亚硝酸盐降解菌株筛选鉴定及其脱氮性能研究

摘要随着水产养殖不断发展，在追求高产的过程中，各类饲料和高密度养殖下鱼类的粪便过多使得养殖水体氨氮和亚硝酸盐超标，导致水体富营养化，而且严重危害水产动物健康，严重的会造成重大经济损失。微生物在水体亚硝酸盐的降解过程中发挥着重要功能。本研究拟从水产养殖环境中筛选一些高效降解亚硝酸盐的菌株，通过对其进行微生物鉴定、脱氮性能和生物安全性评价，获得具有应用前景的脱氮微生物，为开发高效净水微生物制剂提供基础。主要研究内容如下：从池塘底泥以及塘水中通过富集筛选获得19株具有亚硝酸盐降解活性的微生物菌株，通过测定不同菌株的亚硝酸盐降解效率，最终筛选出性能最强的三个样品菌株，分别为S4，S10，S19。对这3株菌进行形态学、生理生化鉴定和16sDNA鉴定，初步鉴定S4菌株和S10菌株为克雷伯氏菌，S19菌株为无色杆菌。比较了三株菌在单一氮源培养基中的生长及氨氮降解特性，结果发现，在以亚硝酸盐为唯一氮源时，S19降解速度和生长速度最快，亚硝酸盐降解率和OD600分别达到96.46%和0.737。此外，S4和S10的亚硝酸盐降解效果也达到了90%以上，分别为95.20%和92.72%，OD600分别达到0.752和0.754。此外，探究了不同温度、pH值和混合氮源下菌株脱氮特性和生长性能，结果发现，菌株S19达到较好降解亚硝酸盐性能的环境因子温度为37℃，pH值为8，24h降解率高达96.19%，48h时降解率已达99.52%。菌株S4和S10达到较好降解亚硝酸盐性能的环境因子温度为30℃，pH值为7。在混合氮源中，三种菌株对氨氮都有较好的代谢效果，混合氮源中亚硝酸盐浓度先升高后降低，其中菌株S19在第三天对硝酸盐也达到了较好的去除率。综上所述：研究中鉴定出的菌株S19为好氧反硝化菌，具有有效降解水产养殖水体中亚硝酸盐的显著能力。该菌株在高氮和低氮浓度下均表现出优异的降解性能，且有较好的耐碱性。因此，菌株S19是对于改善水质，减少水中氮素有良好前景的菌株。关键词：微生物；亚硝酸盐；氮；农业水产；水质净化 AbstractMicroorganismsplayacrucialroleintheaquaculturesystemwithinagriculturalecosystems.Thisstudyaimstoscreenstrainscapableofefficientlydegradingnitritefromtheaquacultureenvironment.Throughmicrobialidentification,denitrificationperformanceevaluation,andbiologicalsafetyassessment,promisingdenitrifyingmicroorganismswillbeobtained,providingafoundationforthedevelopmentofefficientwaterpurificationmicrobialpreparations.Thespecificresearchobjectivesinclude:screeningandisolatingmicrobialstrainswithhighnitritedegradationefficiency,conductingmicrobialidentification,evaluatingthedenitrificationperformanceofdifferentstrains,andperformingbiosafetyassessmentstoidentifystrainswithapplicationpotential.Thispaperinvestigatestheroleofmicroorganismsinthenitrogencycleandnitritedegradationprocesses.Themaincontentsareasfollows1.SedimentandpondwatersampleswerecollectedfromfourrandomlyselectedpondsinFoshanCityandenrichedthroughrepeatedcultivationoverfourgenerations.Aftergradientdilutionofthebacterialliquidfollowingfourgenerationsofculture,itwasspreadonscreeningmediumplates.Singlecoloniesexhibitingdistinctmorphology,color,andsizewereselectedandre-streakedforpurificationandcultivation.Anappropriateamountoftheenrichedculturemedium,after36hoursofincubation,wasgradientdilutedandspreadonsolidnitritescreeningmedia,followedbyincubationat37°Cinaconstant-temperatureincubator.Singlecolonieswithvaryingcolonyshapes,colors,andsizeswerepickedandstreakedagainforpurification.Afterthreeroundsofstreaking,pureculturesofthestrainsweresuccessfullyobtained.Selectedsinglecolonieswerestreakedontoenrichedsolidmedia,incubatedat37°Cfor48hours,andscreenedforstrainswithfavorablegrowthconditions.Strainseedliquidswereisolatedandstoredat-80°C.2.Purifiedstrainswereculturedinnitriteidentificationmedia,andtheirconcentrationsandnitritedegradationefficienciesweremeasuredat24,48,and72hours.Threesamplestrainswiththehighestperformance—S4,S10,andS19—wereselected.Subsequently,experimentswereconductedundervarioustemperaturesandpHlevelstodeterminetheoptimalconditionsforstraindegradation.Thesestrainswerealsocultivatedinmixednitrogensourcemediacontainingsodiumnitrite,ammoniumchloride,andnitratetoobservetheirdeaminationcharacteristicsandgrowthstatusunderdifferentammoniasources.Basedonfunctionalanalysisandquantificationofnitritetransformationmechanismsvia16SrRNApyrosequencing,theeffectsofenvironmentalfactors(e.g.,nitriteconcentration,pHvalue,andtemperature)onthegrowthofnitrite-degradingbacteriawereinvestigatedandstatisticallyanalyzed.Thenitrification/denitrificationmicrobiomewasexplored,alongwiththesignificanceofbacterialnitritedegradationinthenitrification-denitrificationprocess,currentapplications,andfutureprospects.3.Resultsdemonstratedthatwithin72hours,whennitriteservedasthesoleammoniasource,strainS19exhibitedthefastestdegradationrateandgrowthrate,achievinganitritedegradationrateof96.46%andanOD600valueof0.737.Additionally,strainsS4andS10achievednitritedegradationratesexceeding90%,specifically95.20%and92.72%,respectively,withOD600valuesreaching0.752and0.754,respectively.Thesefindingsindicatethatallthreestrains—S4,S10,andS19—exhibitrelativelygoodgrowthstatusanddegradationefficiencywhennitriteisthesolenitrogensource.4.ThisexperimentexaminedtheeffectsofenvironmentalfactorssuchastemperatureandpH,aswellasthedenitrificationcharacteristicsandgrowthstatusofthestrainsundermixednitrogensources.ItwasfoundthatwithinthepHrangeof5–6,strainS19couldnotgrownormallyordegradenitrite,whilethegrowthconditionsofstrainsS4andS10wererelativelyslow,leadingtoreducednitritedegradationefficiency.StrainS19exhibitedthebestdegradationefficiencyatpH8,achievingdegradationratesof96.19%at24hoursand99.52%at48hours.AtpH7,thedegradationefficiencyofstrainsS4andS10wasrelativelyhigh.OptimalenvironmentalconditionsforstrainS19toachievesuperiornitritedegradationperformanceweredeterminedtobeatemperatureof37°CandapHvalueof8.ForstrainsS4andS10,optimalconditionswereatemperatureof30°CandapHvalueof7.Undermixednitrogensources,allthreestrainsdemonstratedeffectivemetabolicactivitytowardammonianitrogen.Nitriteconcentrationinitiallyincreasedandthendecreased;notably,strainS19achievedagoodremovalrateofnitrateonthethirdday.Inconclusion,strainS19,identifiedinthisexperiment,isanaerobicdenitrifyingbacteriumcapableofeffectivelydegradingnitriteinaquaculturewater.Thestrainexhibitsbroadnitrogentoleranceanddemonstratesexcellentdegradationperformanceacrossbothhighandlownitrogenconcentrations,makingitapromisingcandidateforaddressingeutrophicationinaquaculturewatertreatment.前言研究背景水产养殖为全世界的食品生产提供了巨大的潜力。在中国，48.79%的水产品来自池塘养殖。然而，随着对高产的不断追求，水产养殖中使用了大量的饲料和肥料，导致池塘水产养殖沉积物中有机物的积累和大量亚硝酸盐、氨和其他物质的产生，导致水质恶化，危害水产养殖动物的生长ADDINNE.Ref.{68390E11-3C81-42BF-8369-720BA102A966}[1]。同时，氮作为农业肥料被过度施用，会对生态环境产生不利影响，过量的营养物质（如氮、磷和有机物等）输入会导致水体富营养化、水华和赤潮等问题，进而影响水体池塘中微生物群落特征和功能ADDINNE.Ref.{B9D1179B-40AD-493B-B0B7-694CF652E5FB}[2]。水体中氮素的形态可分为有机氮和无机氮两大类,经过不同的微生物分解为不同形式的氮ADDINNE.Ref.{316A4C7A-8D16-405C-AA09-4137F4C777D0}[3],这几种形式的氮在水体中处于相互转化的动态平衡中。残饵粪便是养殖环境中最主要的氮来源,其中的有机氮首先在氨化菌的氨化作用下转化为氨氮,氨氮再由亚硝化细菌的亚硝化作用很快转化为亚硝态氮,后在水体溶解氧充足的情况下经过硝化细菌的硝化作用转化为硝态氮,但硝化细菌的繁殖速度很慢，因此限制了亚硝酸盐的转化，溶氧不充足时硝酸盐又会变成亚硝酸盐ADDINNE.Ref.{0735C4FD-8091-4000-8B9B-32B3102175A8}[4]。水产养殖中富营养化相关营养物质的主要汇集在池塘底部。含氮有机质是池塘沉积物中的主要污染物，它是由颗粒物沉淀产生的，在15cm以下的土层中，随着土层深度的增加，总磷（TP）含量增加，而总氮（TN）呈下降趋势，有机质主要集中在5-10cm处ADDINNE.Ref.{C140B499-6CBB-4CE4-83AF-25010C09099C}[3]。因此在氮循环中，如果大量的氮短时间进入水体而难以被天然微生物完全利用，可直接导致氮循环失衡，增加水体环境污染的风险水产养殖系统中积累的含氮化合物对水生动物有致命影响，尤其是当它们以较高的放养密度饲养时氨和亚硝酸盐在孵化场和养殖系统中通常呈指数级增长，水体中氨氮达到一定含量后，非离子氨易透过细胞膜进入体内，使得水生动物自身的生理调节不能补偿高铁血红蛋白升高而引发的体内组织缺氧ADDINNE.Ref.{918B2F4D-9BED-4BD2-83D6-EE210FA3B25C}[5]。当前水产养殖业面临着养殖密度增加、水质恶化、疾病频发等各种挑战，严重则水产养殖业的发展。水质恶化是水产养殖中的一个重要问题，氨氮和亚硝酸盐含量超标会危害养殖动物的生理健康ADDINNE.Ref.{929BE7BE-6E8D-4043-B1D2-7721C07157ED}[6]。水体氨氮含量过高威胁水生生物生长就算经常换水对其也是无济于事ADDINNE.Ref.{0D476053-E7C7-412B-B08E-768073A98B76}[7]。随着国内消费增长市场扩大，水产养殖不断发展，集约化养殖的兴起，大量的饵料投喂残留、水产动物的粪便等待造成水体富营养化导致养殖环境不断恶化ADDINNE.Ref.{F508D430-C73B-4ADE-AF16-FBDD87AF5F2A}[8]。硝态氮过量会使水体中的营养平衡失调，水环境质量降低，氮在有氧条件下可通过亚硝化和硝化作用生成亚硝态氮和硝态氮。据报道，水产养殖中有害病原微生物的耐药性是由抗生素和化学品的滥用引起的，水产品中的药物残留通过逐步富集食物链对人类健康构成严重威胁ADDINNE.Ref.{220A5769-7A0C-4FA7-8EE0-64AEA318926C}[9]。因此，为保证水产生物的安全和环境的保护，必须将无机氮素特别是亚硝态氮和硝态氮的含量控制在合理的范围内。微生物在养殖水体中的作用微生物对水产养殖的各个环节都有直接或间接的影响，包括但不限于生产、物质循环、动物营养、疾病控制和排放尾水等方面。它们在水产养殖的同化和异化食物链中起着至关重要的作用，并构成了该微环境中食物链的基础ADDINNE.Ref.{77D8600E-B561-4ADD-8570-0950837EA7B2}[6]。近几年，利用有益微生物的代谢作用消除水体过量的氮取得了一定成效，如发现光合细菌（Rhodopseudomonassphaeroides）ADDINNE.Ref.{C6D6F0BA-C8A9-4C71-9217-486262665109}[12]、芽孢杆菌（Bacillussubtilis）ADDINNE.Ref.{F5A20923-07C3-4E6D-9924-CD87606D4B98}[2]、乳酸菌ADDINNE.Ref.{A9CA75F8-A806-4666-8FA6-2C317D2636C2}[13]、伊丽莎白拮抗菌ADDINNE.Ref.{4DBCC5F0-63DB-4B5F-A7B5-878C1B84166D}[14]等均具有净化水质的作用。硝化作用是全球氮循环中的关键过程之一，在氮化过程中，微生物能将氨完全氧化成硝酸盐ADDINNE.Ref.{44CBD77D-E5DD-4969-8F34-3C425028E00E}[15]。在水产养殖产品的安全性方面，对抗生素耐药微生物的日益关注导致了替代疾病预防方法的策略，例如应用非致病性细菌作为潜在的替代生物防治剂和微生物,生物防治候选物和免疫刺激剂，在预防疾病、改善水质、增加水产养殖的贵和质量以及作为水生动物的潜在食物来源方面发挥着关键作用研究的目的与意义以微生物降解为基础的生物修复技术是消除环境中亚硝酸盐的主要方式ADDINNE.Ref.{C9D83CBA-A350-43AA-BB41-A9441FBD0B86}[16]，当前亚硝酸盐降解菌研究存在菌种资源单一（集中于芽孢杆菌属）和实际应用研究薄弱等局限。因此，本研究旨在从水产养殖环境中分离筛选高效亚硝酸盐降解功能菌株，解析其在不同氮源条件下的代谢特性及环境适应性，探明关键环境因子对菌株脱氮效能的影响机制，评估其在养殖水体原位修复中的应用潜力，为解决水产养殖中亚硝酸盐污染问题提供优质菌种资源和理论依据。本研究成果将具有双重价值：①实践层面，筛选获得的高效菌株可通过原位生物修复减少养殖水体换水频次，降低尾水排放量和养殖成本，推动水产养殖绿色转型；②理论层面，通过揭示菌株脱氮系统特性及其环境响应机制，可丰富亚硝酸盐降解微生物资源库，完善微生物硝化-反硝化协同作用理论体系，为构建环境友好型水质调控技术奠定基础。研究对促进农业可持续发展具有重要生态和经济价值。

试验方法实验材料菌株筛选择培养基富集培养基(g)：DM基本培养基（/L）：C6H5Na3O75.64g，KH2PO41.5g，Na2HPO40.42g，MgSO4·7H2O0.1g，NaNO21.5g，pH7.0。(固体培养基加2%的琼脂)，pH7.0，121°C高压灭菌20min；筛选培养基(g)：NaNO20.7，CH3COONa3.4，K2HPO4·3H2O1.0，Fe3PO4·4H2O0.01，MgSO4·7H2O0.01，NaCl30，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121°C高压灭菌20min测定培养基：在筛选培养基基础上适当调整亚硝酸钠含量；LB培养基(g)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl10，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121°C高压灭菌20min。无机氮源混合液：c（NH+4-N）∶c（NO3-N）∶c（NO2-N）=5∶1∶1。为便于了解细菌的转化能力和转化动态，为模仿真实水体中的亚硝酸盐硝酸盐和氮含量配置混合氮源：NH4Cl0.229g，NaNO30.0728g，NaNO20.0592g，MgSO4·7H2O0.0390g，CaCl20.0550g，FeSO4·7H2O0.0100g，CuSO4·5H2O0.0000240g，K2HPO413.9g，KH2PO45.30g，溶于1L蒸馏水中，用NaOH或HCl调节溶液pH值至7。主要仪器设备电子天平，立式压力蒸汽灭菌锅，超低温冰箱，冰箱，超纯水机，恒温震荡培养箱，酶标仪，水质检测仪。菌株的筛选我们在佛山市顺德区5个不同的养殖池塘中，用采样瓶采集水样和池塘底泥样品,分别采取4瓶水样和3瓶泥样，做好标记，分别为：水样1、水样2、水样3、水样5、泥样1、泥样3、泥样4。装入冰盒中后立即带回实验室。在无菌条件下，以5%(V/V)的接种量接种至装有100mL液体筛选富集培养基的无菌锥形瓶中，于37℃，200r/min摇床中培养。培养48h后重新接种到新鲜富集培养基中，反复培养4代。将培养4代后的菌液进行梯度稀释后涂平板。准备好筛选富集培养基，取适量富集培养36h的培养液进行梯度稀释(10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6)，取100μL涂布于亚硝酸盐固体筛选培养基(1000mL:C6H5Na3O75.64g，KH2PO41.5g，Na2HPO40.42g，MgSO4·7H2O0.1g，NaNO21.5g，pH7.0。(固体培养基加1.5%的琼脂)，置于37℃恒温培养箱中培养，分别挑取菌落形态颜色大小不同的单菌落再次划线培养，经3次划线纯化后得到菌株纯培养。挑选单菌落，在富集固体培养基上划线，37℃孵育48h。将之前划线分离纯化好的菌接到PA瓶，在超净工作台中用同一批次的亚硝酸盐液体培养基用移液枪分装5ml至灭过菌的PA瓶中，然后观察平板中菌的形态颜色，确认是纯化单一的菌后用一次性接种环将单菌落接种到PA瓶中搅拌数次确接种环上的菌充分接入液体培养基中，将PA瓶盖子拧紧，做好标记，放入37℃180r/min摇床振荡培养24h后，将生长情况良好浓度混浊的菌液接至甘油中放进超低温冰箱保存，接700微升的菌液至700微升60%的甘油中，每个样品接两管，做好标记，接完后用接种环接到亚硝酸盐固体培养基中划线之后放入培养箱，等待菌株生长后判断菌株是否纯净无杂菌。筛选出生长情况良好的菌株分离菌株种子液，与60%无菌甘油(质量比)等体积(700μL)混合均匀，于–80°C冰箱保存。图1池塘水样图2池塘底泥样菌株的活化取出保存于实验室-80°C冰箱中的单菌株划线，活化于亚硝酸盐筛固体培养基中，待长出单菌落后挑菌至亚硝酸盐液体培养基中于30℃、150r/min下培养24h。实验步骤亚硝酸盐降解去除率的计算去除率的计算公式为：R=(C0−Ct)/C0×100%。式中：R为去除率；C0为初始浓度；Ct实验后的浓度。菌株的初步筛选通过检测各个菌株的亚硝酸盐降解率作为菌株的初步筛选指标。实验前先用亚硝酸盐液体培养基活化培养菌株24h以保证菌株的活性。分别接入2%的菌液于亚硝酸盐鉴定培养基中，每组设置3个重复，于30℃、150r/min条件下恒温震荡培养3d，每24h取样检测定培养基中亚硝酸盐的含量以及OD600值，比较各个菌株的亚硝酸盐代谢能力，计算亚硝酸盐降解率，筛选具有较高亚硝酸盐降解能力的菌株用于后续实验。实验每组设置平行重复3次。菌株的鉴定形态学鉴定和生理生化鉴定:分离纯化菌株，平板涂布接种于富集固体培养基中培养，待菌落长出后，观察菌落的大小、形态、颜色等特征。然后进行生理生化鉴定。分子生物学鉴定:以纯化培养后的菌液为模板，以5'-AGAGTTTGATCMTGGCTGAG-3'和5'-TACGGYTACCTTGTTACGAGTT-3'分别为上、下游引物，PCR扩增16SrRNA焦磷酸测序的分析和定量部分序列配置体系一式两份。扩增程序为:94℃预变性4min;94℃30s，58℃30s,72℃90s，35个循环;最后72℃延伸10min。用1%的琼脂糖配置琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将其送至华大基因进行16SrDNA测序。菌株降解特性研究菌株生长对亚硝酸盐降解的影响将分离的菌株种子液按2%的接种量接入以亚硝酸盐为唯一氮源的亚硝酸盐筛选培养基中，于30°C、150r/min恒温摇床振荡培养。分别于24h，48h，72h后测定培养基中亚硝酸盐的降解率以及菌株生长量。实验重复3次。作为菌株初筛研究。pH值对菌株降解亚硝酸盐的影响将分离的菌株种子液按2%的接种量接入pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0的测定培养基中，于30°C、150r/min恒温摇床振荡培养。分别于24h，48h，72h后测定培养基中亚硝酸盐的降解率以及菌株生长量。实验重复3次。温度对菌株降解亚硝酸盐的影响将分离菌株种子液按2%的接种量接入测定培养基中，分别于23°C、30°C、37°C的恒温摇床上，150r/min振荡培养，分别于24h，48h，72h后测定培养基中亚硝酸盐的降解率以及菌株生长量。实验重复3次。混合氮源下菌株降解特性在无机氮源混合液中接入2%的菌株种子液，于30℃恒温摇床上150r/rim震荡培养，分别于24h，48h，72h测量培养基中亚硝酸盐氨氮以及硝酸盐的含量，计算其降解率。

实验结果与分析菌落形态学特征观察结果对养殖鱼塘中采集的水样与泥样进行富集培养，从中分离纯化得到19株能够在以亚硝酸盐为唯一氮源上生长的菌株，分别编号为S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、15、S16、S17、S18、S19、S20、S21和S22。各菌株的形态特征如图3、图4、图5、图6和图7所示。各菌株的形态特征描述如表1所示。图3菌株S1,S3,S4,S5形态图图4菌株S6,S7,S8,S9形态图图5菌株S10,S11,S12,S13形态图图6菌株S14,S16,S18,S19形态图图7菌株S19,S21,S22形态图

表1菌株形态学特征表菌株菌落颜色透明度菌落形状隆起程度表面光泽表面状态S1黄色不透明近圆形凸起有光滑S3黄色不透明近圆形凸起有光滑S4乳白色不透明圆形凸起有粘稠S5白色不透明圆形凸起有光滑S6黄色不透明近圆形凸起有光滑S7乳白色不透明圆形凸起有光滑S8白色不透明圆形凸起有光滑S9黄色不透明圆形凸起有光滑S10灰白不透明圆形凸起有粘稠S11白色不透明圆形凸起有光滑S12白色不透明圆形低隆有光滑S13白色不透明圆形低隆有光滑S14白色半透明圆形扁平有粘稠S16淡黄色不透明圆形凸起有光滑S18白色不透明圆形凸起有光滑S19乳白半透明近圆形低隆有光滑S20灰白色不透明圆形凸起有光滑S21S22黄色黄色不透明不透明圆形圆形低隆低隆有有光滑光滑菌株亚硝酸盐初筛降解率以及生长情况将19株菌分别接种到以亚硝酸盐为唯一氮源的筛选培养基中培养，每隔24h取样进行亚硝酸盐浓度测定，连续测定72h，计算亚硝酸盐的降解率，结果如图8、图9和图10所示。培养72h后，测定菌液的OD值，结果如图11所示。图8菌株S1~S7亚硝酸盐降解情况图9菌株S8~S13亚硝酸盐降解情况图10菌株S14~S22亚硝酸盐降解情况图11各菌株培养72h后的浓度测定结果显示，在第一天经过24h菌株S12的降解率为当天最高达到39.04%，在48h后菌株S4，S10，S12，S13，S19的降解率分别达到66.37%，60.06%，72.37%，67.57%，68.73%，降解率均位于百分之六十以上。而72h时，只有S4，S10，S19亚硝酸盐降解率可达百分之九十以上，S4亚硝酸盐降解率为95.20%，S10降解率为92.79%，S19降解率最高，达到了96.46%，且生长状态良好，OD600值达到了0.737。其余S4，S8，S10浓度同样较高生长状态良好分别达到了0.752，0.754，0.735。但S8的亚硝酸盐降解率较低，仅达到45.05%。于是筛选出S4，S10，S19作为进一步研究目标探究其在不同环境因子下的降解特性以及进行进一步的生理生化鉴定和分子生物学鉴定。菌株生理生化鉴定S4，S10和S19菌株的生理生化鉴定结果如下表2所示。结果显示，其中菌株S4和S10甘露醇、葡萄糖、硝酸盐还原、木糖和柠檬酸盐均呈阳性，吲哚实验呈阴性；菌株S19甘露醇、木糖和吲哚实验呈阴性，葡萄糖、柠檬酸盐和硝酸盐还原呈阳性。表2菌株的鉴定结果检测实验菌株S4菌株S10菌株S19甘露醇++-吲哚实验葡萄糖+++硝酸盐还原+++木糖柠檬酸盐++++-+菌株16sDNA鉴定（1）菌株16SrDNA扩增及检测对19株菌株进行PCR扩增，其PCR扩增产物的凝胶电泳如下图12所示。其左测为1500DNAMaker条带，右侧为样品条带。凝胶图条带清晰，表明扩增成功，可送去测序。图12PCR电泳条带图（2）测序结果及鉴定将测序结果在NCBI上面进行Blast比对鉴定，结果显示，图13菌株进化树注：A:S4B:S10C:S19根据生理生化鉴定结果以及16SrDNA的鉴定，初步鉴定S4菌株和S10菌株为克雷伯氏菌，S19菌株为无色杆菌。不同pH下菌株降解特性为了探究这3株菌在不同pH条件下的降解性能，把菌株接种到不同pH条件下的亚硝氮培养基中培养72h，每隔24h取样，测定培养基中亚硝氮含量，计算得到亚硝酸盐的降解率。S4、S10和S19的检测结果分别如下图14、图15和图16所示。图14菌株S4亚硝酸盐降解情况图15菌株S10亚硝酸盐降解情况图16菌株S19亚硝酸盐降解情况实验结果显示，在pH为5时菌株S10，S19无生命力几乎无降解能力，只有菌株S4还能生长且具有一定降解效率，在pH6时菌株降解效率较低下，S4在第一天的亚硝酸盐降解率为10.67%，第二天为17.67%，第三天为28.33%，菌株S10与S19的降解效率都十分低下不达10%。当pH值为7时，菌株S4第一天降解率为32.00%第二天为46.33%第三天为94.33%，菌株S10第一天降解率为13.67%，第二天为46.67，第三天为94.67%，菌株S19第一天降解率为38.67%，第二天为96.67%，第三天为99.61%，菌株S19在pH为7时第二天即可大量降解亚硝酸盐，第三天时几乎完全降解亚硝酸盐，降解效率高效。在pH为8时菌株S10的降解能力相对较差，第一天亚硝酸盐降解率仅3.49%，第二天时达到25.40%，第三天为36.03%。菌株S10第一天亚硝酸盐降解率为24.13%，第二天为37.14%第三天为56.19%。在pH为8时菌株S19的亚硝酸盐降解更为高效，第一天降解率已高达96.19%第二天第三天为99.54%，由此可见菌株S19更好碱性而不耐酸，在pH为8时亚硝酸盐降解性能达到最好。菌株S4对酸碱耐受度较好，在pH为7时亚硝酸盐降解性能达到最好。菌株S10在pH为5时耐受程度较差，在pH为7时亚硝酸盐降解性能达到最好。不同温度下菌株降解特性在研究不同环境因子对菌株降解亚硝酸盐能力的影响中，分别检测了温度在23℃，30℃，37℃时菌株的降解性能。实验结果如图所示。图17菌株S4亚硝酸盐降解情况图18菌株S10亚硝酸盐降解情况图19菌株S19亚硝酸盐降解情况结果显示，在23℃的脱氮过程中，三种菌株的降解能力都受到限制，其中菌株S4降解能力受到较大限制，第一天亚硝酸盐降解率仅为7.89%，第二天为9.94%，第三天为21.64%。菌株S10第一天亚硝酸盐降解率为4.68%，第二天为26.02%，第三天达到43.57%，降解情况相对较好。菌株S19第一天亚硝酸盐降解率9.94%，第二天为15.79%，第三天为21.64%。在30℃的脱氮过程中，三种菌株的亚硝酸盐降解能力良好，第一天菌株S4的亚硝酸盐降解率为12.57%，S10的降解率为19.59%,S19的降解率相对较低，为3.22%，第二天时菌株S4,S10,S19的降解率基本持平，分别为46.63%，45.03%，43.27%。第三天时，三种菌株的亚硝酸盐降解情况良好基本降解了大量亚硝酸盐，降解率都达到百分之九十以上，分别为93.89%，92.84%，95.32%。当温度为37℃时，S19的亚硝酸盐降解能力得到略微提升，第一天降解率为19.01%，第二天降解率就达到89.13%，第三天降解率高达97.37%，菌株S4和S10第一天亚硝酸盐降解率分别为29.53%和27.49%，相较于菌株S19第一天的降解情况较好，但第二天降解率分别为50.58%和41.81%，第三天降解率分别为63.74%和72.22%，三天后的亚硝酸盐降解率能力相对下降。由此可见菌株S4和S10的相对最适温度为30℃，而菌株S19的相对最适温度为37℃，在温度较低时亚硝酸盐降解能力受到明显抑制，在温度升高时亚硝酸盐降解能力得到提升。混合氮源下菌株降解特性在研究混合氮源下菌株的降解特性，以氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐为氮源，研究三种菌株的降解特性，实验结果如图。图20菌株S4的降解情况图21菌株S10的降解情况图22菌株S19的降解情况三种菌株都具有良好的氨氮代谢效果，在第一天时能降解大部分的氨氮，最后的氨氮去除率达到97%以上。在第一天时，亚硝酸盐和硝酸盐的含量都略微升高，三天内亚硝酸盐浓度趋势先升后降，最后还是能达到较好的亚硝酸盐去除率。菌株S19有一定硝酸盐降解能力，在第三天时能将硝酸盐一定降解，其他两种菌株则几乎不含硝酸盐降解能力，在第三天时硝酸盐浓度水平依旧较高。

结果与展望结论水产养殖作为农业产业的重要组成部分其具有巨大的价值和潜力。我国作为世界第一水产大国，产量多年位于世界前列。随着对高产的追求，水产养殖使用大量的饲料以及高密度养殖下水产养殖底泥有机物积累大量亚硝酸盐等氮素导致水质恶化，危害水生动物的健康，因此利用微生物脱氮这一绿色无害的生物技术对于水产养殖的绿色可持续发展是十分重要的。通过对综合生态养殖系统水体的泥样水样中的脱氮微生物进行筛选富集以及纯化，得到19种菌株，将19种菌株分别编号接入亚硝酸盐筛选培养基中，经过形态学特征观察以及分子生物学分析，选择出前三株亚硝酸盐代谢性能较好的亚硝酸盐降解功能菌进行进一步研究，初步筛选出在3d内亚硝酸盐降解率能达到90%以上的有菌株S4,S10和S19。根据生理生化鉴定结果以及16SrDNA的鉴定，初步鉴定S4菌株和S10菌株为克雷伯氏菌，S19菌株为无色杆菌。通过不同环境因子研究了在不同PH以及不同温度情况下对三种菌株亚硝酸盐代谢性能的影响，经分析得出以下结论：（1）在去除亚硝酸盐能力检测中，有三株菌株具有较好的亚硝酸盐去除效果（90%以上）且这三株菌株的去除效果显著高于其他菌株。随着培育时间的增加，培养基中亚硝酸盐的浓度逐渐降低，亚硝酸盐被菌株降解，在培育3d后降解率分别达到95.20%，92.79%，96.46%。（2）其中菌株S19达到较好降解亚硝酸盐性能的环境因子温度为37℃，pH值为8，在37℃时仅需48h亚硝酸盐降解效率达到89.13%，在72h后亚硝酸盐降解效率高达97.37%，在pH为8时仅需24h亚硝酸盐降解效率已达96.19%，在48h后降解效率高达99.54%。菌株S4,S10达到较好降解亚硝酸盐性能的环境因子温度为30℃，pH值为7。其中菌株S4在30℃和pH为7培育3d后亚硝酸盐降解率为93.89%和94.33%，菌株S10在30℃和pH为7培育3d后亚硝酸盐降解率为92.84%和94.67%，都达到了较好的亚硝酸盐降解性能。菌株S4与菌株S10具有相似的亚硝酸盐降解能力，菌株S19的亚硝酸盐代谢效果更优于另外两种菌株，且更好碱性环境和更好高温，但菌株S19不耐酸，在pH为5时菌株无法生长，在pH为6时菌株生长以及亚硝酸盐降解能力都受到较大抑制，而S10对酸的耐受程度较好在pH为5-6时仍能生长且具有一定亚硝酸盐降解能力。在试验期间，S4，S10，S19三株菌株具有较好的亚硝酸盐去除效果（90%以上）且这三株菌株的去除效果显著高于其他菌株。在pH为5时菌株S10与S19对酸的耐受程度较差，菌株无法正常生长，在pH偏酸时亚硝酸盐降解能力受到很大抑制，而菌株S4受酸性抑制情况相对较好。三种菌株在温度较低时亚硝酸盐降解效率降低，因为温度降低时微生物的活性降低，所以导致其亚硝酸盐代谢性能降低。展望本文着重研究微生物对水产养殖废水中的亚硝酸盐去除效果，发现菌株S4与菌株S10克雷伯氏菌与菌株S19无色杆菌对于养殖水体中的过量亚硝酸盐具有良好的净化效果。针对所筛选得到的菌株优化其规模培育条件可为制备微生物制剂提供生产基础。若后续能针对水产养殖条件实际情况将其应用于养殖尾水中，不但能净化水质，还可以使污水资源转化为生物资源，对农业水产废水处理技术有着一定的推动作用。微生物脱氮是绿色可持续发展的净水技术，我们要关注水产养殖水体的生态处理，才能推动农业水产的发展，推动绿色发展和可持续发展。因为本研究取样仅为佛山市的淡水养殖场中的水样，所以研究内容还存在一定局限性。除此之外，可以选择更多更广的地方采集样品筛选多种微生物，如海水和淡水。同时也应根据养殖区域的气候条件（温度湿度和酸碱度）选择适合微生物和不同养殖阶段的时间节点进行微生物的使用，从而取得更好亚硝酸盐降解效果，更好的净化水质。

参考文献ADDINNE.Bib[1]. Hu,D.,etal.,Coremic