辛伐他汀纳米粒对脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

辛伐他汀纳米粒对脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响摘要本研究旨在探究辛伐他汀纳米粒对脂多糖（LPS）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的影响及其潜在机制。通过制备辛伐他汀纳米粒，以不同浓度作用于经LPS刺激的HUVECs，运用流式细胞术、Westernblot等实验方法，检测细胞凋亡率及相关凋亡蛋白表达水平。结果表明，辛伐他汀纳米粒可显著降低LPS诱导的HUVECs凋亡率，并调节相关凋亡蛋白的表达，提示其对LPS刺激的HUVECs具有保护作用，为进一步揭示辛伐他汀纳米粒在炎症相关血管内皮损伤中的作用机制提供理论依据。关键词辛伐他汀纳米粒；脂多糖；人脐静脉内皮细胞；细胞凋亡一、引言人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为血管内皮的重要组成部分，在维持血管稳态、调节炎症反应以及物质交换等生理过程中发挥着关键作用。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，当机体受到细菌感染或处于炎症状态时，LPS可大量释放入血，与血管内皮细胞表面的受体结合，引发一系列炎症反应，导致内皮细胞功能紊乱甚至凋亡，进而破坏血管内皮屏障完整性，参与多种心血管疾病及炎症相关疾病的病理进程。辛伐他汀是一种广泛应用的他汀类降脂药物，除了调节血脂外，还具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种多效性作用。纳米粒作为一种新型药物递送系统，具有提高药物稳定性、增加药物靶向性、改善药物药代动力学和药效学特性等优势。将辛伐他汀制备成纳米粒，有望增强其对血管内皮细胞的保护作用，更有效地抑制LPS诱导的细胞凋亡。然而，目前关于辛伐他汀纳米粒对LPS刺激的HUVECs凋亡影响的研究尚未见报道。因此，本研究旨在探究辛伐他汀纳米粒对LPS刺激的HUVECs凋亡的影响，并初步探讨其潜在作用机制，为拓展辛伐他汀纳米粒在炎症相关血管内皮损伤治疗中的应用提供理论依据。二、材料与方法（一）实验材料细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自中国典型培养物保藏中心。主要试剂：辛伐他汀（Sigma公司）、脂多糖（LPS，Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、DMEM培养基（Gibco公司）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BD公司）、RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、兔抗人Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3多克隆抗体（CellSignalingTechnology公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（CellSignalingTechnology公司）、ECL化学发光试剂盒（Millipore公司）。主要仪器：CO₂培养箱（ThermoFisherScientific公司）、倒置相差显微镜（Olympus公司）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、流式细胞仪（BD公司）、蛋白质电泳系统（Bio-Rad公司）、化学发光成像系统（Tanon公司）。（二）辛伐他汀纳米粒的制备采用乳化-溶剂挥发法制备辛伐他汀纳米粒。具体步骤如下：称取一定量的辛伐他汀和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），溶解于二氯甲烷中作为油相；将聚乙烯醇（PVA）溶解于超纯水中作为水相。在磁力搅拌下，将油相缓慢滴入水相中，继续搅拌2h，使二氯甲烷充分挥发，得到辛伐他汀纳米粒混悬液。通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形态，激光粒度仪测定其粒径和电位。（三）细胞培养与分组处理将HUVECs接种于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞生长至80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，进行传代培养。实验分为以下5组：正常对照组：正常培养的HUVECs，不做任何处理。LPS模型组：向细胞培养液中加入LPS，终浓度为1μg/mL，刺激24h。辛伐他汀纳米粒低浓度组：先加入不同浓度（5μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。辛伐他汀纳米粒中浓度组：先加入不同浓度（10μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。辛伐他汀纳米粒高浓度组：先加入不同浓度（20μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。（四）细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC/PI双染法，通过流式细胞术检测细胞凋亡率。具体操作如下：分组处理结束后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入500μL结合缓冲液重悬细胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min，立即用流式细胞仪检测，每个样本至少检测10000个细胞，结果用FlowJo软件进行分析。（五）Westernblot检测凋亡相关蛋白表达分组处理结束后，弃去培养液，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃、12000r/min离心15min，收集上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h，加入兔抗人Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3多克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000稀释），室温孵育2h，再次用TBST洗涤3次，每次10min。最后，加入ECL化学发光试剂，于化学发光成像系统中曝光显影，以β-actin作为内参，用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。（六）统计学分析采用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用Tukey检验，P<0.05为差异具有统计学意义。三、结果（一）辛伐他汀纳米粒的表征透射电子显微镜观察结果显示，制备的辛伐他汀纳米粒呈球形，大小均匀，表面光滑（图1A）。激光粒度仪测定结果表明，纳米粒的平均粒径为（180.5±15.2）nm，电位为（-25.3±3.1）mV（图1B）。（二）辛伐他汀纳米粒对LPS诱导的HUVECs凋亡的影响流式细胞术检测结果显示，与正常对照组相比，LPS模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）；与LPS模型组相比，辛伐他汀纳米粒低、中、高浓度组细胞凋亡率均显著降低（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性（图2）。（三）辛伐他汀纳米粒对凋亡相关蛋白表达的影响Westernblot检测结果显示，与正常对照组相比，LPS模型组Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；与LPS模型组相比，辛伐他汀纳米粒低、中、高浓度组Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性（图3）。四、讨论本研究成功制备了辛伐他汀纳米粒，并对其进行了表征，结果显示纳米粒具有良好的形态、合适的粒径和电位，为后续实验奠定了基础。实验结果表明，LPS刺激可显著诱导HUVECs凋亡，这与以往研究结果一致。LPS与HUVECs表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活下游NF-κB等信号通路，引发炎症反应，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达，激活caspase-3级联反应，导致细胞凋亡。本研究发现，辛伐他汀纳米粒可显著降低LPS诱导的HUVECs凋亡率，且呈浓度依赖性。进一步研究其作用机制发现，辛伐他汀纳米粒能够调节凋亡相关蛋白的表达，下调Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平，上调Bcl-2蛋白表达水平。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡的调控中起关键作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值的变化可决定细胞是否发生凋亡。Cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，其激活是细胞凋亡执行阶段的关键事件。辛伐他汀纳米粒可能通过调节Bcl-2家族蛋白的平衡，抑制caspase-3的激活，从而发挥抗凋亡作用。辛伐他汀的抗凋亡作用可能与其抑制甲羟戊酸途径有关。甲羟戊酸途径是胆固醇合成的关键途径，同时也是许多重要生物活性分子如异戊二烯焦磷酸、法尼基焦磷酸和香叶基香叶基焦磷酸等的合成途径。这些生物活性分子参与细胞内多种信号传导通路的调节，包括Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-Akt等。辛伐他汀通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶），阻断甲羟戊酸途径，减少这些生物活性分子的合成，进而调节相关信号通路，发挥抗炎、抗凋亡等作用。纳米粒作为药物载体，可提高辛伐他汀在细胞内的摄取效率，增强其对细胞的保护作用。然而，本研究仅初步探讨了辛伐他汀纳米粒对LPS刺激的HUVECs凋亡的影响及其潜在机制，仍存在一定的局限性。例如，未深入研究辛伐他汀纳米粒调节凋亡相关蛋白表达的具体信号通路；在体内实验方面尚未开展相关研究，其在体内的作用效果和安全性还需进一步验证。五、