比较基因组杂交原理

1CGH的基本原理

CGH是一种将消减杂交和FISH相结合，用于检测两个（或多个）基因组间相对DNA拷

贝数变化（如扩增、增益（gains）、复制和丢失等），并将这些异常定位在染色体上，因

此乂称DNA拷贝数核型（INAcopynumberkaryotype）技术,,,与传统的原位杂交方法相

反，该法不是将单一的、己定的DNA探针杂交在受检的分裂中期或间期的细胞上，而以被检

组织的基因组DNA为杂交检测样本，正常组织的DNA样不为参照，分别用不同颜色的荧光标

记，两者按】：1混合，与正常淋巴细胞中期染色体进行杂交（即反向原位杂交），再通过

检测两种颜色的荧光强度，根据颜色的比例来显示基因组的结构状况。如果探针中某一染色

体或染色体亚区呈现过度表达或低表达，则在正常染色体的相应区域内便呈现较强或较低的

信号，表明该区域存在DM序列的增益或丢失⑸。

2CGH的基本方法

随着CGH技术的广泛应用，其操作方法已逐步完善，经验表明，CGH技术的建立和常规

应用，对每一步操作都必须细致。CGH的主要步骤包括：（1）正常中期染色体的制备；（2）

从肿瘤组织中分离高分子量的基因组DNA；（3）用不同的haptens标记正常和肿瘤DNA：（4）

标记的DNA与正常中期染色体原位杂交；（5）荧光显微镜检杳和数字化图像分析；（6）对

中期染色体产生的绿红荧光密度比率相对应的拷贝数异常进行分析（3To

2.1正常中期染色体的制备正常中期染色体充当CGH杂交的靶，CGH分析的质最主

要依赖中期染色体的特性，中期染色体的制备采用常规PHT刺激和氨甲喋吟同步化处理的外

周血淋巴细胞培养技术，一次应制备大量片子，以保证整个实验都使用同一批片子。此外，

对制备的中期染色体玻片应选择重叠较少，形态保持较好，染色体较长的标本。

2.2肿瘤标本的选择和基因组DNA的分离分离DNA的标本应尽可能的选择具有典型

肿瘤组织学特征和比例高的恶性细胞，弃除坏死组织和炎症区域及周边正常细胞，因其中含

有坏死细胞降解的DNA和一些正常细胞，可显著消弱拷J4数改变的分辨能力。从肿瘤维胞和

组织中提取高分子量DNA的方法均可用于CGH。福尔马林固定、石蜡包埋切片亦可获得相对

高分子量的DNA,由于石蜡包埋组织提取的DNA浓度不足进行直接标记缺口平移法（nick

translation）,囚此肿瘤DNA应用兼并引物PCR（degenerateo1igonuc1eotidc-primedPCR,

DOP-PCR）扩增和标记,采用通用引物PCR（UNI-primer,5'-CCGACTCGAGNNNNNNAT

GTG-3',N=A,C,G或T）扩增和标记⑸。

2.3正常和肿瘤DNA的标记基因组DNA的标记可采用缺口平移法、随机引物法

（randompriming）和DOP-PCR等技术,通常采用生物素T4-dATP标记肿瘤DNA,地高辛

Tl-dUTP标记正常DNA,亦可用直接荧光素连接核甘酸，如FITC-dUTP和TexasRed-cUTP。

与着丝粒和粘粒探针相比，缺口翻译法后的基因组探针片断长度范围在600〜2000bp.在

缺口翻译反应中可通过调整DNase和DNA聚合酶的比例获得相应的DNA片断长度。

2.4CGH杂交和染色CGH杂交和染色基本遵循粘粒探针的染色体涂染和FISH技术，

杂交中将一定比例不同标记的检测和参照DNA混合，并加入Cot-1DNA以阻断重复序列对杂

交结果的干扰，特别是近端着丝粒和异染色质区的比率改变。为了获得足够的DNA浓度，标

记的DNA和阻断的DNA应充分混合。每次杂交前的变性时间和温度、蛋白酶K的量均不一样,

应适应调整以达到最完全的变性和最佳探针穿透，但应避免破坏DAPI带型，一般在37℃湿

度的小室中覆以盖玻片杂交2〜4天，按照标准的FISH技术洗掉未结合的探针，如果用间接

法标记探针时，用FITC(肿瘤DNA呈绿色荧光)和抗地高辛-罗丹明(正常DNA呈红色荧光)

免疫组化染色。

2.5荧光镜检和多彩数字图像分析CGH分析主要依赖两种荧光素的相对强度，由多

彩荧光显微镜和计算机多彩图像分析仪将荧光信号进行定量处理，评价沿染色体长轴分布的

两种荧光信号强度的相对比值，如果某一染色体区域的检测DNA荧光强度信号明显增强，表

明所检测的样本DNA相对于参照DNA序列发生增益，而参照DNA的荧光强度信号相对增强，

则提示检测DNA样本发生丢失。判断CGH质量的标准包括：(1)所有中期染色体具有平稳

的高强度杂交：(2)在一个染色体的两个姐妹染色单体的绿/红荧光分布相似，一般正常的

变异标准应小于0.85〜1.15,而端着丝粒和异染色质区常超过这个范围，故一般不作分析；

(3)染色体外周背景荧光水平低且一致；(4)染色体的端着丝粒和异染色质区连接的标记

DNAs较低：(5)染色体呈现强烈的DAPI染色，可见的条带、足够的长度和微小的重叠。

3CGH在肿瘤病理研究中的应用

CGH已广泛应用于人体各种肿瘤的研究，晚近的资料表明，已对2000()余例肿瘤的基因

组热点重排、拷贝数目的异常、编码的基因、以及与肿瘤的发生发展、诊断、分类和预后的

关系进行了研究，这对于加深肿瘤分子生物学的理解具有重要意义⑶。

3.1肿瘤染色体区DNA增益和丢失研究表明在许多恶性肿瘤如乳腺、卵巢、前列腺

和肺癌染色体区1Q、3q和8q常发生增益，而8p、13q、16q和17P常发生丢失。在睾丸癌

发生12p和Xp增益，肾癌发生14q丢失，卵巢癌发生Xp丢失。这些特异位点的丢失反映了

在癌发生过程中的独特性，为了评价恶性实体肿瘤遗传物质的增益和丢失，Mertens等⑹

选择文献报告的11种肿瘤,根据508例乳腺癌、447例恶性神经性肿瘤、435例肾癌、333

例结肠癌、304例卵巢癌、303例肺癌、209例睾丸生殖细胞肿瘤、206例头颈部癌、172例

恶性黑色素瘤、142例Wilm瘤和126例成神经细胞瘤的细胞遗传学信息，对每一染色体的

失衡进行计算，发现所有肿瘤的增益和丢失都有其独特的失衡分布，然而，不同类型的肿瘤

也具有相当大的重叠，提示许多肿瘤的发生具有相似的分子机制，所有肿瘤的丢失程度明显

高于增益，大多数肿瘤存在染色体X、Y、4、10、13〜15、18和22以及染色体片断lp22-pter.

3P13-pter、6ql4-qter、8p、9P和lip的丢失。肺小细胞癌的染色体3q(85%)、5P(70%)、

7p(70%)、7q(65%)和8q(65%)常发生信号增强,也见于lq、2P和20p；3q26、8q24、

3q28-qter.7qlL2、8pl-12、12Pl2和19ql3.1-13.2较常发生增益。而最常发生信号减

弱的染色体是3p21,8p21-pter>15qll.2-13、5qll.2-15.9p、13ql2-14.17p和18q21-qter

常发生丢失

(7)

3.2明确DNA增益和丢失的靶基因CGH可精确定位肿瘤基因，特别是发生DNA增益

的染色体位点。研究表明在•些肿瘤中存在多种染色体亚区增益或DNA拷贝数扩增。已发现

乳腺癌高达3()个染色体亚区参与增益和丢失，显著高于用癌基因特异DNA探针定位的结果。

Morchio等⑻对50例伴HBV感染的进展期肝细胞癌(HCC)进行CGH,发现染色体臂4q(70%)

和8P(65%)最常发生丢失，该丢失位于4q2l和8P21-23的微小重叠区，以往研究发现在

高分化HCC4q2L22区完全丢失是一继发事件，具可增加已发生肿瘤的侵袭力，此区亦是

HBV整合的部位;RFLP研究显示在8P21.3-22含有PRLTS基因(PDGF受体B样肿瘤合制基

因)。染色体臂16q(54%)、17P(51%)、13q(37%)、6q(37%)和lp36(30%)亦证实有丢

失,在23%〜85%的HCC发生含E-cadherin基因的16q21-24区丢失：染色体13q存在两

个丢失区，分别含有RBI(13ql4)和BRCA2(13ql2)肿瘤抑制基因。染色体臂8q(60%)、

lq(58%)、6P(33%)和17q(33%)频繁发生增益，最小重叠区定位于lql『25和8q22-24,在许

多肿瘤包括HCC频繁发生lp36的丢失，认为此区可能含有一个肿瘤抑制基因，lq的撅繁扩

增也提示存在一个痛基因参与癌的发生过程：此外在11q12、I2p1l、14讨2和19q1&1也发

现有扩增。对这些丢失或增益区分离克隆将可发现新的癌基因和肿瘤抑制基因。

3.3肿瘤的分期与分级Bockmuhl等⑼应用CGH对29例转移性(pN+)和19例非转

移性(pNO)头颈部鳞形细胞癌研究发现，pNO肿瘤染色体5p、6P和7P过度表达，而pN+

肿瘤频繁发生染色体7q、10q、lip、llq、15q和20P的丢失以及染色体19q和20q的过度

表达，转移性癌的染色体10q25-q2611和pl3-pl4的丢失显著增高，微卫星多态物杂合性分

析亦证实染色体10q的异常，表明这种独特的遗传学改变与头颈部鳞形细胞癌的转移表型有

关。Weber等一应用CGH对19例良性(WHO1级,Ml)、21例小典型(WHO11级，Mil)

和19例间变型(WHOIH级，Mill)散发的脑膜瘤染色体失衡扫描发现，随着恶性程度的增加，

染色体遗传学异常明显增多，每个肿瘤总的数目改变分别为2.9±0.7、9.2±1.2和

13.3±1.9,在MI最常发生的改变是22q丢失;在MII肿瘤组织的Ip(76%)、22q(71%)>

14q(43%)、18q(43%)、10q(33%)和6q(33%)常发生丢失，20q(48%)、12q(43%)、

15q(43%)、Iq(33%)、9q(33%)和17q(33%)常发生增益;在Mill肿瘤组织除与MH

相似的发生频率外,6q(53%)、10q(68%)和14q(63%)的丢失频率增加，9P的丢失

为32%,4/16(25%)的MHI肿瘤组织发现在9P21位点CDKN2A的纯合性丢失.1例MH和

8例MHI肿瘤组织存在17c.23的DNA序列扩增，尽管所有II、III级肿瘤组织存在高频率的染

色体异常，均无1例发生TP53外显子5〜8的突变，推测肿瘤基因组的异常可能与脑膜瘤

的进程有关。

3.4肿瘤的诊断与鉴别诊断Petersen等⑴应用CGH对25例肺鳞形细胞癌和25例

肺腺癌的染色体失衡研究发现，染色体Ip、3p、4q、5q、6q、8p、9p、13q、18q和2lq常

发生DNA拷贝数目的减少,5p、8q、9p、1lql3、16p、17q和19q发生DNA增益，在腺癌染

色体lq过度表达和3q、9q、10p和19DNA丢失更常见，而鳞形细胞癌染色体3q、12P的过

度表达和2q的丢失增加，两种组织学类型之间存在明显差异，染色体带lq23的过度表达和

9q22的丢失与腺癌密切相关，而染色体带2q36-37的