《化学药物中亚硝胺杂质研究技术指导原则》(试行)

《化学药物中亚硝胺杂质研究技术指导原则》(试行)1目的与适用范围为规范化学药物研发、生产及上市后管理中亚硝胺杂质的研究与控制，保障公众用药安全，基于当前对亚硝胺杂质的科学认知，参考国际人用药品注册技术协调会（ICH）相关指导原则，结合国内化学药物研发生产实际，制定本指导原则。本指导原则为注册申请人、生产企业开展亚硝胺杂质研究、设定控制策略提供技术指导，也用于药品监管机构对注册申报资料的审评。本指导原则适用于化学原料药、化学制剂（含创新药、仿制药、已上市化学药物）亚硝胺杂质的研究与控制，已上市药品变更、补充研究也应遵循本原则。对于使用化学合成起始原料、辅料的生物制品，其化学来源组分中亚硝胺杂质的研究可参照本原则执行。凡生产工艺中使用胺类试剂、亚硝酸类硝化/重氮化试剂、存在亚硝胺生成潜在风险的化学药物，均应按照本要求开展研究。2术语和定义2.1N-亚硝胺类杂质指分子结构中含有N-亚硝基官能团（-N-N=O）的化合物，属于基因毒性致癌物，国际癌症研究机构（IARC）已将N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）等多数常见亚硝胺列为1类或2A类人类致癌物。药物中常见亚硝胺杂质包括NDMA、NDEA、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基乙基异丙胺（NEIPA）、N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）等。2.2可接受每日最大摄入量（ADI）指终身每日摄入亚硝胺杂质不产生可评估致癌风险的最大剂量，本指导原则中未获得专属毒理学数据的亚硝胺杂质通用ADI基于毒理学关注阈值（TTC）设定。2.3每日最大原料药摄入量（MDD）指药品批准的临床最大用药剂量下，患者每日摄入的原料药重量。2.4风险评估指基于工艺路线、原料来源、生产条件对亚硝胺杂质产生的可能性、暴露水平进行分级识别与判断的过程。3亚硝胺杂质的风险识别与分级评估3.1亚硝胺杂质的潜在来源亚硝胺杂质为非有意添加的工艺杂质，主要来源于三类途径：3.1.1原料引入起始物料、中间体、试剂、辅料中可能存在亚硝胺前体或已经生成的亚硝胺。常见情况包括：①仲胺、叔胺类起始物料、缚酸剂、催化剂中自带仲胺杂质；②工艺中使用的亚硝酸、亚硝酸盐、硝酸盐等试剂，硝酸盐可在还原条件下转化为亚硝酸盐，成为亚硝化试剂来源；③常用辅料如聚维酮（PVP）、交联聚维酮、淀粉、硬脂酸镁等曾被检出亚硝胺杂质，部分药用辅料生产过程中使用胺类催化剂或亚硝酸盐处理，可能引入亚硝胺；④回收套用的溶剂、母液中，亚硝胺及其前体随回收次数增加逐渐累积，若未有效控制会引入终产品；⑤共线生产的多品种间，交叉污染导致引入亚硝胺杂质。3.1.2工艺过程生成亚硝胺主要通过仲胺与亚硝化试剂的亚硝化反应生成，反应最优pH范围为3.0~4.0，酸性条件下叔胺可分解生成仲胺，也可进一步发生亚硝化反应生成亚硝胺。常见工艺场景包括：①重氮化、硝化工艺中，亚硝酸盐为反应物，体系存在酸性条件，若工艺残留仲胺则极易生成亚硝胺；②酸性工艺条件下，同时存在胺类组分和亚硝酸盐/硝酸盐杂质，发生副反应生成亚硝胺；③大生产长期运行过程中，设备管道、反应釜内壁残留的胺类和亚硝酸盐逐渐累积，在批次生产间隙持续反应，导致亚硝胺杂质逐步升高，出现批次间波动增大、后期批次超标等情况；④溶剂回收过程中，前批次残留的胺和亚硝酸盐在回收蒸馏的酸性条件下反应生成亚硝胺，带入下一批次生产。3.1.3储存与放置过程生成终产品在储存有效期内可能生成新的亚硝胺杂质，常见场景包括：①API结构中含有仲胺侧链，制剂辅料或包装材料水中残留亚硝酸盐，在一定湿度、酸性条件下发生反应生成亚硝胺；②硝酸酯类、硝基类API降解过程中产生亚硝酸盐，与API本身结构中的仲胺基团或辅料中的胺反应生成亚硝胺；③有些原料药生产过程中使用亚硝酸作为裂解试剂，终产品残留微量亚硝酸盐和胺，长期储存过程中缓慢反应生成亚硝胺，有效期内逐渐升高。3.2风险分级评估注册申请人应基于对全工艺流程的梳理，逐步骤识别胺源和亚硝化来源，开展风险分级，根据风险等级制定对应控制策略：3.2.1低风险生产工艺全流程不存在胺源，也不存在亚硝化试剂来源，无生成亚硝胺杂质的可能，可判定为低风险。低风险品种无需开展后续亚硝胺杂质的定量研究，但需留存完整的风险评估资料，说明风险排除依据。3.2.2中风险仅存在胺源或仅存在亚硝化试剂，或者二者同时存在，但工艺中已有明确的纯化步骤可有效去除亚硝胺及其前体，经理论分析亚硝胺杂质残留水平低于可接受限度，可判定为中风险。中风险品种需提供纯化步骤去除能力的评估依据，定期开展杂质监测。3.2.3高风险同时存在胺源和亚硝化试剂来源，无有效去除亚硝胺的工艺步骤，或已有研究数据、文献报道提示该品种存在亚硝胺杂质，可判定为高风险。高风险品种必须开展完整的方法学验证、多批次样品测定，制定终产品控制策略。风险评估应动态更新，若发生工艺变更、原料供应商变更、生产场地变更，应重新开展风险评估，调整风险分级。4亚硝胺杂质的限度设定亚硝胺杂质为致突变性致癌物，限度设定遵循ICHM7(R1)对高potency致突变致癌物的控制要求，具体规则如下：4.1通用限度规则未获得专属毒理学数据的亚硝胺杂质，按照用药疗程设定可接受每日摄入量：（1）终身用药（用药疗程>6个月）：单个亚硝胺杂质的ADI为1.5μg/日，多个亚硝胺杂质同时存在时，所有亚硝胺杂质的总日摄入量不得超过1.5μg/日；（2）疗程超过1个月、不超过6个月：单个亚硝胺杂质的ADI为5μg/日，总日摄入量不得超过5μg/日；（3）疗程不超过1个月的短期用药：单个亚硝胺杂质的ADI为18μg/日，总日摄入量不得超过18μg/日。原料药或制剂中亚硝胺杂质的可接受限度计算公式为：可接受限度（μg/g）=对应ADI（μg/日）÷每日最大原料药摄入量MDD（g/日）。示例：缬沙坦每日最大用药剂量为320mg，对应MDD为0.32g，终身用药单个亚硝胺ADI为1.5μg/日，计算得可接受限度为1.5÷0.32≈4.7μg/g，该计算方式通用。4.2特殊情况限度调整若特定亚硝胺杂质已获得完善的啮齿类动物长期致癌试验数据，可采用线性外推法计算10-6致癌风险对应的每日摄入量，以此作为ADI，无需采用通用TTC限度；对于治疗窗窄、临床需求迫切的抗肿瘤药物、罕见病治疗药物，可结合患者人群的预期寿命、疾病风险获益比，适当放宽亚硝胺杂质的限度，但需提供充分的风险获益评估资料，经监管部门批准后方可生效。4.3复方制剂限度要求复方制剂中每个活性成分所含亚硝胺杂质应合并计算总日摄入量，总摄入量不得超过对应疗程的ADI要求。5亚硝胺杂质的控制策略亚硝胺杂质控制遵循“源头控制、过程阻断、终产品放行”的三级控制策略，根据风险分级选择对应控制方式：5.1源头控制，降低生成风险（1）起始原料与试剂控制：对含有仲胺、叔胺的起始物料、中间体，要求供应商控制仲胺杂质的残留水平，企业入厂检验需增加仲胺杂质检查项，符合内控限度方可投入生产；对可能含有亚硝酸盐、硝酸盐的试剂、工艺用水，严格控制亚硝酸盐残留限度，从源头减少亚硝化试剂的引入；对于辅料，若辅料生产工艺存在亚硝胺生成风险，应要求供应商提供亚硝胺杂质检测报告，符合要求方可使用。（2）回收物料控制：回收套用的溶剂、母液，每次回收后需检测亚硝胺及其前体的残留，制定残留限度，避免多次回收后累积超标；回收工艺应包含可去除亚硝胺的纯化步骤，验证去除效率，保证回收物料使用后终产品中亚硝胺符合要求。（3）交叉污染控制：共线生产多个品种时，若其中一个品种存在亚硝胺或前体残留风险，应在清洁验证中增加亚硝胺残留检查项目，验证清洁后设备表面残留符合可接受限度要求，避免交叉污染。5.2过程优化，阻断生成途径（1）工艺参数优化：调整工艺pH与加料顺序，避免胺类与亚硝化试剂在酸性条件下共存，例如可在加入亚硝酸盐后调节体系pH至碱性，分解未反应的亚硝酸盐后再加入胺类组分，减少副反应发生；严格控制亚硝化试剂的投料量，避免过量投料，减少残留。（2）纯化步骤验证：在工艺中设置针对性的纯化步骤去除亚硝胺杂质，例如利用亚硝胺的挥发性采用蒸馏去除，利用活性炭吸附去除小分子亚硝胺，通过重结晶分离去除亚硝胺；需通过加样回收试验验证纯化步骤对亚硝胺杂质的去除效率，证明至少可将亚硝胺降低至可接受限度的50%以下，保证终产品符合要求。（3）关键工艺参数控制：将pH值、反应温度、加料顺序、亚硝化试剂投料量、纯化步骤的关键参数列为关键工艺参数，规定其可控范围，生产过程中严格监控，避免工艺漂移导致亚硝胺杂质升高。5.3终产品控制，保障用药安全根据风险分级制定终产品控制要求：①高风险品种：必须将亚硝胺杂质检查项纳入终产品质量标准，明确可接受限度，每批产品放行前需进行检验，符合限度方可放行；②中风险品种：无需将亚硝胺杂质订入放行检验标准，但需建立内控限度，每年至少抽取3个生产批次进行全项检测，开展年度趋势分析，若检测结果超过内控限度或呈现逐年升高趋势，立即开展调查，调整风险分级与控制策略；③低风险品种：无需常规检测，留存风险评估资料即可。若原料药已对亚硝胺杂质进行有效控制，制剂生产过程中不存在新生成亚硝胺的条件，制剂无需单独控制亚硝胺杂质；若制剂生产过程中引入新的前体或存在生成亚硝胺的条件，需在制剂终产品中增加亚硝胺杂质控制。6分析方法开发与验证亚硝胺杂质为痕量杂质，含量通常在μg/g级别，对分析方法的灵敏度、专属性要求较高，开发与验证需符合以下要求：6.1方法开发要点（1）样品前处理：根据亚硝胺的极性、溶解性选择提取方式，复杂基质（如制剂）需采用固相萃取（SPE）、液液萃取等方式进行净化，去除基质干扰；前处理过程中需加入氨基磺酸等淬灭剂，淬灭体系中残留的亚硝酸盐，避免前处理过程中亚硝酸盐与仲胺反应生成亚硝胺，导致结果假性偏高；亚硝胺对光敏感，前处理全过程需避光操作，避免亚硝胺光解导致结果偏低。（2）检测方法选择：根据亚硝胺的挥发性、热稳定性选择合适的检测方法：①气相色谱-质谱联用法（GC-MS）：适用于挥发性、热稳定的小分子亚硝胺，可采用选择离子监测（SIM）模式提高灵敏度，痕量检测推荐采用GC-MS/MS串联质谱法，提高专属性，降低基质干扰；②液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）：适用于极性大、热不稳定的亚硝胺，无需衍生化，直接进样检测，灵敏度高、专属性强，为目前亚硝胺杂质检测的首选方法；③比色法、薄层法等灵敏度较低，仅可用于半定量，不推荐用于终产品痕量亚硝胺的定量检测。6.2方法学验证按照ICHQ2（R1）《分析方法验证指导原则》要求开展验证，针对痕量检测的特点，重点关注以下项目：（1）灵敏度：定量限应不高于可接受限度的30%，保证能够准确测定低于限度的杂质含量；检测限应不高于可接受限度的10%。（2）专属性：考察空白溶剂、空白基质对亚硝胺检测的干扰，目标峰附近无干扰峰，专属性符合要求。（3）准确度：采用加样回收法考察，在定量限、100%限度、150%限度三个水平进行加样回收，回收率应在70%~130%范围内，RSD不大于20%。（4）基质效应：采用柱后注射法或者基质匹配标准曲线法考察质谱检测的基质效应，基质效应在80%~120%范围内为可接受，若基质效应明显，应采用基质匹配标准曲线校正或者优化前处理方法去除基质干扰。（5）稳定性：考察样品溶液、标准品溶液在室温、冷藏条件下的稳定性，稳定时间应满足检测周期的要求，保证检测结果准确。所有亚硝胺检测需使用经标定的标准品，优先使用法定标准品，自制工作标准品需进行结构确证与纯度标定，纯度满足定量要求方可使用。7注册申报与上市后管理要求7.1注册申报要求：①创新药：临床试验申请阶段需完成亚硝胺杂质风险评估，高风险品种需完成初步方法学与杂质含量研究；上市申请阶段需提交完整的风险评估报告、方法学验证资料、多批次检测数据、控制策略，将亚硝胺杂质纳入质量标准。②仿制药：上市申请阶段需按照本指导原则要求完成全部亚硝胺杂质研究，提交完整研究资料，符合限度