基因治疗产品毒理学研究指南（试行）

基因治疗产品毒理学研究指南（试行）1范围与适用对象本指南为基因治疗产品毒理学研究的通用性技术指导原则，适用于各类用于人类疾病预防与治疗的基因治疗产品，包括但不限于：体内给药的病毒载体类基因治疗产品、非病毒载体类基因治疗产品、mRNA类基因治疗产品、基因编辑产品；体外基因改造的基因修饰细胞治疗产品。本指南基于当前对基因治疗产品的科学认知制定，注册申请人可根据产品具体特征，基于科学风险原则调整研究内容，本指南不具有强制约束力，若采用替代研究方法，需充分论证科学性与合理性，监管机构认可基于风险的科学调整。2毒理学研究基本原则2.1风险导向原则根据基因治疗产品的载体类型、作用机制、给药途径、靶组织分布、基因组整合风险、目的基因功能、临床人群特征等，差异化设计毒理学研究内容，重点针对产品特有的安全性风险开展研究，不采用一刀切研究要求：如整合型载体需重点评估插入突变与致癌风险，非整合型载体重点评估免疫毒性与急性/亚慢性毒性，基因编辑产品重点评估脱靶效应风险。2.2循序渐进原则毒理学研究需与产品研发阶段相匹配，分阶段逐步完善研究内容，避免过早开展不必要的大规模长期毒理学研究：首次人体临床试验前需完成核心安全性评价，排除重大安全性风险；临床试验阶段逐步补充迟发性毒性、特殊毒性研究；上市申请前完成所有要求的毒理学研究。2.3种属匹配原则选择对载体感染性、目的基因功能、靶组织反应性与人体一致的试验系统，优先选择能模拟人体毒性反应的试验模型，若产品存在严格种属特异性，常规啮齿类/非啮齿类不适用，可采用基因人源化模型、人源化组织嵌合模型，充分论证模型合理性后可减少试验动物种属数量。2.4样品可比原则毒理学研究采用的试验样品，其处方、工艺、载体设计、纯度、杂质水平、活性需与临床试验拟用样品、上市样品一致，若存在差异需开展桥接研究，论证样品差异不会改变安全性特征，避免因样品不一致导致毒性评价偏差。3毒理学研究设计基本要素3.1试验系统选择3.1.1实验动物常规毒性试验需采用至少两种相关种属动物，即1种啮齿类动物（小鼠、大鼠）+1种非啮齿类动物（优先非人灵长类NHP），符合以下情况可仅采用1种合适种属：产品存在严格种属特异性，仅能感染/转染人源化组织，常规动物不支持目的基因表达，可仅采用匹配的人源化模型，充分说明理由。根据产品特征选择合适的动物背景：一般需采用免疫健全动物，避免低估免疫原性毒性；若产品用于免疫缺陷人群，可增加免疫缺陷动物试验补充评价。针对儿童用药，需考虑选择年龄匹配的幼年动物开展发育相关毒性评价。3.1.2体外试验系统早期筛选阶段需开展体外毒性预试验，评估细胞毒性、转染效率、基因组整合频率、脱靶效应、细胞转化潜能，为体内试验设计提供依据，降低体内试验的不确定性。3.1.3人源化模型对于种属特异性强的产品，如仅能感染人肝细胞的AAV、针对人靶点的CAR-T细胞，推荐采用肝脏人源化小鼠、造血免疫系统人源化小鼠、基因人源化模型，提高毒性评价的准确性，减少外推风险。3.2给药设计3.2.1给药途径毒理学试验给药途径必须与临床拟用途径完全一致，不得更改；局部给药（如眼内注射、颅内注射、关节腔注射、肿瘤内注射）需严格模拟临床的给药部位、给药体积、给药速度，保证暴露水平与临床一致。3.2.2给药剂量设置需至少设置3个剂量组+1个阴性对照组，必要时设置阳性对照组：高剂量需达到至少10倍于临床拟用的人体暴露量，或产生可观察的毒性反应，或达到制剂的最大可行浓度/体积（最大可行剂量MFD）；低剂量设置为接近或略高于临床拟用剂量；中剂量为高低剂量之间的合理梯度，用于观察剂量-毒性反应关系。阴性对照组需给予对应空载体、溶媒或安慰剂，与试验组保持一致的给药操作。3.2.3给药次数临床拟单次给药的基因治疗产品，毒理学试验采用单次给药；临床拟多次给药的产品，需按照临床给药间隔开展多次给药毒性试验，充分评估多次给药的免疫原性蓄积毒性。3.3观察周期基因治疗产品的目的基因通常持续表达，毒性可延迟出现，观察周期需足够覆盖毒性发生与发展过程：常规单次给药毒性试验观察周期不少于3个月；存在整合风险、致癌风险的产品观察周期不少于6个月，啮齿类致癌性试验观察周期为2年，非人灵长类长期毒性观察周期可延长至12个月；观察期间需持续监测毒性反应，直至毒性达峰或稳定，明确毒性是否可逆。3.4核心检测指标所有试验需常规检测以下指标：①一般临床指标：体重、饮食、临床体征、活动度、死亡率；②临床病理学指标：血常规、血生化、凝血功能、尿常规；③分子生物学指标：不同组织中载体基因组拷贝数、目的基因表达量、载体组织分布、转染/编辑效率；④免疫原性指标：抗载体抗体滴度与中和活性、抗目的蛋白抗体、细胞因子水平（IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等）、特异性细胞免疫反应；⑤组织病理学指标：所有主要脏器、给药部位、载体高富集组织（如肝脏、脾脏、淋巴结、靶组织）的完整组织病理学检查，明确炎症、坏死、增生等病变。4不同研发阶段的毒理学研究要求4.1首次人体临床试验（IND申请）阶段本阶段需完成核心安全性研究，排除不可接受的人体风险，需完成以下研究：①单次/多次给药毒性试验，至少采用1-2种匹配种属，观察周期不少于3个月；②局部耐受性试验，局部给药产品必须完成；③免疫原性与急性免疫毒性初步评估，明确是否存在严重细胞因子风暴、全身炎症风险；④载体组织分布与整合特征初步分析，整合型产品需完成初步整合位点分析；⑤基因编辑产品需完成初步脱靶效应评估；⑥遗传毒性初步试验。符合以下情况可将部分研究延后至临床试验阶段：适应症为危及生命且无有效治疗手段的疾病，或无生殖细胞暴露风险的产品，可将长期致癌性试验、生殖发育毒性试验延后至II期临床后或上市前完成；需充分论证延后的合理性，制定后续研究计划。4.2II期临床试验前阶段需补充完成以下研究：①延长观察周期的毒性试验数据，明确迟发性毒性的发生发展与可逆性；②全面的免疫毒性评估，包括长期免疫反应、自身免疫反应风险评估；③整合型产品完成全基因组整合位点分析与克隆扩增监测；④基因编辑产品完成全基因组范围的脱靶效应与染色体结构异常分析；⑤若临床拟扩大适用人群至育龄人群、儿童，需补充完成对应生殖发育毒性、幼年动物毒性研究。4.3上市申请（NDA/BLA）阶段需完成所有计划的毒理学研究，提交完整的毒性数据与风险评估报告，包括：完整的单次/多次给药长期毒性数据、完整的免疫原性与免疫毒性数据、完整的基因组整合/脱靶效应分析数据、致癌性/致瘤性数据（若适用）、生殖发育毒性数据（若适用），所有数据需支持产品在拟定人群用药的安全性。5不同类型基因治疗产品的特殊毒理学考虑5.1病毒载体类基因治疗产品5.1.1整合型病毒载体（γ逆转录病毒、慢病毒等）核心风险为插入突变与致癌风险，毒理学需重点开展：①全基因组整合位点分析，明确整合位点是否富集于癌基因、抑癌基因区域，整合热点分布；②动态监测不同时间点整合克隆的扩增情况，识别是否存在优势克隆扩增，优势克隆扩增提示插入突变带来细胞增殖优势，存在明确致癌风险；③啮齿类2年致癌性试验，非人灵长类延长观察周期至12个月，明确长期致癌风险。5.1.2非整合型病毒载体（AAV、腺病毒、痘病毒等）非整合型载体基因组整合频率约为0.1%-1%，毒理学重点关注：①免疫原性毒性：腺病毒、痘病毒会诱导强烈先天免疫反应，需重点监测给药后细胞因子风暴、全身炎症反应；AAV需重点监测抗衣壳抗体介导的肝损伤，预存抗体与诱导产生的抗体对转染效率和组织毒性的影响；②肝脏毒性：大部分病毒载体肝脏富集，需动态监测肝功能与肝脏组织病理学变化，明确肝脏损伤的剂量效应关系；③整合风险分析：需定量检测低频整合的频率与位点分布，排除优势整合入致癌相关区域的风险，AAV需重点评估末端反向重复序列整合入基因组的风险。5.2非病毒载体类基因治疗产品（LNP-mRNA、质粒DNA、阳离子聚合物等）核心风险为载体本身毒性与免疫激活，毒理学重点关注：①载体组分毒性：LNP的脂质组分、阳离子聚合物需评估肝毒性、蓄积毒性、补体激活相关过敏反应，部分阳离子脂质会导致剂量依赖性肝损伤，需明确无可见有害作用水平（NOAEL）；②免疫激活风险：mRNA、质粒DNA可激活TLR等先天免疫受体，需动态监测细胞因子与炎症反应，评估全身炎症风险；③目的蛋白毒性：mRNA瞬时高表达目的蛋白，需评估过量表达带来的功能毒性，如表达凝血因子需评估血栓风险；④整合风险：质粒DNA需检测基因组整合频率，评估插入突变风险。5.3基因编辑产品（ZFN、TALEN、CRISPR-Cas等）核心风险为脱靶效应与染色体结构异常，毒理学重点关注：①脱靶效应检测：必须采用无偏向性全基因组脱靶检测技术（如GUIDE-seq、Digenome-seq、全基因组测序），禁止仅采用生物信息学预测位点开展脱靶验证，需定量计算各脱靶位点的编辑频率，评估脱靶位点是否位于功能基因、癌基因/抑癌基因区域；②染色体结构异常评估：重点检测编辑位点附近的大片段缺失、重复、易位、倒位等结构变异，定量分析变异频率，评估结构变异的致癌风险；③持续表达风险：若编辑工具通过病毒载体递送，编辑酶持续表达会增加脱靶积累，需延长观察周期，监测长期脱靶积累风险；④生殖系暴露风险：若产品给药后编辑工具可到达生殖腺，需检测生殖细胞中的编辑事件，评估生殖系遗传风险。5.4体外基因修饰细胞治疗产品（CAR-T、基因修饰造血干细胞等）核心风险为插入突变致瘤性、免疫相关毒性，毒理学重点关注：①基因修饰部分的安全性：整合型载体需完成全基因组整合位点分析，评估插入突变风险；②免疫相关毒性：采用人源化免疫系统模型评估CAR-T等产品的细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性、移植物抗宿主病（GVHD）风险；③致瘤性评估：体外需开展细胞转化试验，体内需开展免疫缺陷小鼠致瘤试验，观察至少6个月，明确修饰后细胞是否存在成瘤潜能，对于长期存活体内的修饰细胞，需延长观察周期至1年以上，监测克隆扩增与转化。6关键毒理学研究项目设计要点6.1免疫原性与免疫毒性研究全程动态监测抗载体抗体、抗目的蛋白抗体的滴度与中和活性，分析抗体产生对目的基因表达、组织损伤的影响；给药后1h、6h、24h、7d等多个时间点检测细胞因子、补体激活产物，评估急性细胞因子风暴风险；检测特异性T细胞反应，评估适应性免疫对转染细胞的清除作用与组织损伤，监测自身抗体与自身反应性T细胞，评估自身免疫风险。6.2致癌性/致瘤性研究采用风险分层开展研究：高风险产品（整合型载体、基因编辑产品存在高频致癌位点脱靶、体外修饰造血干细胞）必须开展啮齿类2年致癌性试验，必要时非人灵长类延长观察；中低风险产品（非整合型AAV、LNP-mRNA）可基于整合分析、脱靶分析数据开展风险评估，若整合频率极低、无致癌位点富集，可免做完整2年致癌性试验；体外修饰细胞需完成体外细胞转化试验+体内免疫缺陷小鼠致瘤试验，观察周期不少于6个月。6.3生殖与发育毒性研究基于暴露风险开展研究：若产品给药后载体/编辑工具可到达生殖腺，或临床拟用于育龄人群，需开展生育力与早期胚胎发育毒性试验、胚胎-胎仔发育毒性试验，必要时开展围产期毒性试验；若产品适应症仅用于绝经期女性，或经评估无生殖细胞暴露风险，可免做或延后至上市后研究；靶组织为生殖系统的产品，必须检测生殖细胞中的整合/编辑事件，评估生殖系遗传风险。6.4局部耐受性研究局部给药产品必须开展局部耐受性研究，观察给药后不同时间点局部组织的炎症反应、坏死、纤维化、功能损伤，如颅内给药需评估神经毒性，眼内给药需评估视网膜、视神经损伤，关节腔给药需评估滑膜损伤，通过组织病理学明确局部毒性的程度与可逆性。7毒理学结果分析与评价7.1毒性反应判定：基于剂量-反应关系、时间-反应关系，与对照组比较判定毒性反应的性质、程度，明确毒性是否可逆，确定NOAEL。7.2人体风险外推：结合动物试验数据，外推人体用药的安全性风险，重点分析高风险毒性（如致癌、脱靶、插入突变）在人体发生的概率与严重程度，若动物中观察到的严重毒性具有人体相关性，需评估是否可接受。7.3临床剂量确定：毒理学数据是临床起始剂量确定