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DB3DB3云南省地方标准DB53/T962—2020烟草疫霉土壤带菌定量技术规程2020-04-26发布2020-07-26实施云南省市场监督管理局发布I本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本标准第4.5条与ZL201510635459.31GB/T25241.1烟草集约化育苗技术规程第GB/T25241.2烟草集约化育苗技术规程第GB/T25241.3烟草集约化育苗技术规程第NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、烟草疫霉菌（PhytophtoranicotianaeBreda）是烟草黑2吸取5-2、5-3、5-4土壤稀释液各20挑选菌落形态较易区分、菌落数（称为菌落形成单位Colony-FormingUnits，简称cfu）在（5~每1g土样形成的疑似菌落数计算公式为每1g土壤（干重）中烟草疫霉菌数量＝（同一稀释度3次挑取同一样品（30～50）个疑似烟草疫霉菌菌落5mm×5mm的菌丝块，按照附录B鉴定疑似菌落，——ParA1F:5’-CATTGAGTAGCCAGAGTCCGTC-3’；——ParA1R:5’-CCACCACGCAGCAAACTGCGGC-3c’。利用含烟草疫霉菌DNA目的片段的重组质粒作为标准品，使用SYBRGreenⅠ荧光染料法，以10倍稀释浓度梯度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR，构建标准曲线，并确定荧光定按照4.3.1方法提取烟草疫霉菌DNA，利用土壤真菌提取试剂盒提取试点土样总DNA，采用4.3.3.131200cfu/mL、1800cfu/mL游动孢子悬浮液的50mL烧杯中，制备不同浓度梯度的人工添加游动孢子的，（诱捕（2～4）h，10×20或20×20倍显微取50g研磨并通过2mm筛网的土样装入带有下盘内渗透吸水至饱和，去除多余水分，露天静置4d～5d，期间每1d早晚喷淋感黑胫病烟草品种烟苗根系分泌物保湿1次，维持土壤含水量的饱和状态，利用白昼温差、间歇喷淋诱导土壤产生并释放游动将处理土壤转移至250mL烧杯内，100mL灭菌水清洗带有下盖的土壤内，搅匀，按4.4.2.4的方法进行诱捕与计数，再将3次测定的平均值代入4.4.34按4.4.1的方法培育幼苗，再挑选生长整齐的烟苗，拔出，剪除1/4～1/3的末端根系，形成根或者4.3.3.3方法校验，调查所有烟株，按GB/T23222计算发病率，直接以最高发病率代替游动孢子数）～），）～），于30%（含）～50%（不含），种植时病害发生风险中5分别配制浓缩100倍的抗生素母液。配制时，分别配制原母液，用乙醇溶解多菌灵、恶霉6离心2min，弃去上清液，再用冰冻的75%乙醇洗涤1次，置于室温下干燥后烟草疫霉菌特异性引物ITS8-1/ITS8-2（5c-CGAAGCCAACCATACCACGAA-3c/5c-ATGAAGA）：），7取苗龄（45～55）d、（6～7）片真叶期感病

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