合的部位，起始转录终止转录mRNA上3个相邻的碱基mRNA首端mRNA尾端翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。第二步：基因表达载体的构建(核心工作)3.方法步骤限制酶切割位点启动子终止子复制原点标记基因质粒①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口②用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段限制酶限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶重组DNA分子③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子。第二步：基因表达载体的构建√√模板链的3′端离启动子更近√√挑战自己：请为质粒和目的基因选择合适的限制酶吧！课堂小测6、下图为基因工程中基因表达载体的模式图，相关叙述错误的是（）A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B.图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位C.复制原点是基因表达载体在受体细胞中独立复制和稳定存在所必需的D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B课堂小测7、构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。可通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段长度，初步判断基因表达载体是否构建成功。下图是用限制酶完全酶切后（不考虑相同DNA之间的连接和目的基因的自身环化)的电泳结果。下列叙述错误的是（）A.琼脂糖凝胶中的DNA分子可以在特定波长的紫外灯照射下被检测出来B.酶切后，相同条件下DNA分子越小，在凝胶中的迁移速率越快C.泳道1为单酶切空载体后的产物，泳道2为单酶切重组载体后的产物D.泳道3为双酶切重组载体后的产物，且目的基因与载体正确连接D是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。第三步：将目的基因导入受体细胞1.转化2.方法植物细胞：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。实质：基因重组v第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(1)花粉管通道法精子(我国科学家独创的方法)方式1：①操作方式用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方式2：含目的基因的DNA溶液第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(1)花粉管通道法(我国科学家独创的方法)方式1：①操作方式用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方式2：v在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(1)花粉管通道法(我国科学家独创的方法)②受体细胞：v③适用生物：④特点：⑤应用：受精卵开花植物简便经济，但要求花朵较大抗虫棉的培育过程中，采用该法将Bt基因导入了棉花细胞。农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法①农杆菌：4.农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法5.为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？农杆菌T-DNA目的基因将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法②过程：T-DNA需要农杆菌产生的vir蛋白切割T-DNA目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株转入导入插入植物组织培养构建第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞3.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法T-DNA第1次拼接：两次拼接第2次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上第1次导入：两次导入第2次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌将含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞第三步：将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入植物细胞(2)农杆菌转化法③具体方法：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。受体细胞为体细胞受体细胞为受精卵随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。④成果：第三步：将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入动物细胞(1)最常用的方法：显微注射法(2)受体细胞：受精卵6.为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①体积大，易操作；②易表现出全能性构建基因表达载体并提纯胚胎移植利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养(3)过程：获得具有新性状的动物第三步：将目的基因导入受体细胞5.将目的基因导入微生物细胞(1)常用方法：Ca2+处理(2)受体细胞：常用原核细胞（大肠杆菌应用最广泛）目的：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）大肠杆菌Ca2+表达载体感受态细胞单细胞遗传物质少繁殖快Ca2+重组质粒吸收课堂小测8、下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是（）A.目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化B.可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA分子，有利于重组的基因表达载体导入其中C.可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊D.农杆菌只能侵染双子叶植物和裸子植物D第四步：目的基因的检测与鉴定检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。1.目的检查转基因生物是否培育成功的一步Bt抗虫蛋白抗虫棉Bt基因mRNA检测内容检测水平①检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质④检测个体是否具有相应性状分子水平分子水平分子水平个体水平第四步：目的基因的检测与鉴定2.检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因(1)方法一：PCR扩增提取DNA根据Bt

基因的序列设计2种PCR引物PCR培育的抗虫棉转基因抗虫棉非转基因棉花阴性对照使用琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增出Bt基因分子水平第四步：目的基因的检测与鉴定2.检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因(1)方法二：分子杂交技术基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有放射性同位素标记或荧光标记。变性转基因生物的DNA基因探针出现杂交带碱基互补配对变性分子水平第四步：目的基因的检测与鉴定3.检测目的基因是否转录出了mRNA(1)方法一：PCR扩增(2)方法二：分子杂交技术提取RNA使用琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增出目的基因PCRcDNA转基因生物逆转录mRNA基因探针变性转基因生物的mRNA出现杂交带碱基互补配对分子水平第四步：目的基因的检测与鉴定例：①胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的

形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有

，也可以检测胰岛素基因是否

。②人体的细胞中，胰岛B细胞的

（DNA/RNA/DNA和RNA）能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有

（DNA/RNA）能与之形成杂交分子。mRNA胰岛素基因DNA和RNA转录DNA第四步：目的基因的检测与鉴定4.检测目的基因是否翻译成蛋白质分子水平(1)方法：(2)原理：抗原—抗体杂交抗原与抗体特异性结合苏云金杆菌培育的抗虫棉提取抗体提取蛋白电泳分离抗体抗原杂交Bt抗虫蛋白标记抗体小鼠体内放射性检测

（杂交带）第四步：目的基因的检测与鉴定5.检测个体是否具有相应性状个体水平抗虫鉴定用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入Bt

基因或导入了Bt

基因但未表达；如虫吃后中毒死亡，则说明导入了Bt基因并得到表达。(1)通过抗虫、抗病（抗性）的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等第四步：目的基因的检测与鉴定5.检测个体是否具有相应性状个体水平抗虫鉴定通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt

基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。(1)通过抗虫、抗病（抗性）的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等第四步：目的基因的检测与鉴定5.检测个体是否具有相应性状个体水平(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同转基因生物检测方法观察指标抗虫植物饲喂害虫(抗虫接种实验)抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染(接种实验)抗盐植物盐水浇灌抗除草剂植物喷洒除草剂获取目的基因产物(如胰岛素)的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较害虫死亡未染病正常生长正常生长功能活性正常课堂小测9、目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（）A.目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNAB.可采用