《核医学检查技术》课件-第5章 体外标记免疫分析

第五章体外标记免疫分析能力目标掌握标记免疫分析的质量控制指标和方法（精密度、准确度）；熟悉竞争性（RIA）和非竞争性（IRMA）免疫分析的基本原理；了解标记免疫分析的主要类型（酶免疫、化学发光等）。能理解RIA剂量反应曲线的含义；会应用质控指标评价实验结果；能分析实验误差的可能来源。培养严谨求实的科学态度，树立质量控制和标准化操作的意识，理解准确可靠的检验结果对临床决策的重要性。学习目标知识目标能力目标素质目标能力目标知识目标力目标素质目标难点重点1.竞争性与非竞争性免疫分析原理1.理解精密度与准确度的区别与联系。重点难点案例导入某实验室在进行甲胎蛋白（AFP）的放射免疫分析时，同一样品重复测量的结果差异很大，变异系数（CV）超过20%。同时，该实验室参加室间质评的结果显示其测定值普遍低于靶值。请分析，该实验室的检测方法可能存在什么问题？RIA：待测物+标记抗原+限量抗体标记抗原-抗体复合物+游离的标记抗原/非标记抗原（待测物），测定值与待测标本成反比。IRMA:抗原(待测物)+过量标记抗体标记抗体-抗原复合物+游离的标记抗体，测定值与待测标本成正比。LIA的基本原理竞争性结合非竞争性结合测定值测定值第一节

标记免疫分析的基本原理（一）RIA的原理RIA是基础。放射免疫分析（RIA）是创建最早、最具有代表性的一种标记免疫分析法。基本原理是竞争性抑制的结合反应。放射性核素125I作为标记物。反应式：*Ag+Ag+Ab（限量）*Ag-Ab+Ag-Ab+*Ag/AgAb数量必须是有限（固定）的，即：

Ab<*Ag+Ag。*Ag和Ag具有相同的免疫活性，与Ab具有相同的竞争结合能力。竞争性结合是可逆的动态平衡过程，当*Ag和Ab为恒定时，其结合率与Ag（待测标本）量成反比。一、放射免疫分析法第一节

标记免疫分析的基本原理（一）RIA的原理*Ag和Ag与Ab<竞争性结合是动态可逆的RIA剂量反应曲线插图横坐标：待测物的量纵坐标：*Ag-Ab结合率第一节

标记免疫分析的基本原理

标记物与被测物之间的函数关系可以用标准竞争抑制曲线（标准曲线）来表示。制作方法：将药盒中一系列已知浓度（递增）的标准品抗原（标准品），分别加入相应的试管；加入固定量的*Ag和Ab；待竞争结合反应达到平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分；用放射性测量仪（γ-计数仪）测定*Ag-Ab。（B）或游离*Ag（F）的放射性，在坐标纸或计算机拟合曲线。（二）RIA的方法γ-免疫计数仪γ-计数仪：实际测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数，单位为：cpm（countsperminute）或者cps（countspersecond）。第一节

标记免疫分析的基本原理放免分析的三大试剂：

特异性抗体（Ab)；标准品抗原(Ag)；标记抗原(*Ag)；此外，还需有将B（

结合的*Ag-Ab）、F（

游离的*Ag/Ag）分开的分离试剂。因此，放免法就是三大试剂+一大分离试剂（方法）。RIA试剂盒组成第一节

标记免疫分析的基本原理二、

非竞争性标记免疫分析免疫放射分析（IRMA）是经典的非竞争性标记免疫分析。基本原理：抗原（待测物）与过量的特异性抗体（放射性核素（125I））间进行的的免疫结合。待测物与特异性抗体进行全量反应。反应式：Ag+*Ab（过量）Ag-*Ab+*Ab（一）IRMA的原理：第一节

标记免疫分析的基本原理（二）IRMA的方法：单位点法双位点法（双抗夹心法）：形成“固相抗体-待测抗原-标记抗体（125I）”夹心复合物---灵敏度更高测量复合物的放射性计数待测抗原的含量，测量值与待测物含量成正相关。IRMA标准曲线示意图第一节

标记免疫分析的基本原理标记免疫分析的基本试剂

和基本技术第二节标准品（标准抗原）特异性抗体标记品分离技术测量技术数据处理一、基本试剂和技术：基本试剂技术第二节

标记免疫分析的基本试剂和基本技术1.标准品和质控品：也是标准抗原，是定量标准，是检测值准确性的重要保障。化学结构与待测物完全相同；纯度高、杂质低；含量要准确，符合国际/家/企业标准；不易变质、不易降解。质量要求：第二节

标记免疫分析的基本试剂和基本技术2.特异性抗体：其质量的高低直接影响免疫分析的灵敏度和准确性，是LIA的关键。滴度高（效价高）：抗体实际应用时的稀释倍数。特异性强：决定结果的准确性。亲和力大：绝对测验方法的灵敏度。质量要求：第二节

标记免疫分析的基本试剂和基本技术3.标记品（示踪剂）：是标记分析中可测量的信号来源，可以是标记抗原/抗体，大多以125I作为标记品。比活度高：单位物质的放射性强度高。纯度高：放射化学纯度>95%。保持原有的免疫活性。稳定性好：不易脱标或自分解。基本要求：第二节

标记免疫分析的基本试剂和基本技术4.分离技术：是将免疫反应的结合部分（B）与游离部分（F）进行有效分开的方法，

是LIA中最关键的技术。B和F的分离完全，且不干扰原来的结合反应。非特异性结合率低：<5%。分离所得要便于测量分析。分离效果不受环境的影响：温度、时间、PH等。分离剂易得、操作简单、价格低廉。基本要求：目前γ免疫计数器测量仪已全面实现了智能化、自动化，减少了的误差、确保了结果的准确性和及时性。第二节

标记免疫分析的基本试剂和基本技术学思践误案例：“韩春雨事件”的警示河北科技大学韩春雨的基因编辑论文因数据无法重复而撤稿，暴露出科研诚信的缺失。反观体外免疫分析，结果的重复性是诊断的基础，造假将误导临床。思政点：警示学生坚守科研诚信底线，实验结果必须真实可靠。第三节

标记免疫分析的类型放射性核素标记（放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析等）；非放射性核素标记（酶标记、荧光标记、化学发光、电化学发光和基因芯片、蛋白芯片技术）；一、

放射性核素标记免疫分析RIA和IRMA比较1）示踪剂不同（标记抗原和标记抗体）；2）IRMA较RIA反应速度快，灵敏度高，标准曲线工作范围宽，特异性好，稳定性好；3）IRMA需要具有两个决定族的抗原，应用限于肽类和蛋白质，不能用于短肽或其他小分子半抗原活性物质的测定；4）RIA适合一切小分子半抗原及大分子化合物。第三节

标记免疫分析的类型放射性核素标记法的优点灵敏度高；特异性强；应用范围广泛；操作简单，一次能分析大量标本；标本和试剂用量少、反应时间短、价格便宜；属体外分析技术，患者无任何辐射危害；实验过程全智能化、自动化。第三节

标记免疫分析的类型放射性核素标记法的缺点射性物质的使用限制。（试剂盒含微量放射性，对操作人员及环境有微量辐射污染的可能）货架期较短。（2个月左右）标准品的批间差异较大，标准曲线同批次有效。少数项目反应时间过长（RIA）。第三节

标记免疫分析的类型二、非放射性核素标记免疫分析技术1）酶标记免疫分析技术（EIA）2）时光分辨荧光免疫分析（TrFIA）；3）发光标记免疫分析（化学发光标记免疫分析、化学发光酶免疫分析、电化学发光免疫分析）；4）蛋白质芯片或基因芯片技术。第三节

标记免疫分析的类型三、化学发光标记免疫分析（CLIA）1）用化学发光剂直接标记抗原或抗体2）化学发光免疫分析与RIA或IRMA是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和最成熟的检测方法；3）继承了放射性核素标记免疫的所有优点，克服其缺点，是临床上标记免疫分析技术最理想的方法；4）灵敏度高、特异性强、实验过程快速、自动化程度高、重复性稳定性好。第三节

标记免疫分析的类型系统误差：固定的缺陷所造成的整批样品的测定值偏向一侧。

偏差%=X100随机误差：偶然因素造成的测定结果误差。目的：保证医疗质量和医疗安全，为临床提供准确、及时和可靠的诊疗信息。分析误差：指分析技术所给出的测定值和样品真值之间的差距。差距越小，正确性越高。一、质量控制的目的真值真值—测定值真值测定值第四节

标记免疫分析的质量控制二、检测过程中常见的误差及比例第四节

标记免疫分析的质量控制精密度：在一定条件下，同一测定方法对检测样品进行多次重复测定时，所得测定结果之间的一致性。（批内变异系数<15-20%，批间变异系数<25-30%）准确度：指测量结构与被测量真值之间的一致程度。（回收率的希望值90-110%；健全性（可靠性）：药盒的参考标与被测物有相同的免疫化学性质。）灵敏度：指测定方法的最小检测值。特异性：交叉反应越小，特异性越强。稳定性：保证测定结构的连续性和可比性。三、质量控制的评价指标第四节

标记免疫分析的质量控制四、质量控制的评价体系实验室内部质量控制（IQC）：分为实验前、实验中、实验后质控。IQC是每个实验室都需要做的，是其检测结果的准确性、连续性和可比性的重要保障。实验室外部质量控制(EQC)：也称室间质控，由行业质量控制中心组织实施。EQC是建立在IQC基础上，帮助各个实验室之间的检查结果进行校正，对检查结果互认具有重要意义。好的质量控制三要素：正确的质控品；合理的测定方式及相应工具；合适的结果评价及判定方式。建议采用风险管理减少误差，改进和控制质量。第四节

标记免疫分析的质量控制1．整理（seiri）：腾出空间、空间活用、防止误用、打造清爽、整洁的工作场所；2．整顿（seiton）：工作场所一目了然、缩短寻找物品的时间、整齐的工作环境、消除过多的积压物品；3．清扫（seiso）：将工作场所内清扫干净，保持工作场所干净、亮丽；4．清洁（seiketsu）：维持上面3S成果；5．素养（shitsuke）：培养好习惯、遵守规则、营造团队精神；6．安全（safety）：建立起安全生产的环境、所有的工作应建立在安全的前提下。五、IQC的风险管理：6S管理第四节

标记免疫分析的质量控制室间质评证书

评价实验室的检测能力；识别问题并采取相应的改进措施 改进分析能力和实验方法；确定重点投入和培训要求；实验室质量的客观证据；支持实验室认可；增加实验室用户的信心；实验室质量保证的外部监督工具。六、室间质量（EQC）评价的作用第四节

标记免疫分析的质量控制七、ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》第四节

标记免疫分析的质量控制第四节

标记免疫分析的质量控制LIA与人工智能的结合，放射性核素体外分析实验室实现了全自动化流水线作业，规范化、规模化的运行也日益成熟。LIA在现代精准医疗中发挥着重要作用，在疾病的早期诊疗中具有其独特的、不可或缺的重要价值。非放射性标记免疫分析因成本较高，目前应用较少；但因其受人为因素少、自动化程度高、试剂稳定性好等优点，是LIA以后发展的重要方向。第五节

标记免疫分析的应用与展望知识链接临床实验室标准化协会：(查看实验室标准)丁香园检验医学版块：检验.丁香园.com(同行交流)知识拓展化学发光的胜利：尽管放射免疫分析（RIA）是标记免疫分析的鼻祖，并获得了诺贝尔奖，但如今在临床实验室中，它已基本被化学发光免疫分析（CLIA）所取代。CLIA使用化学发光剂（如吖啶酯）标记抗原或抗体，通过化学反应直接发光，无需放射性核素。它具有无放射性污染、试剂稳定期长、自动化程度高、检测速度快等巨大优势，成为现代临床免疫检测的主流技术。这体现了科学技术在追求更安全、更高效、更环保方向上的不断进步。任务测试简答题：简述精密度和准确度的区别。答案：精密度反映的是多次测量结果之间的一致性或重复性，描述了随机误差的大小。准确度反映的是测量结果与真值的接近程度，描述了系统误差和随机误差的综合效应。真题再现单选题：放射免疫分析（RIA）的基本原理是（

）。A.非