LexA酵母双杂交系统简介

LexA酵母双杂交系统简介

一、LexA酵母双杂交系统的设计原理

报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激

活剂的情况下,报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3,可以作为有

自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残

基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子

ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexAx8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与Xho

I）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）,HA（血凝素）及AD（来自于的88

个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列,共同组成可以启动报告基因转录表达的激

活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相

同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活

报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD

质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相

互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映

蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将雷白Y换为取自绢织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其

相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的

cDNA0

二、商品化酵母双杂交系统的组成

载体质粒：、、文库

1.pLexApB42ADp8op-LacZxpB42AD-DNA

2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ\YM4271（EGY48的伴侣菌株）

3.大肠杆菌菌株：KC8株

4.对照质粒：

质粒用途

pLexA-53,pB42AD-T阳性对照

pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕阳性对照

pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用）假阳性检测质粒

5.引物：

pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

三、酵母双杂交实验的基本流程

1.将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。

2.同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。

3.构建DNA-BD搬蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。

4.将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛

选，并用固体诱导培养基SD/Gdl/Rdf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激

活报告基因的5舌性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。

转化质粒选择培养基克隆生长情况说明

(含有Gal/Raf)

pLexA-PosSD/-His,-Ura蓝阳性对照

pLexASD/-His,-Ura白阴性对照

PlexA-XSD/-His,-Ura白没有直接激活活性

PlexA-XSD/-His,-Ura蓝具有直接激活活性

PlexA-XSD/-His,-Ura菌落不能生长酵母细胞毒性

4-1.如果pLexA-X-半孚苜酶的信号作用。能够自动激活报告基因，则设法去除

其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少

4-2.如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因"日对酵母宿中细胞有毒性，则需要

与纯化的文库DNA同时转化酵母。

5.如果pLexA-X既不会自动激活报告基因也不具有毒性则可以与纯化的文库DNA

同时、或JII页序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。

转化质粒SD固体培养基LacZ表型

对照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura蓝

对照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu蓝

+pB42AD-T

实验pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待测

+pB42AD-文库

5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增,使宿主细胞中的质粒

在诱导前达到最大拷贝数。

-半乳糖首酶无表达。5-2.上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基

SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即

为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但

5-3.同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，

望如：AD融合雷白不与目标雷白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2

个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。

5-4.将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。

6.阳性克隆的筛选

6-1.随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化KC8宿主菌，抽提大

肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。

6-2.如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大

4环同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。

7.用质粒自然分选法(NaturalSegregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆

7-1,将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3

编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中,将以10%-20%左右的频率随机丢失。

C孵育2-3天。7-2.将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura,30

7-3.再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛

选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。

7-4,将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura以验证AD-

文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。

8.酵母杂合试验(YeastMating)确定真阳性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或

文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真

阳性克隆。

质粒1

(inYM4271)质粒2

(inEGY48)LacZ表型Leu表型

pLexApB42AD白不能生长

pLexA-靶DNApB42AD白不能生长

pLexApB42AD-文库白不能生长

pLexA-靶DNApB42AD-文库蓝真阳性

pLexA-LampB42AD-文库白不能生长

9.阳性克隆的进一步筛选和确证

9-1.扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母

基因组DNA,也含有3种转化的质粒DNA。

9-2.将卜述DNA电转化KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调捽

序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含

有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA,酶切鉴定。

9-3.用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵

母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报

告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。

9-4.扩增与靶DNA相互作用的文库DNA,进行序列分析及进一步的结构、功能研

究。

10.对双杂交系统阳性结果的进一步研究

10-1.用不同的双杂交系统验证

将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。

10-1-2.选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。

10-1-3.将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。

-半乳糖昔酶水平，比较作用强度变化。10-1-4.去除或突变特定结合位点，定量检

测

10-2.用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。

10-3.用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的

蛋白之间的具有相互作用。

10-4.进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系

构建于AD载体的cDNA文库的扩增

1.自-8CTC冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。

2.用新鲜的LB培养液在离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。

II加入903.取稀释菌液各1090mm）37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,

计数平板上单克隆菌落数。LB培养液在离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板（

4.确定待扩增的cDNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数xl08（l:106稀释）或克隆数

x1010（1:108稀释）。

5.按照＞150mm），共100块；37。（：倒置培养过夜。2-4xl04cfu/平板的浓度，涂

布LB/Amp平板（

6.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入

2000mlLB/Amp培养液中，37（振荡培养2-4hr。

7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。

8.其余培养菌液离心8000xgxl0min,4P收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量

抽提质粒DNA。

LB液体培养基，121℃,15lb/in2灭菌15min

A.bacto-Tryptone

B.bacto-YeastExtract

C.NaCI

D.ddH2O-1000ml

*LB固体培养平板为含有％琼脂(Agar)LB培养基。

**LB/Amp培养基为含有Ampg/ml的LB培养基。50-100

构建于AD载体的cDNA文库的纯化

1.质粒DNA提取缓冲液

名称缓冲液配方

g/mlRNasePl悬浮缓冲液50mMTris-HCI;10mMEDTA;100A

P2裂解缓冲液200mMNaOH;1%SDS

P3中和缓冲液Kac

QBT平衡缓冲液750mMNaCI;50mMMOPS;15%异丙醇；%TritonX-100

QC洗涤缓冲液MNaCI;50mMMOPS;15%异丙醇

QF洗脱缓冲液MNaCI;50mMTris-HCI;15%异丙醇

2.培养菌液离心6000xgxl0min,4。（：，每500ml培养物（下同）的沉淀重悬于50ml

Pl缓冲液。

3.加入50mlP2缓冲液，倒置4-6次混匀,室温孵育5min.

4.加入4。（2预冷的50mlP3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min（其间再倒置

混匀4-6次）。

5.将上述混合液再倒置混匀，离心12000xgx30min,4℃,保留上清。

6.上清再离心12000xgxl5min,4℃,留上清。

7.将上清液上样于经35mlQBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。

8.以100mlQC缓冲液洗涤层析柱2次。

9.以35mlQF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。

10.以倍体积异丙醇沉浮DNA,离心12500xgx30min,4℃,小心夫除卜清。

11.以7ml70%乙醇洗涤沉淀DNA,离心12500xgxl0min,4℃,小心去除上清。

12.将沉淀的质粒DNA溶于5mlTE缓冲液，转移至新的无菌离心管中,用倍体积无

水乙醇；1/10体积NaAc,于-20。(：静置过夜。

13.离心12500xgx20min,4℃,去除_L清，沉淀用70%乙醇洗涤,超净台风干。

I)，保存于-20。&g/管(用于1次转化反应，约4014.干燥的DNA溶于适量体

积TE,定量，分装100-200

构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞

1.将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然

后转入SD/-Ura液体培养基中,30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr,至OD600>e

SD/-Ura液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.DifcoNitrogen

B.葡萄糖

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xTrp

G.ddH20-

2.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD至OD600=约50ml),30℃恒温250rpm

振荡培养至OD600=约3h)

YPD液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

3.室温离心5000xgx5min，弃上清加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞,

离心弃上清，沉淀用IxTE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细泡。

4.准备下列试剂

2x转化反应10xTElOxLiAc50%PEGddH2O

II/120I15A.lxTE/LiAc15

I/I960I120B.PEG/LiAc120

II//900C.lxTE100

5.分装待转化的质粒DNA,振荡混匀。

Ig）3-5A.pLexA-X

B.lOmg/mlISpermDNA*10

*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。1

I用IxTE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。6.每管加入100

I7.各加入600PEG/LiAc,振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30mino

I8,各加入70DMSO缓和倒置混匀。42。（2热休克15min,迅速插入冰浴。

9.室温离心13000xgxl0sec,尽量弃上清似lxTE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura,

-His固体培养板，30。（：倒置培养3-5天。

SD/-Ura,-His固体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板

A.DifcoNitrogen

B.

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.20xTrp

F.Agar

G.ddH2O90-100mm)一铺8-10块平板(

附表1.不同规模转化酵母感受态细胞

SmallScale*LargeScaleLibraryScale

转化反应2011

(1)SD液体培养基扩增醉母菌100ml100ml300ml

(2)YPD液体培养基扩增酵母菌300mla300mlalOOOmla

(3)TE或ddH20洗涤酵母细胞15mlc25-50mlb500mla

(4)准备A.lxTE/LiAc缓冲液

B.PEG/LiAc缓冲液

C.lxTE缓冲液

(5)分装A.DNA-BDvectorgdx20/

gd10-50B.ADvector

C.I1x20200SpermDNA(10mg/ml)10

IxTE/LiAc重悬感受态细胞

1x20酵母感受态细胞100

(7)PEG/LiAc缓冲液x20

Jl1x20700DMSO70

(9)室温离心后弃上清13000xgxl0sec2000xgx5min2000xgx5min

(10)lxTE重悬感受态细胞x20

150mmx50150mmx3090mmx20铺固体选择培养基平板

注:*即为"构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”

**在不同容积的无菌离心管中进行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:

文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞

1.以生长于SD/-Ura,-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA

及报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为宿主菌,制备酵母感受态细胞。

2.将酵母宿主菌接种于SD/-Ura,-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入

SD/-Ura,-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr,至OD600〉。

SD/-Ura，-His液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A.DifcoNitrogen

B.WW®

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.20xTrp

F.ddH2O-

3.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD至OD600二约50ml),30℃恒温250rpm

振荡培养至OD600=约3hr).

YPD液体培养基,115℃,10lb/in2灭菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

4.室温离心5000xgx5min，弃上清加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，

离心弃上清，沉淀用lxTE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细抱。

5.准备下列试剂

lx转化反应10xTE10xLiAc50%PEGddH2O

II/800I100A.IxTE/LiAc100

I/I600B.PEG/LiAc600

C.lxTE//

6.取用IxTE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份,振荡混匀。

Ig)40A.pB42AD-Library(50-100

B.lOmg/mlIHerringDNA*200

*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。匚

7.加入PEG/LiAc,振荡混匀，30℃恒温,250rpm振荡培养30mino

I8,加入700DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min,迅速插入冰浴。

9.室温离心2000xgx5min,尽量弃上清。

10.以100mm,每稀释度各x2),30°(:倒置培养3-5天，确定转化效率在2xl06cfu

以上有效。I稀释不同倍数，涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板(IxTE重悬沉淀

细胞，取10

150mmx30),30℃倒置培养3-5天。I涂布SD/-Ura,-His,-Trp固体培养板

(11.按每板200

SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基，115。。10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板

A.DifcoNitrogen

B.葡萄糖

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xLeu

E.Agar

F.ddH20150mm）一铺30块平板（

12.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5mlTE缓冲液，将菌落刮下。

13.离心弃上清，加入10-20mlTE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油

-MgSO4缓冲液，混匀，分装管,保存于4℃1周或-8CTC1年以L

65%甘油-MgSO4缓冲液:65%甘油；100mMMgS04;25mMTris-HCI

A.甘油

B.MgSO4«7H2O

C.MTris-HCI

D.ddH20-

酵母双杂合系统阳性克隆的筛选

1.经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态

细胞，用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度，

90mm）,30℃倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。I,涂布SD/-Ura,-His,

-Trp固体培养板（2.取上述稀释菌液各100

3.确定待进一步鉴定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆数xl05（l:104稀释）、克隆数

x107（1:106稀释）或克隆数x109（1:108稀释）。

4.按照以前实验确定的文库转化效率的5・10倍的总量、xl06cfu/平板的菌量，涂布

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。

5.挑取显蓝色的菌落,再接种于SD/-Ura,-His,-Trp固体培养基以及

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。

SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固体诱导培养基

A.SD/Gal/Raf

B.10xDO（-His,-Leu,-Trp,-Ura）

C.Agar

D.ddH2O-

灭菌（115℃,10lb/in2）15min,冷却至50℃,加入下列成份后铺板

E.10xBU

F.20mg/mlX-gal90-100mm）铺5-6块平板（

lOxBU缓冲液，121℃,15lb/in2灭菌15min

A.Na2HPO4«12H2O

B.NaH2PO4*2H2O

C.ddH20一

20mg/mlX-Gal

A.X-Gal40mg

B.DMF2ml

酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定

-酵母质粒DNA的提取

1.成娥经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于SD/-Trp液体培养

基，30℃恒温，250rpm振荡培养20"。

SD/-Trp液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.DifcoNitrogen

B.WH

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xUra

G.ddH20-

2.室温离心5000xgxlmin,弃上清，收菌。

I酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。3.加入200

酵母裂解液：2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCI;10mMTris-HCI;ImM

EDTA

A.10%TritonX-100

B.10%SDS

C.NaCI

D.Tris

E.EDTANa2-2H2O

F.HCI调

G.ddH20

4.加入下列试剂，充分振荡5min;液氮冻存lOmin,室温复融；再充分振荡5mino

A.经酸处理的玻璃珠(Sigma)

B.苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)

5.室温离心12000xgxl0min,将上清转移至新的离心管中，加入下列试剂，于

-70℃冻存30-60min。

A.3MNaAc(l/10IV)20

IB.无水乙醇500

6.离心12500xgxl0min,4℃,弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于37T烘箱或超净

台干燥DNA;将干燥的沉淀DNA重溶于I无菌ddH20中，保存于-20。匚20-30

酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定

-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌

1.在冰浴条件下，取待转化DNAI感受态细胞中，混匀。g),加入100I

F,2002•将上述混合液加入间距的样品杯中，电转化，25a

3.迅速加入1ml新鲜的LB培养液，混匀，转入离心管中，37℃恒温，150rpm振

荡孵育30-60min。

4.将上述转化反应液涂布M9/D0(-Trp)固体培养板，37。(：倒置培养至单菌落出现

(16-22hr)0

5.按常规方法扩增上述阳性转化菌，碱裂解法少量抽提质粒DNA,酶切筛选AD载

体上含有插入片段的阳性克隆，保存其于25%甘油，待进一步验证。

M9/D0-Trp固体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.葡萄糖

B.Agar

C.5xM9缓冲液60ml

D.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)30ml

E.20xHis15ml

F.20xLeu15ml

G.20xUra15ml

H.ddH2O165ml

冷却至50℃左右，加入下列成份，混匀铺板

I.Thiamine-HCIml

J.100mg/mlAmpml90-100mm）铺10-15块平板（

大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化）

1.挑取LB固体培养基上生长的KC8单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37P恒

温，250rpm振荡培养过夜（约12-14hr）o

2.将ml新鲜菌液接种于500mlSOB培养液中，37。（：恒温，250rpm振荡培养至

OD600;约。

SOB液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.bacto-Tryptone

B.bacto-YeastExtract

C.NaCI

D.KCI

E.MgCI2*6H2O

F.ddH20

3.将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min。

4.离心6000xgxl0min,4℃,弃尽上清；以5ml预冷的无菌ddH20重悬沉淀菌;

再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。

5.重复_L述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成份。

6.用40-50ml预冷的无菌10%甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml无菌离心管中；

离心6000xgxl0min,4℃,弃尽上清；重复此步骤1次。

7.以等体积(约预冷的无菌10%甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装管(5-6次转

化反应)，保存于-8(TC备用。

酵母双杂合系统阳性克隆的确证

1.以含有报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。

2.将酵母宿主菌接种于SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入SD/-Ura

液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr,至OD600〉。

SD/-Ura液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.DifcoNitrogen

B.

C.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)

D.20xHis

E.20xLeu

F.20xTrp

G.ddH2O-

3.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD至OD600;约50ml),30℃恒温250rpm

振荡培养至OD600=约3hr)。

YPD液体培养基，115℃,10lb/in2灭菌15min

A.Polypepton

B.bacto-YeastExtract

C.葡萄糖

D.ddH2O-300ml

4.室温离心5000xgx5min，弃上清加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞,

离心点上清,沉浮用lxTE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。

5.准备下列试剂

20x转化反应lOxTElCxLiAc50%PEGddH20

I/I150A.lxTE/LiAc150

B.PEG/LiAc/

C.IxTE//

6.分装待转化的质粒DNA。

A.pLexAIg)3-5orpLexA-X

Ig)3-5B.pB42AD-Y

C.lOmg/mlSpermIDNA*10

*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。匚

I用lxTE/LiAc重悬的酵母感受态细胞,振荡混匀。7.每管加入100

各加入振荡混匀，恒温,振荡培养

I8.600PEG/LiAc,30℃250rpm30mino

I9.各加入70DMSO缰和倒置混匀。42℃热休克15min,迅速插入冰浴.

10.室温离心13000xgxl0sec尽量弃上清以lxTE