鸦胆子苦醇对肝癌细胞Huh-7增殖、迁移的影响

.4研究意义原发性肝细胞癌,HCC占据原发性肝癌的绝大多数，占所有肝癌患者的七至九成，因其对化疗制剂反应性差，直接推高了恶性肿瘤的致死率，临床观察发现肝癌发病率上升，HCC的综合治疗离不开化疗这一核心手段，特别针对丧失手术条件的晚期肝癌病人。肝癌患者死亡的核心诱因依然是肿瘤复发及转移，而现阶段肝癌对药物治疗的耐药性较为突出，全球医疗界普遍接受中药作为化疗的协同治疗手段，肿瘤综合治疗中的大量临床探索不断取得新进展，大量实践显示传统中药的辅助治疗意义，结合放化疗共同开展，实现疗效提升与副作用减轻的双重效果。中药活性单体鸦胆子苦醇，BRU是从鸦胆子油分离得到的活性三萜类化合物，展现出多种生物效应，表现为抑制肿瘤生长、减少疟原虫复制、抗炎及抗病毒等多重效应，基于医药化学领域的重大突破，现代研究将中药成分鸦胆子苦醇归类为广谱抗肿瘤化合物。鸦胆子苦醇能有效抑制结直肠癌、肺癌、胰腺癌、鼻咽癌及黑色素瘤等多种肿瘤的生长，就肝细胞瘤而言，目前对鸦胆子苦醇抗癌活性的探索仍不充分，相关分子靶点的调控机制仍待揭示，本文旨在研究鸦胆子苦醇对人类肝癌细胞Huh-7生长转移的调控作用及其抗癌机理，以期为肝细胞癌药物开发提供有益借鉴。

2材料与方法2.1细胞株实验材料选用人肝癌Huh-7细胞系，Huh-7细胞株来源为重庆市三峡库区道地药材开发利用重点实验室冻存库。2.2试剂与仪器表2.SEQ表2.\*ARABIC1主要实验试剂序号名称厂家1鸦胆子苦醇上海源叶科技有限公司2DMEM培养基Gibco/61245603胎牛血清NTC-B00394PBS赛维尔生物/G00025双抗苏州新赛美/C100C56cck-8苏州新赛美/C60057胰岛素武汉普诺赛生命科技有限公司8MMP2Abwaystechology/CY71649MMP-9Abwaystechology/CY520510-actinServicebio/GB1562611P21CellsignalingTechnology/2947T12P53Servicebio/GB1562613二抗Abwaystechology/WB0121、AB010214Makerx苏州新赛美/P900115RIPA裂解液苏州新赛美/WB310016BCA试剂盒上海雅酶生物/WB650117Buffer苏州新赛美/WB205001810%快速凝胶试剂盒上海雅酶生物/P2012序号名称厂家1电泳仪电源美国伯乐/16450502高速冷冻离心机美国ThermoFisher/Fresco3低速离心机蜀科/TD-4204恒温水浴锅上海力辰邦西仪器科技有限公司/HH-65小型垂直电泳槽美国伯乐/Mini-PROTEANtetre6酶标仪北京凯奥/K6600B7免染蛋白印迹检测分析系统美国伯乐ChemiDocTouch/ChemiDocTouch表2.SEQ表2.\*ARABIC2主要实验仪器2.3方法2.3.1细胞培养Huh-7细胞在含15%FBS的DMEM培养基中增殖，采用37℃恒温环境，5%CO₂浓度下进行培养，观察到细胞铺满80%面积时，排空旧培养液，轻柔注入2mL磷酸盐缓冲液润洗细胞，继而弃置PBS试剂，滴加1mL胰蛋白酶消化细胞，直至镜下可见细胞脱落。消化终止采用2mL培养基实现，通过反复吹打实现细胞单分散，经5分钟离心（1000r/min）后收集细胞团块，按实验参数将细胞悬液分装至新制备培养皿，添加新配制的培养基，于标准培养条件（37℃/5%CO₂）下实施传代操作，按照三天间隔规律开展换液传代工作，保持细胞旺盛生长活力。2.3.2Huh-7细胞形态变化的显微观察选取生长曲线对数期的Huh-7细胞进行实验，经胰酶消化处理后，把细胞悬液装入5mL离心管，1000转离心机运行5分钟实现细胞沉降，离心步骤后精准弃置上层清液，用1mL含10%FBS的DMEM培养液重悬，缓慢吹打形成细胞悬液。按实验要求，通过细胞与完全培养基的比例混合，获得密度适中的单细胞悬液，分配到六孔培养皿，向各孔中移入1mL培养基，处理组分别给予1mL不同浓度BRU溶液，对照组用培养基等量替换实验组溶液，待平板均匀分布后放入培养箱，24h后采用倒置荧光显微镜检测细胞形态改变。2.3.3CCK-8细胞增殖检测选取处于指数生长期的Huh-7细胞，采用胰酶消化后，借助移液枪把细胞悬液转入5mL离心管内，在1000r/min离心5min，彻底去除上清，注入1mL含15%胎牛血清的培养液，采用血球计数板进行细胞计数后，以每孔5×10⁵个细胞的密度铺入96孔板，每孔分装100μL细胞悬液，每个药物梯度安排5个复孔。在37℃环境中细胞贴壁后，各孔补加100μL含梯度浓度BRU（1-16μg/mL）的完全培养基，调整后每孔终体积为200μL，各组配置5个平行孔，经过24、48至72小时处理后，每孔内添加10μL的CCK-8检测液，维持1小时孵育，于450nm波长下用酶标仪检测各孔吸光度值，评估细胞增殖抑制水平。Y%=Ac−AsAc−Ab2.3.4细胞克隆试验选择处于对数期的Huh-7细胞培养物，经胰蛋白酶消化，以5mL离心管承接细胞悬液，离心后移除上清液，加入1mL完全培养基重悬细胞沉淀，混合10μL细胞原液及990μLDMEM培养基，悬液混匀后用10μL加样至血球计数板分析。在6孔板各实验孔内，各孔初始接种量为1000个细胞，在细胞初步形成克隆阶段添加药物继续培养，维持培养14天后终止，待大部分克隆细胞数量越过50大关，以三天为间隔更换培养基，同步检查细胞情况，肉眼可辨克隆显著生长阶段，在显微镜下完成细胞图像采集，继而用PBS快速漂洗一次，每孔添加1mL4%多聚甲醛溶液，固定处理45分钟，再用磷酸盐缓冲液洗涤两回，向各孔添加1mL结晶紫溶液，染色处理20分钟，采用PBS多次清洗后，晾干后实施图像采集。细胞克隆形成率以集落数与接种细胞数的百分比表示，定义50个以上细胞为一个集落式22.3.5细胞迁移实验以直尺为基准在6孔板背面用记号笔描画横线，按1厘米间隔画线，要求每孔存在3条及以上相交横线，按10000个细胞/孔的规格接种，以过夜后细胞铺满为度，第二天用枪头以正交方式对背面横线进行划痕，保持枪头与平面垂直，用PBS缓冲体系连续洗涤细胞3次，清除划落细胞。用4μg/mL与2μg/mLBRU药物分别处理含2mL低血清培养基的细胞孔，于37℃、5%CO₂的培养环境中恒温培养，于培养起始及24小时时取样，借助倒置显微镜对固定位点细胞迁移现象进行可视化记录，计算迁移细胞占比。如式3所示，迁移率计算采用初始与t时刻细胞平均间距的相对变化量。细胞迁移率%=（初始细胞间距离均值—t时刻细胞间距离均值）/初始细胞间距离均值式32.3.6细胞小室实验取处于对数生长期的Huh-7细胞，在24孔板各孔内均加入600μL血清培养液，把Transwell培养室置入孔中，小室内加入无血清培养的细胞悬液，密度为10⁵个。培养24小时后取出小室，吸弃培养基，用PBS清洗3次，将小室浸入甲醛溶液20分钟固定外底部细胞，随后用0.1%结晶紫染色20分钟。用棉签轻擦小室内层细胞，PBS漂洗3次后，在倒置显微镜下随机选取5个视野拍照并计数细胞。2.3.7免疫印迹实验采用商业化蛋白提取试剂盒分离总蛋白，裂解细胞样本后，依据BCA试剂盒说明检测蛋白浓度，向样品中加入蛋白上样缓冲液，采用沸水浴15分钟实现蛋白变性，依据SDS试剂盒说明制备12%分离胶和5%浓缩胶，于电泳槽内加入SDS运行缓冲液，向点样孔内加入蛋白Marker及待测蛋白。初始阶段以35V电压电泳30分钟，实现Marker的有效分离，而后采用80V电压跑胶45分钟，最终以120V结束电泳，采用甲醇将PVDF膜活化3分钟，采用湿转技术根据蛋白分子量1：1.实施1.2倍量转膜，对PVDF膜实施TBST缓冲液3次漂洗，各间隔10分钟，采用快速封闭液在常温下封闭30分钟。用TBST缓冲液执行3次漂洗，逐次10分钟间隔，采用PVDF膜与1：一抗经千倍稀释后4℃过夜反应，第二天转移出NC膜，之后采用TBST缓冲液冲洗3次，各阶段10分钟，与1：3000倍稀释的二抗溶液，室温条件下孵育1.5h，抗体孵育结束后，采用TBST缓冲液清洗3遍，每轮10分钟漂洗，采用ECL化学发光法完成免疫检测显色，实现蛋白样品制备、电泳分离、转膜处理、免疫反应及显影分析，所得数据支持后续工作。

3结果与分析3.1鸦胆子苦醇对Huh-7细胞增殖的影响将鸦胆子苦醇按1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL的终浓度分别作用于Huh-7细胞，具体效果如图3.1所示。经48小时处理后，各浓度组对细胞的抑制率依次为21%、34%、61%、72%、76%，可见抑制效果随药物浓度升高而增强。图3.1数据表明，随鸦胆子苦醇投药量增加及作用时段扩展，其对细胞分裂的抑制程度不断提高，呈现浓度梯度与时间进程相关的抑制规律。表3.1BRU对Huh-7细胞增殖的抑制(x±s,n=3)Inhibitoryrateμg/mL24H48H72H0——————10.123±0.0080.211±0.0170.109±0.00120.428±0.0090.343±0.0110.373±0.00840.59±0.0040.61±0.0010.692±0.00380.657±0.0040.719±0.0010.757±0.003160.708±0.0010.76±0.0010.764±0.002图3.SEQ图3.\*ARABIC1反映了鸦胆子苦醇浓度差异对Huh-7细胞增殖的作用注：*与对照组P＜0.05，**与对照组相比P<0.01，***P<0.001，****P<0.00013.2鸦胆子苦醇对Huh-7细胞克隆形成能力的测试细胞克隆形成实验结果见图3.5A，与空白对照组相较，处理组表现出集落形成的明显抑制，1μg/mL及2μg/mL实验组的集落形成数分别为289与195，图3.7B的统计结果说明，与对照组相比，1μg/mL及2μg/mL剂量组的细胞克隆形成明显减少，提示鸦胆子苦醇能显著减弱Huh-7细胞增殖。图3.2A揭示鸦胆子苦醇对细胞集落形成的影响图3.2B细胞克隆形成率受鸦胆子苦醇影响的结果见图注：*与对照组相比，与对照组相比，差异极显著3.3镜下观测细胞形态采用双浓度BRU（4μg/mL+2μg/mL）干预细胞，细胞培养24小时后进行显微图像采集，正常培养的对照组细胞显示典型生长活力，排列紧凑且轮廓整齐可辨，伴随BRU含量上升，细胞逐步表现出形态变异，细胞数量急剧下滑，上述结果表明BRU对Huh-7细胞显现毒性，可阻碍细胞生长。control2ug/ml4ug/ml图3.3呈现Huh-7细胞形态受鸦胆子苦醇影响的情况3.4鸦胆子苦醇对Huh-7细胞迁移的调控效应图3.4为细胞划痕实验的结果展示，图3.4A直观反映，和实验组对比，对照组细胞迁移程度明显不及阴性对照组；从图3.4B的量化分析可得，24小时划痕实验中，对照组细胞，伤口闭合更迅速，细胞迁移量占实验组的27%，实验组细胞迁移修复能力明显减退，细胞迁移面积普遍下降，鸦胆子苦醇处理可有效抑制Huh-7细胞的迁移。图3.4细胞迁移受鸦胆子苦醇的影响（A：B:细胞迁移实验结果）注：与对照组相比，达到0.05显著性水平，与对照组差异极显著3.5鸦胆子苦醇抑制Huh-7细胞侵袭的实验研究图3.5为Transwell实验的观察结果，图3.5结果说明，对照组观察到极少量跨膜染色细胞，未见明显侵袭迹象，2μg/mL和4μg/mL实验组的膜上细胞数量极少，未观察到明显侵袭现象，观察显示鸦胆子苦醇处理未显著改变Huh-7细胞的侵袭表现。图3.5鸦胆子苦醇对细胞侵袭的影响3.6鸦胆子苦醇处理后Huh-7细胞蛋白表达特征在Huh-7肝癌细胞培养中施加1、2μg/mL的鸦胆子苦醇进行诱导，采用48小时诱导方案后，这些细胞被我们采集，测定细胞群体内周期蛋白与迁移蛋白的表达水平，对照未施处理的空白组，实验组经BRU梯度浓度处理后显示，随实验组剂量累积，MMP-2蛋白的表达呈现剂量依赖性下降，P-53蛋白的表达水平随药物浓度梯度递增而逐步提高，见图3.6图3.6显示鸦胆子苦醇对Huh-7细胞中MMP-2和P53蛋白表达的影响注：*与对照组P＜0.05，***与对照组相比P<0.0014小结与讨论实验以Huh-7肝癌细胞系为研究对象，利用CCK-8细胞增殖实验联合克隆形成试验验证鸦胆子苦醇的生物活性，采用划痕法分析细胞迁移能力，利用WB方法分析细胞周期调控及迁移相关蛋白的表达变化，结果显示：在1～16μg/mL浓度梯度下，鸦胆子苦醇对Huh-7细胞生长的阻滞作用随剂量增加和时间延长而逐步显著；药物浓度梯度升高时，克隆形成效率及大小同步下降；伤口愈合实验显示，实验组细胞迁移活性随剂量增加呈阶梯式下降，蛋白测定结果证实，鸦胆子苦醇处理后，MMP-2和MMP-9表达量明显降低，促进P21与P53的表达水平。BRU是以鸦胆子油为原料分离的三萜类活性成分，具有抗疟疾、抑制炎症及抗病毒等综合效果，现代实验证实，多种肿瘤细胞的增殖可被BRU抑制，李赟等人证实BRU可依剂量梯度显著改善小鼠免疫状态，阻滞肿瘤生长，其作用机制或涉及cGAS-STING通路的活化，Ye等实验证实，BRU能够阻断肝癌Bel7404、Huh7与LM3细胞的增殖进程，抑制其侵袭迁移，同时触发凋亡。所得结果与既有研究结果相吻合，数据持续表明鸦胆子苦醇能有效抑制Huh-7细胞增殖迁移，现阶段尚未系统阐明其分子层面的作用机制，后续将采用Westernblot方法准确测定相关蛋白表达水平，从而明确其分子层面的运作原理。参考文献SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CACancerJClin,2021,71(3):209-249.BrayF,FerlayJ,SoerjomataramI,etal.GlobalCancerStatistics2018:GLOBOCANEstimatesofIncidenceandMortalityWorldwidefor36Cancersin185Countries[J].CACancerJClin,2018,68(6):394-424.韩亚琨,于程程,于艳.TLR4/9介导牙周炎宿主CD25+B细胞表达IL-10、IL-35及TGF-β的效应及机制[J].西安交通大学学报（医学版）,2023,044(006):893-897.许慧敏,常建桥,李运超,等.纳米材料在基因治疗中的研究进展:从肿瘤治疗到新冠病毒疫苗[J].北京师范大学学报:自然科学版,2022,58(4):12.谭冬梅,张静静,师一民,等.RBM8A基因对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖,迁移和凋亡的作用及其机制[J].肿瘤防治研究,2023,50(1):27-32.庞米米,林涵,李雨佳,等.TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定.中国药理学通报,2019,35(12):1714-1719.吕强,邢沈阳,赵志辉.结肠癌的研究现状及展望[J].中国实验诊断学,2009,13(08):1134-1137.冀会方，刘露，李开等.鸦胆子蛋白质组成分析及其酶解物细胞毒性研究［J］．中国中药杂志，2016，41（22）：4210-4215.刘思园,蔡萌,李春建.鸦胆子苦醇抑制结直肠癌细胞增殖与Nrf2通路相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志,2018.04.005.宣晓梅,林琳,石丽平,等.MiR-145靶向TLR4对尖锐湿疣患者外周血单核细胞来源树突状细胞分泌IL-18和IL-10的影响［J］.中国皮肤性病学杂志,2019,33(9):1001-1006.HANAHAN D，WEINBERG R A.Hallmarks of cancer：the next generation[J].Cell，2011，144（5）：646.BRABLETZ T，KALLURI R，NIETO M A，et al.EMT in cancer[J].Nat Rev Cancer，2018，18：128.CHEN Z Y，HE B J，ZHAO J G，et al.Brusatol suppressesthe growth of intrahepatic cholangiocarcinoma by PI3K/Akt pathway[J].Phytomedicine，2022，104：154323.doi：10.1016/j.phymed.2022.154323.赵韦欣，王晴，王梦齐，等.基于网络药理学和分子对接探讨鸦胆子治疗结直肠癌的作用机制[J].中草药，2023，54（6）：1850.CHEN Z Y，HE B J，ZHAO J G，et al.Brusatol suppressesthe growth of intrahepatic cholangiocarcinoma by PI3K/Akt pathway[J].Phytomedicine，2022，104：154323.doi：10.1016/j.phymed.2022.154323.LEE J H，MOHAN C D，DEIVASIGAMANI A，et al.Brusatolsuppresses STAT3-driven metastasis by downregulatingepithelial-mesenchymal transition in hepatocellularcarcinoma[J].J Adv Res，2020，26：83.JIANG L，ZHOU J H，WU Y，et al.Brucea javanica oilinhibits tongue squamous cell i