解析胸膜肺炎放线杆菌QseB-QseC双组分调控系统突变株：构建、特性与致病关联

解析胸膜肺炎放线杆菌QseB/QseC双组分调控系统突变株：构建、特性与致病关联一、引言1.1研究背景胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）是一种对养猪业危害极大的病原菌，可引发猪传染性胸膜肺炎（PorcineContagiousPleuropneumonia，PCP）。PCP是一种高度接触传染性呼吸道疾病，主要特征为胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎。感染后的猪只常常出现发热（体温可升高至41-42°C）、精神沉郁、食欲减退、频繁咳嗽（咳嗽时站立不动，拱背收腹，伸长头颈，头下垂，用力咳嗽，常咳出血色泡沫样黏液）、呼吸困难（呼吸急促，呈腹式呼吸，严重时张口喘气，呈犬坐姿势）、耳部、鼻端、四肢及腹部皮肤出现紫红色斑块（指压不褪色），母猪还可能发生流产等症状。若不及时治疗，死亡率可达50%以上，给全球养猪业带来了沉重的经济负担。双组分调控系统（Two-ComponentRegulatorySystem，TCS）广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中。作为一种重要的信号传递系统，TCS由位于细胞膜上的组氨酸激酶（HistidineKinase，HK）和细胞质中的反应调节蛋白（ResponseRegulator，RR）组成。当细菌感知到外界环境信号（如营养物质的变化、渗透压、温度、群体感应信号、抗生素等）时，组氨酸激酶发生自磷酸化，将磷酸基团从ATP转移到自身的组氨酸残基上，随后磷酸基团被转移到反应调节蛋白的天冬氨酸残基上，使反应调节蛋白活化，进而调控相关基因的表达，以适应环境变化或行使特定的生物学功能。TCS参与调控细菌的致病性、生长代谢、耐药性、毒力因子表达等多种重要生物学过程。在胸膜肺炎放线杆菌中，QseB/QseC双组分调控系统是其中关键的调控系统之一。QseB/QseC系统可以严格调控胸膜肺炎放线杆菌对外界环境的适应能力，在营养物质匮乏、渗透压改变等环境压力下，通过调控相关基因表达，帮助细菌更好地存活。同时，该系统还在促进胸膜肺炎放线杆菌在宿主体内的存活和繁殖方面发挥重要作用，比如调节细菌对宿主细胞的黏附、侵袭以及在宿主体内的定殖等过程。尽管目前已经对QseB/QseC系统的基本机制和调控方式开展了一些研究，但对于该系统某些突变株的功能特性了解仍然有限，深入研究QseB/QseC突变株对于全面揭示胸膜肺炎放线杆菌的致病机制和环境适应性具有重要意义。1.2研究目的和意义本研究旨在通过构建胸膜肺炎放线杆菌QseB/QseC双组分调控系统的突变株，深入探究该系统在细菌生长、代谢、环境适应以及致病过程中的具体功能，为揭示胸膜肺炎放线杆菌的致病机制和环境适应性提供关键理论依据。胸膜肺炎放线杆菌作为一种对养猪业危害极大的病原菌，其致病机制的复杂性给疾病防控带来了巨大挑战。目前，虽然对该菌的一些毒力因子和致病相关基因有了一定了解，但对于QseB/QseC双组分调控系统在其中的作用机制仍有待深入研究。通过构建突变株并研究其功能，可以更直接地揭示QseB/QseC系统对细菌生物学特性的影响，填补这一领域在分子机制研究上的部分空白。这不仅有助于深入理解胸膜肺炎放线杆菌的致病过程，还能为开发新型诊断方法、治疗策略以及疫苗提供新的靶点和思路。在防控方面，了解QseB/QseC突变株的特性有助于优化现有的防控措施。如果能够明确该系统在细菌耐药性、毒力表达等方面的作用，就可以针对性地研发更有效的抗菌药物和疫苗，提高防控效果，减少猪传染性胸膜肺炎的发生和传播，降低养猪业的经济损失。此外，对于保障猪肉食品安全和公共卫生安全也具有重要意义，因为减少动物疫病的发生可以降低人畜共患病的风险，保障人类健康。二、胸膜肺炎放线杆菌及双组分调控系统QseB/QseC概述2.1胸膜肺炎放线杆菌2.1.1病原学特征胸膜肺炎放线杆菌（APP）呈多形态的小球杆菌状，革兰氏染色呈阴性。在显微镜下观察，其菌体形态多样，有时呈短杆状，有时近似球状，且大小不一，通常直径在0.2-0.5μm，长度在0.5-2.0μm。病料中的胸膜肺炎放线杆菌具有两极着色的特点，即菌体两端颜色较深，中间较浅，这一特征有助于在实验室诊断中初步识别该菌。APP具有荚膜，荚膜主要由多糖组成，能够保护细菌免受宿主免疫系统的攻击，增强细菌的致病性。该菌为兼性厌氧菌，在有氧和无氧环境下均能生长，但在微需氧环境中生长更为良好。其生长需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），根据在体外培养时对NAD的需求不同，可将APP分为生物Ⅰ型（NAD依赖型）和生物Ⅱ型（NAD不依赖型）。在巧克力琼脂培养基或含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上，37℃、5%-10%CO₂条件下培养24-48小时后，可形成湿润、光滑、隆起、边缘整齐的小菌落，直径约1-2mm。不同血清型的菌落可能在形态和颜色上存在一定差异，部分血清型的菌落可能呈现灰白色，而有的则略带黄色。此外，APP在含有抗生素的培养基上生长可能受到抑制，这为筛选和鉴定该菌提供了一定的依据。2.1.2流行现状与危害胸膜肺炎放线杆菌在全球范围内广泛分布，给养猪业带来了巨大的经济损失。在欧洲、美洲、亚洲等主要养猪地区，猪传染性胸膜肺炎均时有发生。在我国，近年来随着养猪业规模化和集约化程度的不断提高，APP的感染率和发病率也呈上升趋势。华中农业大学动物疫病诊断中心在2019年1月至2024年6月，对湖北、河南和河北等22个省322个猪场938头带有明显呼吸道症状的猪只进行细菌分离鉴定，猪只APP阳性率为4.05%。XiangfeiXu等在2019年1月至2021年9月对浙江省及周边省份85个猪场526份样本进行细菌分离鉴定，APP阳性率为8.37%。何启盖教授团队在2017-2021年对269个猪场1307头发生猪呼吸道综合征的病料进行病原分析，猪场APP检出率为10.78%，猪群APP检出率为5.43%，且APP在每年的3-4月、11-12月发病率较高。APP感染猪群后，会导致猪只生长发育受阻、饲料转化率降低、死亡率增加。急性病例死亡率高达80%-100%，慢性病例生长缓慢，日增重降低了33.6%，饲料利用率下降0.77%-25.5%。除了直接导致猪只死亡和生长性能下降外，该病还常与猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病等病毒病和细菌病发生混合感染，进一步加重病情，增加治疗难度和成本。此外，患病猪只的肉品质下降，也会影响市场销售和经济效益。从公共卫生角度来看，虽然APP主要感染猪，但也有极少数人感染的报道，这提示我们需要重视其潜在的公共卫生风险。2.1.3发病机制APP主要通过空气飞沫传播，经呼吸道感染猪只。当健康猪吸入含有APP的飞沫后，细菌首先黏附在呼吸道黏膜上皮细胞表面。APP具有多种参与黏附的毒力因子，如菌毛、黏附素等。菌毛是一种细长的蛋白质结构，能够帮助细菌与宿主细胞表面的受体结合，增强细菌的黏附能力。黏附素则可以特异性地识别并结合宿主细胞表面的糖蛋白或糖脂，使细菌牢固地附着在呼吸道黏膜上。一旦黏附成功，APP便开始侵入宿主细胞。细菌利用自身的侵袭素等毒力因子，通过受体介导的内吞作用进入细胞内部。进入细胞后，APP在细胞内大量繁殖，逃避宿主免疫系统的清除。APP能够分泌多种毒力因子，如外毒素（Apx）、脂多糖（LPS）、蛋白酶、脲酶、铁获取蛋白和参与厌氧呼吸的酶等。其中，外毒素Apx是参与胸膜肺炎发病的主要毒力因素。不同血清型的APP可产生不同类型的Apx毒素，如ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ，这些毒素具有细胞毒性、溶血性等多种生物学活性。Apx毒素可以破坏宿主细胞的细胞膜、线粒体等细胞器，导致细胞死亡和组织损伤。同时，毒素还能刺激宿主免疫系统产生过度的炎症反应，引发肺部出血、水肿、纤维素性渗出等病理变化，严重影响肺部的正常功能。此外，APP还能通过调节宿主细胞的信号通路，抑制宿主细胞的凋亡和免疫应答，从而有利于细菌在宿主体内的存活和繁殖。2.2胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展胸膜肺炎放线杆菌毒力因子是其致病的关键因素，主要包括参与黏附、摄取营养、逃避宿主防御、诱导渗出以及介导病原菌在宿主持续存在的相关因子。2.2.1参与黏附的毒力因子菌毛是APP重要的黏附结构，其由菌毛蛋白亚基聚合而成。不同血清型的APP菌毛结构和功能存在差异，例如血清1型APP的菌毛能特异性地结合猪呼吸道上皮细胞表面的唾液酸残基，从而介导细菌的黏附。黏附素也是一类重要的黏附因子，APP的外膜蛋白A（OmpA）具有黏附素活性，能够与宿主细胞表面的整合素相互作用，促进细菌与细胞的黏附。研究表明，缺失OmpA基因的APP突变株对猪肺泡巨噬细胞的黏附能力显著下降。2.2.2参与摄取营养物质的相关因子铁获取蛋白在APP摄取营养过程中发挥关键作用。由于宿主对细菌的铁供应进行严格限制，APP进化出多种铁获取机制。例如，APP能够分泌铁载体，如肠杆菌素等，这些铁载体可以与环境中的铁离子特异性结合，形成铁-铁载体复合物，然后通过细菌表面的特异性受体进入细胞内，为细菌提供生长所需的铁元素。此外，APP还具有血红素结合蛋白，能够从宿主血红蛋白中摄取铁，满足自身生长需求。2.2.3参与逃避宿主防御机制的毒力因子荚膜多糖是APP逃避宿主防御的重要毒力因子。荚膜能够阻碍吞噬细胞对细菌的吞噬作用，其多糖结构可以干扰吞噬细胞表面受体与细菌的识别，降低吞噬效率。研究发现，去除荚膜的APP更容易被猪肺泡巨噬细胞吞噬和清除。此外，APP分泌的蛋白酶可以降解宿主的免疫球蛋白和补体等免疫分子，削弱宿主的免疫防御能力。例如，APP分泌的IgA蛋白酶能够特异性地切割猪的IgA，使其失去免疫活性，从而帮助细菌逃避黏膜免疫的清除。2.3细菌双组分调控系统2.3.1双组分调控系统的结构与工作原理双组分调控系统（TCS）广泛存在于细菌中，是一种高度保守的信号传导机制。其基本结构由位于细胞膜上的感受器激酶（SensorKinase，SK）和细胞质中的反应调节蛋白（ResponseRegulator，RR）组成。感受器激酶是一种跨膜蛋白，其N端位于细胞外，能够感知外界环境信号，如温度、渗透压、酸碱度、营养物质浓度、群体感应信号以及抗生素等。当感受器激酶感知到特定信号后，其C端位于细胞内的组氨酸残基会发生自磷酸化，将ATP上的磷酸基团转移到自身的组氨酸残基上，从而激活感受器激酶。反应调节蛋白通常包含一个接收域（ReceiverDomain）和一个效应域（EffectorDomain）。磷酸化的感受器激酶会将磷酸基团转移到反应调节蛋白接收域的天冬氨酸残基上，使反应调节蛋白活化。活化后的反应调节蛋白通过其效应域与靶基因的启动子区域结合，调控基因的转录表达。效应域可以作为转录激活因子或转录抑制因子，增强或抑制靶基因的转录，从而使细菌能够根据外界环境变化调整自身的生理活动，以适应环境并维持生存。例如，在大肠杆菌中，EnvZ/OmpR双组分调控系统可以感知外界渗透压的变化。当外界渗透压升高时，EnvZ感受器激酶发生自磷酸化，然后将磷酸基团传递给OmpR反应调节蛋白。磷酸化的OmpR与ompC和ompF基因的启动子区域结合，抑制ompF基因的表达，促进ompC基因的表达，从而改变细胞膜上孔蛋白的组成，适应高渗透压环境。2.3.2双组分调控系统与细菌致病性的关系双组分调控系统在细菌致病性方面发挥着至关重要的作用。它参与调控细菌多个与致病性相关的过程，包括毒力因子的表达、细菌的黏附与侵袭能力、生物膜的形成以及对宿主免疫防御的逃避等。许多细菌的毒力因子表达受到双组分调控系统的严格控制。以金黄色葡萄球菌为例，其Agr双组分调控系统能够调控多种毒力因子的表达，如α-溶血素、凝固酶、蛋白酶等。在细菌生长的早期阶段，Agr系统处于低活性状态，毒力因子表达水平较低。随着细菌密度的增加，群体感应信号积累，Agr系统被激活，从而上调毒力因子的表达，增强细菌的致病性。双组分调控系统还可以影响细菌对宿主细胞的黏附与侵袭能力。幽门螺杆菌中的ArsS/ArsR双组分调控系统参与调控细菌对胃上皮细胞的黏附。研究发现，缺失ArsS或ArsR基因会导致幽门螺杆菌对胃上皮细胞的黏附能力显著下降，从而影响其在宿主体内的定殖和感染。生物膜的形成是细菌在宿主体内存活和致病的重要策略之一，双组分调控系统在其中也起着关键作用。铜绿假单胞菌的GacS/GacA双组分调控系统可以调控生物膜形成相关基因的表达。当GacS感知到特定信号并激活GacA后，GacA会调控下游一系列基因的表达，促进生物膜的形成，增强细菌对宿主免疫防御和抗生素的抵抗能力。此外，双组分调控系统还能帮助细菌逃避宿主的免疫防御。肺炎链球菌的ComD/ComE双组分调控系统可以调控细菌表面抗原的表达，使细菌能够逃避宿主免疫系统的识别和清除。通过改变表面抗原的结构或表达水平，肺炎链球菌可以降低被宿主免疫细胞识别和攻击的风险，从而在宿主体内持续生存和致病。2.3.3胸膜肺炎放线杆菌双元调控系统研究现状目前，针对胸膜肺炎放线杆菌双元调控系统的研究取得了一定进展。已有多个双元调控系统被鉴定和研究，如CpxA/CpxR、PhoQ/PhoP、TctS/TctR等。这些双元调控系统在胸膜肺炎放线杆菌的生长、代谢、环境适应以及致病过程中发挥着重要作用。例如，CpxA/CpxR双元调控系统参与调控胸膜肺炎放线杆菌的外膜蛋白表达和毒力因子分泌，影响细菌对宿主细胞的黏附与侵袭能力。QseB/QseC双组分调控系统作为胸膜肺炎放线杆菌中关键的调控系统之一，也受到了广泛关注。研究表明，QseB/QseC系统可以感知外界环境信号，如儿茶酚胺类信号分子（肾上腺素、去甲肾上腺素等）。当细菌感知到这些信号后，QseC感受器激酶发生自磷酸化，然后将磷酸基团传递给QseB反应调节蛋白。磷酸化的QseB与靶基因的启动子区域结合，调控相关基因的表达。QseB/QseC系统参与调控胸膜肺炎放线杆菌的多个生物学过程，包括毒力因子表达、细菌的运动性、铁摄取以及对宿主细胞的黏附与侵袭等。有研究发现，缺失QseB/QseC系统会导致胸膜肺炎放线杆菌的Apx毒素表达下降，对猪肺泡巨噬细胞的黏附能力减弱，在小鼠体内的致病力降低。然而，目前对于QseB/QseC系统的调控机制以及其调控的具体靶基因仍有待进一步深入研究，以全面揭示其在胸膜肺炎放线杆菌致病和环境适应中的作用。三、QseB/QseC突变株的构建3.1实验材料与方法3.1.1实验材料菌株与质粒：选用国内流行的强毒株胸膜肺炎放线杆菌血清1型SLW01菌株作为亲本菌株。大肠杆菌DH5α感受态细胞用于质粒的克隆和扩增，其具有生长迅速、转化效率高的特点，能够高效地摄取外源质粒并进行复制。自杀性质粒pEMOC2用于构建基因缺失突变株，该质粒在受体菌中不能自主复制，只有通过同源重组整合到染色体上才能稳定存在，从而实现基因的敲除。供体菌E.colip2155含有RP4质粒，具备接合转移能力，可将携带目的基因片段的自杀性质粒转移至受体菌SLW01中。主要试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒用于从SLW01菌株中提取基因组DNA，其操作简便，能够快速、高效地提取高质量的基因组DNA，满足后续实验需求。限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ等）用于切割DNA片段，具有高度的特异性，可识别特定的DNA序列并进行切割，为构建重组质粒提供所需的酶切位点。T4DNA连接酶用于连接DNA片段，能够催化双链DNA片段的5'-磷酸基团和3'-羟基末端之间形成磷酸二酯键，实现不同DNA片段的连接。PrimeSTARHSDNA聚合酶用于PCR扩增，具有高保真、扩增效率快的优点，能够准确地扩增目的基因片段。琼脂糖用于制备琼脂糖凝胶，用于DNA电泳检测，不同浓度的琼脂糖凝胶可分离不同大小的DNA片段。DNAMarker用于确定PCR扩增产物和酶切产物的大小，包含一系列已知大小的DNA片段，在电泳过程中作为分子量标准。氨苄青霉素、氯霉素等抗生素用于筛选含有重组质粒的菌株，根据不同质粒携带的抗性基因，使用相应的抗生素进行筛选，确保阳性克隆的获得。主要仪器：PCR扩增仪用于进行PCR反应，可精确控制反应温度和时间，实现DNA的扩增。高速离心机用于离心分离DNA、细菌等样品，能够快速沉淀样品，提高实验效率。凝胶成像系统用于观察和分析琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带，可拍摄清晰的图像，便于对实验结果进行判断和记录。恒温培养箱用于培养细菌，提供适宜的温度和湿度条件，促进细菌的生长和繁殖。超净工作台用于提供无菌操作环境，减少实验过程中的污染，保证实验结果的准确性。3.2QseB/QseC基因上下游片段的扩增参照Genbank中公布的胸膜肺炎放线杆菌QseB、QseC基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，用于扩增QseB/QseC基因的上下游片段。引物设计时，充分考虑引物的长度、退火温度、GC含量等因素，以确保引物的特异性和扩增效率。上游片段引物（QseB/QseC-up-F和QseB/QseC-up-R）和下游片段引物（QseB/QseC-down-F和QseB/QseC-down-R）的序列如下表1所示：表1：扩增QseB/QseC基因上下游片段的引物序列引物名称引物序列（5'-3'）QseB/QseC-up-F具体序列1QseB/QseC-up-R具体序列2QseB/QseC-down-F具体序列3QseB/QseC-down-R具体序列4以提取的SLW01基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，其中包含PrimeSTARHSDNA聚合酶2.5U，10×PCR缓冲液5μL，dNTP混合物（2.5mMeach）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。在预变性阶段，高温使DNA模板双链解开，为后续的扩增反应做好准备。变性过程中，通过短暂的高温处理，确保模板DNA完全解链。退火步骤中，引物与模板DNA特异性结合，为DNA聚合酶提供起始位点。延伸阶段，DNA聚合酶在引物的引导下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则，合成新的DNA链。循环次数的设置是为了保证目的基因片段能够得到足够的扩增。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，加入到含有溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶的加样孔中。在1×TAE缓冲液中，以120V的电压进行电泳30-40min。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照。根据DNAMarker的条带位置，判断PCR扩增产物的大小。正常情况下，应在凝胶上观察到与预期大小相符的特异性条带，分别对应QseB/QseC基因的上下游片段。若未出现条带或条带大小与预期不符，可能是引物设计不合理、PCR反应条件不合适、模板DNA质量不佳等原因导致，需要对实验条件进行优化或重新进行实验。3.3重组自杀性质粒的构建将扩增得到的QseB/QseC基因上下游片段进行回收纯化。使用DNA凝胶回收试剂盒，按照其说明书进行操作。首先将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，放入离心管中，加入适量的溶胶液，在50-60℃水浴条件下，使凝胶完全溶解。然后将溶解后的溶液转移至吸附柱中，离心，使DNA吸附在柱膜上。依次用洗涤液洗涤柱膜，去除杂质，最后用适量的洗脱缓冲液将纯化后的DNA片段洗脱下来。采用T/A克隆技术，将回收纯化后的上下游片段分别连接到pEASY-T1简单克隆载体上。连接反应体系为：pEASY-T1载体1μL，上下游片段（50-100ng/μL）各4μL，SolutionⅠ5μL，总体积10μL。轻轻混匀后，16℃连接3-4小时或4℃过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物与DH5α感受态细胞在冰上混合，静置30分钟，然后在42℃水浴中热激90秒，迅速置于冰上冷却2-3分钟。加入无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使菌体复苏。取适量转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。次日，挑取平板上的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，采用PCR鉴定和酶切鉴定相结合的方法筛选阳性克隆。PCR鉴定时，以提取的质粒为模板，使用与扩增上下游片段相同的引物进行PCR扩增。反应体系和条件与扩增上下游片段时一致。酶切鉴定则使用相应的限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ等）对质粒进行酶切，酶切体系按照限制性内切酶说明书进行配置。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR扩增出预期大小的条带，且酶切后得到与预期相符的片段，则表明阳性克隆筛选成功。将阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与Genbank中QseB/QseC基因上下游序列进行比对，确认序列的正确性。将测序正确的含有上下游片段的pEASY-T1质粒和自杀性质粒pEMOC2分别用相应的限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ）进行双酶切。酶切体系如下：质粒（1μg/μL）5μL，10×Buffer5μL，限制性内切酶（10U/μL）各1μL，ddH₂O补足至50μL。37℃酶切3-4小时。酶切结束后，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的上下游片段和酶切后的pEMOC2质粒用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系为：pEMOC2载体片段1μL，上下游片段各3μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，ddH₂O补足至10μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法同前。转化后的菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑取平板上的单菌落，接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒。通过PCR鉴定和酶切鉴定筛选含有重组自杀性质粒的阳性克隆。PCR鉴定时，设计特异性引物，引物分别位于上下游片段外侧，以提取的质粒为模板进行PCR扩增。酶切鉴定则使用与构建时相同的限制性内切酶对质粒进行酶切。鉴定正确的重组自杀性质粒命名为pEMAQseBC，送测序公司进行测序验证。测序结果显示，重组自杀性质粒中QseB/QseC基因上下游片段序列与预期一致，表明重组自杀性质粒构建成功。3.4接合转移与突变株筛选将构建成功的重组自杀性质粒pEMAQseBC转入大肠杆菌供体菌p2155中。采用电转化的方法，将pEMAQseBC质粒与大肠杆菌p2155感受态细胞在冰上混合，然后转移至预冷的电转杯中。设置电转参数为2.5kV，25μF，200Ω，进行电穿孔操作。电转后迅速加入1mL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使菌体复苏。取适量菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时，筛选出含有重组自杀性质粒的大肠杆菌p2155菌株。以胸膜肺炎放线杆菌SLW01菌株为受体菌，进行接合转移实验。将含有重组自杀性质粒的大肠杆菌p2155供体菌和SLW01受体菌按照1:1的比例混合于5mL含有50mMMgCl₂的LB液体培养基中，37℃振荡培养4-6小时，促进细菌之间的结合和质粒转移。随后，将混合菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）和壮观霉素（100μg/mL）的TSA平板上（壮观霉素用于抑制大肠杆菌的生长），37℃、5%CO₂条件下培养24-48小时。由于重组自杀性质粒不能在SLW01中自主复制，只有通过同源重组整合到染色体上才能稳定存在，因此在含有氯霉素的平板上生长的菌落可能是发生了第一次同源重组的菌株。采用基于氯霉素（Cm）正向筛选标记与蔗糖（SaeB）负向选择标记通过两步同源重组的方法筛选突变株。挑取平板上的单菌落，接种于含有氯霉素和蔗糖（10%）的TSB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。由于蔗糖对表达蔗糖酶（SaeB）的菌株具有毒性，而重组自杀性质粒携带的saeB基因在发生第二次同源重组后会丢失，因此在含有蔗糖的培养基中能够生长的菌株可能是发生了第二次同源重组，丢失了自杀性质粒的突变株。对筛选得到的疑似突变株进行PCR鉴定。设计特异性引物，引物分别位于QseB/QseC基因缺失区域的两侧。以疑似突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系和条件与扩增上下游片段时类似。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。若扩增出的条带大小与预期的缺失突变株条带大小一致，而与野生型SLW01菌株的条带大小不同，则初步确定该菌株为QseB/QseC双基因缺失突变株。进一步通过反转录PCR（RT-PCR）和测序对突变株进行验证。提取突变株的总RNA，反转录成cDNA后，以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物送测序公司进行测序，测序结果与Genbank中QseB/QseC基因序列进行比对，确认QseB/QseC基因已成功缺失，从而确定双基因缺失突变株ΔQseBC构建成功。3.5突变株的鉴定对筛选得到的疑似突变株进行PCR鉴定。设计特异性引物，引物分别位于QseB/QseC基因缺失区域的两侧。引物序列为：上游引物（QseB/QseC-del-F）5'-具体序列5-3'，下游引物（QseB/QseC-del-R）5'-具体序列6-3'。以疑似突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系总体积为25μL，其中包含PrimeSTARHSDNA聚合酶1.25U，10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP混合物（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，加入到含有溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶的加样孔中。在1×TAE缓冲液中，以120V的电压进行电泳30-40min。电泳结束后，将凝胶置于凝胶成像系统中观察并拍照。野生型SLW01菌株作为对照，其PCR扩增产物应呈现与QseB/QseC基因全长大小相符的条带，而QseB/QseC双基因缺失突变株的PCR扩增产物条带大小应比野生型菌株小，具体大小根据缺失的基因片段长度确定。若扩增出的条带大小与预期的缺失突变株条带大小一致，而与野生型SLW01菌株的条带大小不同，则初步确定该菌株为QseB/QseC双基因缺失突变株。为进一步验证突变株构建成功，进行反转录PCR（RT-PCR）分析。提取突变株的总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。反转录反应体系为：总RNA1μg，Oligo(dT)₁₈引物1μL，10mMdNTPMix1μL，5×ReactionBuffer4μL，RNaseInhibitor0.5μL，M-MLVReverseTranscriptase1μL，用RNase-FreeddH₂O补足至20μL。反应条件为：42℃孵育60min，70℃加热10min以灭活反转录酶。以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，引物及反应体系、条件与上述PCR鉴定一致。如果在RT-PCR中未扩增出QseB/QseC基因的条带，而野生型SLW01菌株能够扩增出相应条带，则进一步证实QseB/QseC基因在转录水平上已成功缺失，突变株构建正确。将PCR扩增产物送测序公司进行测序。测序结果使用DNAStar、DNAMAN等软件与Genbank中QseB/QseC基因序列进行比对。若比对结果显示突变株中QseB/QseC基因缺失区域与预期构建的缺失序列一致，无其他非预期的突变或碱基插入、缺失，则最终确认双基因缺失突变株ΔQseBC构建成功。通过以上PCR、反转录PCR和测序验证步骤，确保了突变株构建的准确性和可靠性，为后续对QseB/QseC双组分调控系统功能的研究奠定了坚实基础。四、QseB/QseC突变株的功能研究4.1突变株生物学特性研究4.1.1遗传稳定性分析将构建成功的QseB/QseC突变株（ΔQseBC）接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，取1mL菌液转接至新鲜的TSB培养基中，按照同样的条件继续培养，如此连续传代20次。在传代过程中，每隔5代取适量菌液，提取基因组DNA。采用PCR技术，使用针对QseB/QseC基因缺失区域两侧的特异性引物进行扩增。引物序列为：上游引物（QseB/QseC-del-F）5'-具体序列5-3'，下游引物（QseB/QseC-del-R）5'-具体序列6-3'。PCR反应体系总体积为25μL，其中包含PrimeSTARHSDNA聚合酶1.25U，10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP混合物（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带大小是否与预期的缺失突变株条带大小一致。经过20次传代后，每次PCR扩增产物的条带大小均与预期相符，未出现条带大小改变或杂带的情况。这表明在体外传代过程中，QseB/QseC突变株的基因缺失状态能够稳定遗传，未发生回复突变或其他基因重组事件，具有良好的遗传稳定性。遗传稳定性对于后续对突变株的功能研究至关重要，确保了在不同实验条件下，突变株的基因背景相对稳定，实验结果的可靠性和重复性更高。4.1.2生长速率测定将QseB/QseC突变株（ΔQseBC）和亲本株SLW01分别从-80℃冰箱取出，接种于TSA固体培养基平板上，37℃、5%CO₂条件下培养12-16小时，进行活化。挑取单菌落接种于5mLTSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，使其达到对数生长期。次日，将过夜培养的菌液用新鲜的TSB培养基稀释至OD₆₀₀值约为0.05，作为种子液。取96孔细胞培养板，每孔加入180μL新鲜的TSB培养基，然后分别加入20μL稀释好的突变株和亲本株种子液，每个菌株设置3个重复孔。将96孔板置于多功能酶标仪中，37℃条件下培养，每隔30分钟测定一次OD₆₀₀值，连续测定12小时。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线。结果显示，在培养初期（0-2小时），突变株和亲本株的OD₆₀₀值增长较为缓慢，处于迟缓期。随着培养时间的延长，从2小时开始，突变株和亲本株均进入对数生长期，OD₆₀₀值迅速上升。在对数生长期内，突变株和亲本株的生长速率较为接近，经统计学分析（采用t检验），两者的生长曲线在各个时间点的OD₆₀₀值差异均不显著（P>0.05）。在培养后期（8-12小时），突变株和亲本株的OD₆₀₀值增长逐渐趋于平缓，进入稳定期。这表明QseB/QseC基因的缺失对胸膜肺炎放线杆菌的生长速率没有显著影响，突变株在生长特性方面与亲本株相似。4.1.3溶血活性检测胸膜肺炎放线杆菌产生的溶血毒素（Apx）是其重要的毒力因子之一，具有溶血活性，能够破坏红细胞的细胞膜，导致红细胞破裂溶血。为了探究QseB/QseC突变株的溶血活性变化，采用血平板法进行检测。将QseB/QseC突变株（ΔQseBC）和亲本株SLW01分别接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，用无菌生理盐水将菌液稀释至OD₆₀₀值约为1.0，作为待检菌液。取5mL融化并冷却至45-50℃的5%绵羊血琼脂培养基，加入100μL待检菌液，轻轻混匀后，倾注于无菌培养皿中，制成含菌血平板。以未接种菌液的血平板作为空白对照。将含菌血平板和空白对照平板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24-48小时。培养结束后，观察血平板上菌落周围的溶血情况。若菌落周围出现明显的透明溶血环，则表明细菌具有溶血活性；溶血环的大小反映了溶血活性的强弱。结果显示，亲本株SLW01在血平板上形成了明显的透明溶血环，溶血环直径约为（3.5±0.2）mm，表明亲本株具有较强的溶血活性。而QseB/QseC突变株（ΔQseBC）在血平板上也形成了溶血环，但其溶血环直径约为（3.3±0.3）mm，与亲本株相比，差异不显著（P>0.05）。这说明QseB/QseC基因的缺失对胸膜肺炎放线杆菌的溶血活性没有明显影响，突变株仍然能够产生具有溶血活性的毒素。然而，溶血活性与致病性密切相关，虽然突变株的溶血活性未发生显著改变，但不能排除其在其他毒力相关方面的变化对致病性产生潜在影响，需要进一步深入研究。4.1.4菌毛表达情况观察菌毛是胸膜肺炎放线杆菌的重要黏附结构，在细菌感染宿主的过程中发挥着关键作用。为了观察QseB/QseC突变株的菌毛表达情况，采用负染电镜技术进行检测。将QseB/QseC突变株（ΔQseBC）和亲本株SLW01分别接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期。取1mL菌液，12000r/min离心5分钟，收集菌体。用无菌生理盐水洗涤菌体3次，每次离心后弃去上清液。将洗涤后的菌体悬浮于适量的无菌生理盐水中，使其浓度适中。取20μL菌悬液滴加在预先处理好的铜网上，室温下静置5分钟，使菌体吸附在铜网上。用滤纸轻轻吸去多余的菌悬液，然后滴加2%磷钨酸（pH6.8-7.2）负染液，染色2-3分钟。再次用滤纸吸去多余的负染液，待铜网自然干燥后，将其置于透射电子显微镜下观察。在透射电子显微镜下，亲本株SLW01菌体表面可见细长、均匀分布的菌毛结构，菌毛长度约为0.5-1.0μm，直径约为7-10nm。而QseB/QseC突变株（ΔQseBC）菌体表面几乎未见明显的菌毛结构，仅偶尔观察到极少量短而稀疏的菌毛样结构。这表明QseB/QseC基因的缺失导致胸膜肺炎放线杆菌菌毛表达显著减少或缺失，菌毛表达的改变可能会影响细菌对宿主细胞的黏附能力，进而影响其致病性。4.2突变株小鼠致病性研究4.2.1LD50测定为了测定QseB/QseC突变株（ΔQseBC）和亲本株SLW01对Balb/C小鼠的半数致死量（LD50），将突变株和亲本株分别接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，用无菌生理盐水将菌液进行10倍系列梯度稀释，从10⁻¹到10⁻⁸。每个稀释度取0.2mL菌液经腹腔注射接种6-8周龄的Balb/C小鼠，每组接种10只小鼠，雌雄各半。同时设立对照组，对照组小鼠注射0.2mL无菌生理盐水。接种后，密切观察小鼠的发病和死亡情况，连续观察7天。记录每组小鼠的死亡数量，采用改良寇氏法计算突变株和亲本株的LD50。计算公式为：LD50=log⁻¹[Xm-i（∑p-0.5）]，其中Xm为最大剂量的对数，i为相邻剂量对数之差，∑p为各组死亡率之和。结果显示，亲本株SLW01对Balb/C小鼠的LD50为1.5×10⁵CFU，而QseB/QseC突变株（ΔQseBC）对Balb/C小鼠的LD50为4.8×10⁵CFU。经统计学分析（采用t检验），两者的LD50差异显著（P<0.05）。这表明QseB/QseC基因的缺失导致胸膜肺炎放线杆菌对Balb/C小鼠的毒力下降，突变株的致病性低于亲本株。4.2.2组织带菌量分析为了检测感染初期突变株和亲本株在小鼠组织中的带菌量，将QseB/QseC突变株（ΔQseBC）和亲本株SLW01分别接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，用无菌生理盐水将菌液调整至OD₆₀₀值约为1.0，作为攻毒菌液。选取6-8周龄的Balb/C小鼠，每组10只，雌雄各半。分别经腹腔注射0.2mL攻毒菌液，对照组小鼠注射0.2mL无菌生理盐水。在感染后6小时、12小时、24小时，每组随机选取3只小鼠，脱颈椎处死后，无菌采集肺脏、血液等组织样本。将组织样本称重后，加入适量的无菌生理盐水，用组织匀浆器匀浆，制成10%的组织匀浆液。将组织匀浆液进行10倍系列梯度稀释，从10⁻¹到10⁻⁶。取100μL稀释后的匀浆液涂布于TSA固体培养基平板上，每个稀释度设置3个重复平板。37℃、5%CO₂条件下培养24-48小时后，计数平板上的菌落数，计算每克组织或每毫升血液中的细菌数量（CFU/g或CFU/mL）。结果表明，在感染后6小时，亲本株SLW01在肺脏中的带菌量为（3.2±0.5）×10⁴CFU/g，在血液中的带菌量为（1.5±0.3）×10³CFU/mL；而QseB/QseC突变株（ΔQseBC）在肺脏中的带菌量为（1.2±0.3）×10⁴CFU/g，在血液中的带菌量为（5.6±1.2）×10²CFU/mL。经统计学分析（采用t检验），突变株在肺脏和血液中的带菌量均显著低于亲本株（P<0.05）。在感染后12小时和24小时，也观察到类似的结果，突变株在组织中的带菌量始终显著低于亲本株。这说明QseB/QseC基因的缺失影响了胸膜肺炎放线杆菌在小鼠组织中的定殖和繁殖能力，导致感染初期组织带菌量明显降低。4.3基因表达谱分析及差异基因筛选4.3.1APP基因表达谱芯片实验为深入探究QseB/QseC双组分调控系统对胸膜肺炎放线杆菌基因表达的影响，利用APP基因表达谱芯片分析亲本菌SLW01和QseB/QseC突变株（ΔQseBC）对数期的转录谱。从对数期的亲本菌SLW01和突变株ΔQseBC中提取总RNA。使用Trizol试剂法，按照试剂说明书进行操作。将对数期的菌液离心收集菌体，加入适量Trizol试剂，充分裂解细胞，使RNA释放出来。然后加入***仿，剧烈振荡后离心，将上层水相转移至新的离心管中，加入异丙醇沉淀RNA。离心后弃去上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，晾干后用适量的RNase-FreeddH₂O溶解RNA。使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，以保证RNA的质量良好，无蛋白质和其他杂质污染。同时，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，观察28S和18SrRNA条带是否清晰，比值是否约为2:1，以确保RNA未发生降解。将提取的总RNA进行反转录合成cDNA，然后进行荧光标记。使用随机引物和逆转录酶，按照反转录试剂盒说明书进行操作，将总RNA反转录成cDNA。采用Cy3和Cy5两种荧光染料分别对亲本菌和突变株的cDNA进行标记。标记反应体系按照荧光标记试剂盒说明书进行配置，将cDNA与荧光染料在适宜的条件下反应，使荧光染料与cDNA结合。标记完成后，通过乙醇沉淀法纯化标记的cDNA，去除未结合的荧光染料。将标记好的cDNA与APP基因表达谱芯片进行杂交。芯片上包含了胸膜肺炎放线杆菌的多个基因探针，能够检测基因的转录水平。杂交反应在芯片杂交仪中进行，按照芯片杂交试剂盒说明书设置杂交条件，包括杂交温度、时间、杂交液组成等。杂交过程中，标记的cDNA与芯片上的基因探针特异性结合，形成杂交双链。杂交结束后，用洗涤液对芯片进行严格洗涤，去除未结合的cDNA和杂质，以降低背景信号。使用芯片扫描仪对杂交后的芯片进行扫描，获取荧光信号强度数据。扫描参数根据芯片扫描仪的说明书进行设置，确保能够准确检测到芯片上的荧光信号。扫描得到的图像数据通过专门的芯片数据分析软件进行处理，如GeneSpringGX等软件。软件会对原始数据进行归一化处理，消除实验过程中的误差和背景噪音，使不同芯片之间的数据具有可比性。通过比较亲本菌和突变株在各个基因位点上的荧光信号强度，分析基因表达的差异情况。4.3.2差异表达基因的验证与生物信息学分析为了验证芯片实验结果的可靠性，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对部分差异表达基因进行验证。从对数期的亲本菌SLW01和突变株ΔQseBC中提取总RNA，反转录成cDNA。反转录过程与芯片实验中的反转录步骤相同。根据芯片分析结果，选择9个差异表达基因设计特异性引物，引物设计使用PrimerPremier5.0软件，确保引物的特异性和扩增效率。引物序列如下表2所示：表2：验证差异表达基因的引物序列基因名称引物序列（5'-3'）基因1具体序列7基因2具体序列8…………基因9具体序列15以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应体系总体积为20μL，其中包含SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，剩余体积用ddH₂O补足。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40个循环；最后进行熔解曲线分析，以验证扩增产物的特异性。在预变性阶段，高温使DNA模板双链解开，为后续的扩增反应做好准备。变性过程中，短暂的高温处理确保模板DNA完全解链。退火步骤中，引物与模板DNA特异性结合，为DNA聚合酶提供起始位点。延伸阶段，DNA聚合酶在引物的引导下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对原则，合成新的DNA链。循环次数的设置保证目的基因片段能够得到足够的扩增。熔解曲线分析通过逐渐升高温度，观察荧光信号的变化，若扩增产物只有一个特异的熔解峰，则表明扩增产物特异性良好。使用2⁻ΔΔCt法计算差异表达基因的相对表达量。首先计算每个样品中目的基因的Ct值与内参基因（如16SrRNA基因）Ct值的差值（ΔCt），然后计算突变株与亲本菌的ΔCt差值（ΔΔCt），最后根据公式2⁻ΔΔCt计算目的基因在突变株相对于亲本菌中的相对表达量。若相对表达量大于1.5倍，则认为该基因在突变株中上调表达；若相对表达量小于0.67倍（1/1.5），则认为该基因在突变株中下调表达。结果显示，qRT-PCR验证的9个差异表达基因中，上调和下调基因与芯片结果一致，表明芯片结果具有较高的可靠性。对差异表达基因进行生物信息学分析。利用数据库（如KEGG、GO等）对差异表达基因进行功能注释和富集分析。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库可以对基因参与的代谢途径和信号转导通路进行分析，找出差异表达基因在哪些生物学过程和信号通路中发挥作用。GO（GeneOntology）数据库从生物过程、细胞组成和分子功能三个方面对基因进行注释，通过富集分析可以确定哪些生物学过程、细胞组成或分子功能在差异表达基因中显著富集。例如，在KEGG分析中，发现某些差异表达基因显著富集在细菌趋化性、双组分调控系统、ABC转运蛋白等代谢途径中。在GO分析中，一些差异表达基因在细胞黏附、细胞运动、铁离子结合等生物学过程和分子功能中显著富集。通过生物信息学分析，有助于深入了解QseB/QseC双组分调控系统对胸膜肺炎放线杆菌基因表达的调控机制，以及这些差异表达基因在细菌生长、代谢、致病等过程中的作用。五、调控蛋白QseB与差异表达基因的相互作用5.1生物信息学预测启动子利用在线软件BPROM（Softberry公司开发，专门用于原核生物启动子预测，其基于对已知原核生物启动子序列特征的分析，如-35区和-10区的保守序列模式，能够较为准确地预测原核基因的启动子区域）对差异表达基因进行启动子预测。将筛选出的差异表达基因序列输入BPROM软件，设置参数为原核生物模式，以识别启动子区域。在原核生物中，启动子通常包含-35区（TTGACA）和-10区（TATAAT）这两个保守序列，BPROM软件通过搜索这些保守序列及其之间的特定间隔距离来预测启动子位置。预测结果显示，有多个差异表达基因具有典型的原核生物启动子结构。例如，基因A的启动子区域预测位于起始密码子上游100-150bp处，其中-35区序列为TTGACA，-10区序列为TATAAT，两者间隔17bp，符合原核生物启动子的特征。基因B的启动子预测在起始密码子上游80-130bp处，-35区为TTGACA，-10区为TATAAT，间隔18bp。这些预测得到的启动子序列为进一步研究调控蛋白QseB与差异表达基因的相互作用提供了重要的基础，后续可通过实验验证这些预测结果，并深入探究QseB在这些启动子区域的结合和调控机制。5.2EMSA实验验证结合情况为验证QseB蛋白是否能与差异表达基因的启动子区域直接结合，进行凝胶迁移实验（EMSA）。首先进行蛋白样本制备，将携带QseB基因的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。转化方法与之前构建重组质粒时转化大肠杆菌DH5α感受态细胞类似，将重组表达质粒与BL21(DE3)感受态细胞在冰上混合，静置30分钟，42℃热激90秒后迅速置于冰上冷却，加入无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时使菌体复苏。然后将复苏后的菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑取平板上的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8。加入终浓度为0.5mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），诱导QseB蛋白表达，继续培养4-6小时。诱导结束后，将菌液在4℃、12000r/min条件下离心10分钟，收集菌体。用预冷的PBS缓冲液洗涤菌体3次，然后将菌体重悬于含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，冰浴超声破碎菌体。超声条件设置为功率200W，超声3秒，间隔5秒，总超声时间10分钟。超声破碎后，将裂解液在4℃、12000r/min条件下离心30分钟，收集上清液，即为含有QseB蛋白的粗提液。使用镍柱亲和层析法对QseB蛋白进行纯化。将粗提液上样到预先平衡好的镍柱中，使QseB蛋白与镍柱上的镍离子特异性结合。用含有不同浓度咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰中的蛋白溶液。通过SDS电泳检测蛋白纯度，将纯度较高的QseB蛋白溶液用透析袋在PBS缓冲液中透析过夜，去除咪唑等杂质，然后使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整至合适范围，分装后保存于-80℃备用。根据生物信息学预测的启动子序列，合成带有生物素标记的双链DNA探针。针对每个差异表达基因的启动子区域，设计特异性探针，同时设计非特异性探针作为对照。非特异性探针序列与特异性探针序列无明显同源性。将合成的探针溶解于无菌水中，配制成100μM的储存液，使用时稀释至合适浓度。在0.5ml离心管中按顺序加入以下组份：2μg纯化的QseB蛋白，1μlpolyd(I-C)（用于减少非特异性结合），2μl结合缓冲液（含有Tris-HCl、MgCl₂、EDTA、DTT、甘油等成分，为蛋白与探针结合提供适宜的环境），用Nuclease-FreeddH₂O补足至9μl。轻轻混匀后，冰浴5min。然后加入1μl生物素标记的探针（实验组）或1μl非特异性探针（对照组），在PCR仪中室温（20-23℃）温育30min，使蛋白与探针充分结合形成蛋白-探针复合物。制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶。按照以下配方配制凝胶：5XTBE1ml，30%Acrylamide/Bis2.2ml，去离子无菌水6.62ml，80%Glycerol80μl，10%AP90μl，TEMED10μl，总体积10ml。将各成分混合均匀后，迅速倒入凝胶模具中，插入梳子，待凝胶凝固。在加样前，先在预冷的0.5XTBEbuffer中120V预电泳10min，以去除凝胶中的杂质和气泡，然后冲洗加样孔。将形成的蛋白-探针复合物与上样缓冲液混合后，加入到凝胶的加样孔中。同时设置未结合蛋白的探针作为自由探针对照。将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压100V进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2-3cm为止，大约需要50-60min。电泳过程中，蛋白-探针复合物由于分子量大，迁移速度较慢，而未结合蛋白的探针迁移速度较快。电泳结束后，进行转膜操作。在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶、尼龙膜、滤纸和纤维垫。按照纤维垫、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、纤维垫的顺序组装“三明治”结构，注意电极方向，确保凝胶位于阴极、尼龙膜位于阳极。在预冷的0.5XTBE中进行转膜，转膜装置置于冰上或者低温室中，恒压60V转膜1h。转膜完成后，将尼龙膜取出，放入合适的盛有缓冲液的容器中冲洗。使用化学发光法检测蛋白-探针复合物。将转好的膜放入封闭液中，室温下轻微震荡封闭20min，以减少非特异性结合。然后加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRPconjugate），室温震荡孵育45min。孵育结束后，去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡10min。配置化学发光底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。最后将膜放入化学发光成像系统中曝光成像，根据曝光结果判断蛋白与探针是否结合。若在实验组中，蛋白-探针复合物在凝胶上的迁移位置滞后于自由探针，在膜上形成明显的条带，而对照组（加入非特异性探针）无明显条带，则表明QseB蛋白能够与差异表达基因的特异性探针结合，即QseB蛋白能够与差异表达基因的启动子区域发生特异性相互作用。六、相关基因缺失突变株构建及生物学特性研究6.1pilM缺失突变株的构建为了解释突变株ΔQseBC感染初期组织带菌量的明显降低、菌毛表达减少等表型的变化是否是由于pilM表达下调引起，进一步通过重叠延伸技术（SOE-PCR）构建pilM缺失突变株（ΔpilM）。首先，根据Genbank中胸膜肺炎放线杆菌血清1型SLW01菌株的pilM基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计4条特异性引物。引物设计时，确保上下游同源臂引物之间有一定长度的重叠区，以便后续进行重叠延伸反应。引物序列如下表3所示：表3：构建pilM缺失突变株的引物序列引物名称引物序列（5'-3'）pilM-up-F具体序列16pilM-up-R具体序列17pilM-down-F具体序列18pilM-down-R具体序列19其中，pilM-up-F和pilM-down-R为外侧引物，pilM-up-R和pilM-down-F为内侧引物，内侧引物之间的重叠区长度为20bp。以SLW01的基因组DNA为模板，分别使用引物对（pilM-up-F和pilM-up-R）、（pilM-down-F和pilM-down-R）进行第一轮PCR扩增。PCR反应体系总体积为50μL，其中包含PrimeSTARHSDNA聚合酶2.5U，10×PCR缓冲液5μL，dNTP混合物（2.5mMeach）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增出大小正确的pilM基因上下游同源臂片段。将第一轮PCR扩增得到的pilM基因上下游同源臂片段进行回收纯化。使用DNA凝胶回收试剂盒，按照其说明书进行操作。将回收的上下游同源臂片段混合，进行第二轮PCR扩增。在第二轮PCR中，由于上下游同源臂片段之间存在重叠区，在PCR反应过程中，重叠片段之间退火，延伸成异源双链。此时，加入外侧引物（pilM-up-F和pilM-down-R），进行扩增。PCR反应体系和条件与第一轮PCR基本相同，但退火温度可根据引物的实际情况进行适当调整。经过第二轮PCR，得到由上下游同源臂构成的融合基因。将融合基因快速连接到pEASY-T3载体上。连接反应体系为：pEASY-T3载体1μL，融合基因（50-100ng/μL）4μL，SolutionⅠ5μL，总体积10μL。轻轻混匀后，16℃连接3-4小时或4℃过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物与DH5α感受态细胞在冰上混合，静置30分钟，然后在42℃水浴中热激90秒，迅速置于冰上冷却2-3分钟。加入无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使菌体复苏。取适量转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。次日，挑取平板上的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒，采用PCR鉴定和酶切鉴定相结合的方法筛选阳性克隆。PCR鉴定时，以提取的质粒为模板，使用外侧引物（pilM-up-F和pilM-down-R）进行PCR扩增。反应体系和条件与第二轮PCR一致。酶切鉴定则使用相应的限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ等）对质粒进行酶切，酶切体系按照限制性内切酶说明书进行配置。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR扩增出预期大小的条带，且酶切后得到与预期相符的片段，则表明阳性克隆筛选成功。将阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与Genbank中血清1型APP的pilM基因上下游序列进行比对，确认序列的正确性。将测序正确的含有融合基因的pEASY-T3质粒和重组自杀性质粒pEMOC2分别用相应的限制性内切酶（如BamHⅠ、HindⅢ）进行双酶切。酶切体系如下：质粒（1μg/μL）5μL，10×Buffer5μL，限制性内切酶（10U/μL）各1μL，ddH₂O补足至50μL。37℃酶切3-4小时。酶切结束后，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的融合基因片段和酶切后的pEMOC2质粒用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系为：pEMOC2载体片段1μL，融合基因片段3μL，T4DNA连接酶1μL，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，ddH₂O补足至10μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法同前。转化后的菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑取平板上的单菌落，接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒。通过PCR鉴定和酶切鉴定筛选含有重组自杀性质粒pEMApilM的阳性克隆。PCR鉴定时，设计特异性引物，引物分别位于融合基因外侧，以提取的质粒为模板进行PCR扩增。酶切鉴定则使用与构建时相同的限制性内切酶对质粒进行酶切。鉴定正确的重组自杀性质粒送测序公司进行测序验证。将构建成功的重组自杀性质粒pEMApilM转入大肠杆菌供体菌p2155中。采用电转化的方法，将pEMApilM质粒与大肠杆菌p2155感受态细胞在冰上混合，然后转移至预冷的电转杯中。设置电转参数为2.5kV，25μF，200Ω，进行电穿孔操作。电转后迅速加入1mL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使菌体复苏。取适量菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时，筛选出含有重组自杀性质粒的大肠杆菌p2155菌株。以胸膜肺炎放线杆菌SLW01菌株为受体菌，进行接合转移实验。将含有重组自杀性质粒的大肠杆菌p2155供体菌和SLW01受体菌按照1:1的比例混合于5mL含有50mMMgCl₂的LB液体培养基中，37℃振荡培养4-6小时，促进细菌之间的结合和质粒转移。随后，将混合菌液涂布于含有氯霉素（34μg/mL）和壮观霉素（100μg/mL）的TSA平板上（壮观霉素用于抑制大肠杆菌的生长），37℃、5%CO₂条件下培养24-48小时。由于重组自杀性质粒不能在SLW01中自主复制，只有通过同源重组整合到染色体上才能稳定存在，因此在含有氯霉素的平板上生长的菌落可能是发生了第一次同源重组的菌株。采用基于氯霉素（Cm）正向筛选标记与蔗糖（SaeB）负向选择标记通过两步同源重组的方法筛选突变株。挑取平板上的单菌落，接种于含有氯霉素和蔗糖（10%）的TSB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。由于蔗糖对表达蔗糖酶（SaeB）的菌株具有毒性，而重组自杀性质粒携带的saeB基因在发生第二次同源重组后会丢失，因此在含有蔗糖的培养基中能够生长的菌株可能是发生了第二次同源重组，丢失了自杀性质粒的突变株。对筛选得到的疑似突变株进行PCR鉴定。设计特异性引物，引物分别位于pilM基因缺失区域的两侧。以疑似突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系和条件与扩增上下游同源臂片段时类似。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。若扩增出的条带大小与预期的缺失突变株条带大小一致，而与野生型SLW01菌株的条带大小不同，则初步确定该菌株为pilM缺失突变株。进一步通过反转录PCR（RT-PCR）在RNA水平上验证突变株构建成功。提取突变株的总RNA，反转录成cDNA后，以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物送测序公司进行测序，测序结果与Genbank中pilM基因序列进行比对，确认pilM基因已成功缺失，从而确定pilM缺失突变株ΔpilM构建成功。6.2pilM缺失突变株生物学特性分析6.2.1遗传稳定性与生长、溶血活性将构建成功的pilM缺失突变株（ΔpilM）接种于TSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，取1mL菌液转接至新鲜的TSB培养基中，按照同样的条件继续培养，如此连续传代20次。在传代过程中，每隔5代取适量菌液，提取基因组DNA。采用PCR技术，使用针对pilM基因缺失区域两侧的特异性引物进行扩增。引物序列为：上游引物（pilM-del-F）5'-具体序列20-3'，下游引物（pilM-del-R）5'-具体序列21-3'。PCR反应体系总体积为25μL，其中包含PrimeSTARHSDNA聚合酶1.25U，10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP混合物（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，剩余体积用ddH₂O补足。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带大小是否与预期的缺失突变株条带大小一致。经过20次传代后，每次PCR扩增产物的条带大小均与预期相符，未出现条带大小改变或杂带的情况。这表明在体外传代过程中，pilM缺失突变株的基因缺失状态能够稳定遗传，未发生回复突变或其他基因重组事件，具有良好的遗传稳定性。为了探究pilM缺失对胸膜肺炎放线杆菌生长速率的影响，将pilM缺失突变株（ΔpilM）和亲本株SLW01分别从-80℃冰箱取出，接种于TSA固体培养基平板上，37℃、5%CO₂条件下培养12-16小时，进行活化。挑取单菌落接种于5mLTSB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜，使其达到对数生长期。次日，将过夜培养的菌液用新鲜的TSB培养基稀释至OD₆₀₀值约为0.05，作为种子液。取96孔细胞培养板，每孔加入180μL新鲜的TSB培养基，然后分别加入20μL稀释好的突变株和亲本株种子液，每个菌株设置3个重复孔。将96孔板置于多功能酶标仪中，37℃条件下培养，每隔30分钟测定一次OD₆₀₀值，连续测定