CN113795514B 制备抗体的方法 （豪夫迈·罗氏有限公司）

2021.11.08PCT/US2020/0319142020.05.07WO2020/227554EN2020.11.12WO2016172485A2,2016.10.27WO2014082179A1,2014.06.05抗体)的重链和轻链的配对的方法。还提供了使2其中所述第一重链和所述第一轻链形成与第一抗原结合的对且其中所述第二重链和之间以及第二重链和第二轻链之间的同源配对优将所述第一轻链的轻链可变结构域(VL)的94位处的不带电荷的氨基酸取代为天冬氨酸将所述第一重链的重链可变结构域(VH)的95位处的不带电荷的氨基酸取代为天冬氨酸其中所述VL的94位、所述VL的96位和所述VH的95位处的取代引入抗HER2/抗CD3双特异其中通过所述方法生成的双特异性抗体包含如QQNNEDPRT所示的依照Kabat的CDRL3和如DGYYPYAM__DN所示的依照Kab2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述双特异性抗体经历至少一个亲和第二CH2结构域(CH22)和第二CH3结构域；8.根据权利要求7所述的方法，其中所述杵突变包含T3634[0002]本申请要求2019年5月9日提交的美国临时专利申请第62/845,594号的优先权权[0004]以下提交的ASCII文本文件的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可式的双特异性抗体具有挑战性，因为抗体重链已经进化为以相对杂乱的方式结合抗体轻然导致例如重链同源二聚化和重链/轻链配Merchantetal.“AnefficientroutetohumanbispecificIgG.”NattoidentifyatherapeutichumanbispecificantibodythatinhibitsIgE化变得更加困难。旨在解决重链/轻链混乱的双特异性抗体形式包括：DVD_Ig(双可变结构域Ig)(NatureBiotechnology25,1290_1297(2007))；交叉Ig(CROSSMABM) (SchaeferWetal(2011)PNAS108(27):11187_11192)；二合一Ig(Two_in_OneIg) (2014)“GenerationofbispecificIgGantibodiesbystructure_baseddAntibodyEngineeringStrategyforMakingMonovalentBispecificHeterodimericIgGAntibodiesbyElectrostaticSteeringMechanism.”JBiolChem.PublishedonlineJanuary12,2015,doi:10.1074/jbc.M114.620260；Mazoretal.2015.“ImprovingtargetcellspecificityusinganovelmonovalentbispecificIgG19420862.2015.1007816；WO2014/081955、WO2014/082179和WO2014/150973所述的策略。5[0008]然而，本领域仍然需要减少错误配对的重链/轻链副产物和增加正确组装的双特变结构域(VL)的94位处或VL的96位处的至少一个氨基酸从不带电荷的残基取代为带电荷的的氨基酸中的每一者从不带电荷的残基被取代成带电荷的残基的步骤。在一些实施例中，和轻链的优先配对的抗体)经历至少一个亲改变，使得在CH31/CH32界面内，一H31/CH32界面内，一个或多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取施例中，空腔是臼突变(holemutation)。在一些实施例中，臼突变包括T366S、L368A和6[0014]图1A和1B提供了抗LGR5/抗IL4双特异性抗体的高分辨率液相色谱质谱(LCMS)数[0015]图1C和1D提供了抗SIRPα/抗IL4双特异性抗体的高分辨率LCMS数据，即中间产率[0018]图3说明了为研究抗EGFR/抗METBsIgG和抗_IL_4/抗_IL_13BsIgG中优先HC/LC[0019]图4A提供了抗MET抗体onartuzumab(参见Merchantetal.(2013)PNASUSA110:E2987_2996)(SEQIDNO:1)和抗EGFR抗体D1.5(参见Schaefe来自Kabatetal.SequencesofNIH,1991的序列定义的CDR以及Chothia和Lesk(1987)JMolBiol196:901_917的结构定[0020]图4B提供了抗MET抗体onartuzumab(SEQIDNO:3)和抗EGFR抗体D1.5(SEQIDNO:4)的重链可变结构域(VH)的比对。氨基酸残基是根据Kabat编号。来自Kabatetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.Bethesda,MD:NIH,1991的序列定义的CDR以及Chothia和Lesk(1987)JMolBiol196:901_917的结构定义用阴影[0021]图5A提供了为评估抗_EGFR/抗MET双特异性抗体的抗EGFR臂的互补决定区(CDR)异性抗体的抗MET臂的CDRL3和CDRH3对BsIgG产率的贡献而进行[0022]图5B提供了为评估抗IL_4/抗IL_13双特异性抗体的抗IL_4臂的CDRL3和CDRH3对BsIgG产率的贡献而进行的实验的结果。还提供了为评估抗IL_4/抗IL_13双特异性抗体的抗IL_13臂的CDRL3和CDRH3对BsIgG产率的贡献而进行的实验[0023]图6提供了为评估CDR_L1+CDR_H1、CDR_L2+CDR_H2和CDR_L3+CDR_H3对抗EGFR/抗MET双特异性抗体的BsIgG产率的贡献而进行的实验的[0024]图7提供了抗METFab(PDB4K3J)的X射线结构，其突出了CDRL3和CDRH3接触残[0025]图8A提供了抗IL_13抗体lebrikizumab(参见Ultschetal.(2013)JMolBiol425:1330_1339)(SEQIDNO:5)和抗_IL_4抗体19C11(参见Spiessetal.(2013)JBiol7义以及Chothia和Lesk的结构定义的C[0026]图8B提供了抗IL_13抗体lebrikizumab(SEQIDNO:7)和抗_IL_4抗体19C11(SEQIDNO:8)的重链可变结构域(VH)的比对。氨定义以及Chothia和Lesk的结构定义的CD[0028]图10A提供了实验结果，这些实验是为了评估以下项对B(a)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗CD3臂的CDRL3和CDRH3替换为抗MET的CDRL3和IL_13的CDRL3和CDRH3；以及(d)将抗CD3/抗HER2双特异性抗体的抗HER2臂的CDRL3和CDRH3替换为抗IL_13的CDRL[0029]图10B提供了实验结果，这些实验是为了评估以下项对B(a)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗VEGFA臂的CDRL3和CDRH3替换为抗MET的和CDRH3；(b)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗_ANG2臂的CDRL3和CDRH3替换为抗_MET的CDRL3和CDRH3；(c)将抗VEGFA/抗ANG2双特异性抗体的抗VEGFA臂的CDRL3和CDR的CDRL3和CDRH3替换为抗IL_13的CDRL3和CDR[0030]图11提供了为评估链间二硫键对以下双特异性抗体的BsIgG产率的贡献而进行的混乱。本文所述的方法基于申请人的发现，即优先的抗体重链/抗体轻链会受到CDR_H3和移到其他无关抗体中的相应氨基酸位置增加了正确组装的Bs普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton,etal.,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,2DEd.,JohnWileyandSons,NewYork(1994),andHale&Margham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)提和材料的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材8领域技术人员会理解/认识到，任何免疫球蛋白类别的抗体都可用于本文所述的本发明方原结合位点，而分泌IgA抗体可聚合以形成包含2_5个基本4_链单元以及J链的多价组合[0040]来源于任何脊椎动物的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种明H序列和L结构域”包含免疫球蛋白轻链的恒定区结构域，其例如从约Kabat位置107A_216(EU位置108_214(ĸ))延伸。KappaC结构域的Eu/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html在线获得，LambdaC结构域的Eu/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_9EU/Kabat转换表可在www(dot)imgt(dot)org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_构域_结构域配对的取代，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.lmmunol.22:161_206定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealth列通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选包含CH4结构域。本文中的小鼠IgG2a。Fc区包含通过二硫化物连接在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区也是由某些类型的细胞上存在和95_102(H3)处的CDR(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunological序列。子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白和/或其受体，例如细胞因子和/或细胞因子受体、除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表为人免疫球蛋白。更多详情参见Jonesetal.,《自然》(Nature)321:522_525(1986)；(Curr.Op.Struct.Biol.)2体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。例如，可使用BIAcoreTM_2000或BIAcoreM_3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在及N_羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。(BIAcoreEvaluationSoftware3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)被计算为比率koff/kon。参见例如Chenet的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM_Aminco分光光度计养物中分离和/或回收的异源多聚体。其自然环境的污染物组分是会干扰对于异源多聚体选地大于99重量(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度(通过使LC1))和例和整个说明书中通过ATCC登录号识别的那些细胞的来源为美国典型培养物保藏中心，Biology(GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,NY,1989)；Innis等人，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,Inc.,NY,SpringHarbor,1988)；Gait,OligonucleotideSynthesis(IRLPress,Oxford,1984)；Freshney,AnimalCellCulture,1987；Coligan等人，CurrentProtocolsin[0086]如下文进一步详细描述的，本文提供的方法包括在重链和/或轻链多肽的可变结编号惯例包括Kabat和EU索引编号(参见Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。包括用于可变结构域的校正或替代编号系统的其他惯例包括Chothia(ChothiaC,LeskAM(1987),JMalBiol196:901_917；Chothia等人(1989),Nature342:877_883)、IMGT(Lefranc等人(2003),DevCompImmunol27:55_77)和AHo体序列的可变区氨基酸残基的位置的用于免疫球蛋白可变区的氨基酸序列编号方案。力集中于将一个或多个氨基酸取代引入可变结构域的框架区。参见例如Froning等人，[0090]在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括在Fc区中引入修饰以促进抗体(例将94位处和96位处两者的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残[0093]当在第一多肽与第二多肽之间发生配对的同时存在一个或多个额外的不同多肽对的量大于HC1/LC2配对的量，则优先配对发生在抗体(例配对的量，则优先配对发生在多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的例如HC2与LC2之间。HC1/LC1、HC1/LC2、HC2/LC1和HC2/LC2配对可通过本领域已知的方法(例如，液相色谱质谱[0095]在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸及HC和LC的优先配对)的方法，该方法原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为带电荷的残基的步骤，该带电荷的残基选自天冬氨包括将轻链可变结构域(VL)的91位处、VL的94位处或VL的96位处的至少一个氨基酸(例如94位处或96位处的至少两个氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基的步例中，该方法包括将91位处、94位处和96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)中的每一者从非供其中引入了上述取代的抗体。在一些实施例中，该方法包括提供结合本文其他地方描述[0100]在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族2H1的CH1结构域和L1的CL结构域中的上述任何突变可替代地例中，HC2进一步包含第二CH2(CH22)结构域和/或第二CH3(CH32)结构域。在一些实施例中，多个氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在CH32的表面上产生与CH31将轻链可变结构域(VL)的94位处和/或VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷[0106]在一些实施例中，94位处的氨基酸(例如原始氨基酸)被D取代以获得经修饰的抗[0107]在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从不带电荷的残基取代为括将轻链可变结构域(VL)的91位处、VL的94位处和/或VL的96位处的氨基酸(例如原始氨基处的氨基酸(例如原始氨基酸)中的每一者从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的[0111]在一些实施例中，该方法进一步包括将重链可变结构域(VH)的95位处的氨基酸(VH)的95位处的氨基酸(例如原始氨基酸)从非芳族残基取代为芳族残基以获得经修饰的括修饰VH和/或VL，例如通过将一个或多个上述取代引入VH和/或VL以获得经修饰的VH和/或和力成熟为一个过程，例如通过本文所述的方法获得的抗体的重链/轻链对通过该过程而的影响(参见Wu等人(1998)ProcNatlAca熟的细节也详述于例如Merchant等人(2013)ProcNatlAcadSciUSA.110(32):E2987_96；Julian等人(2017)ScientificReports.7:45259；Tiller等人(2017)Front.Immunol.8:986；Koenig等人(2017)ProcNatlAcadSciUSA.114(4):E486_E495；Yamashita等人(2019)Structure.27,519527；Payandeh等人(2019)JCell述的方法进一步包括以下步骤：(a)在一个或多个位置处诱变或随机化通过本文方法获得HC1/LC1和HC2/LC2)的双特异性抗体以如下相对产率进行[0121]根据本文所述的方法制备的经修饰的抗体(例如，经修饰的双特异性抗体)的HC1配对程度可经由轻链竞争测定(LCCA)来确定。于2013年10月3日提交的国际专利申请PCT/胞中以使得重链为限制性配对反应物的比率进行共表达；任选地将分泌蛋白与细胞分离；将与重链结合的免疫球蛋白轻链多肽与剩余分泌蛋白分离，以产生分离的重链配对部分；于生产具有单一公共轻链(LC)的人全长双特异性抗体(Merchant等人，“AnefficientroutetohumanbispecificIgG.”NatBiotechnol.1998；16:67781；Jackman等人，“Developmentofatwo_partstrategytoidentifyatherapeutichumanbispecificantibodythatinhibitsIgEreceptorsignaling.”JBiolChem.2010；明性实例包括但不限于例如WO2007147901(kjaergaard等人NovoNordisk：描述离子作用)；WO2009089004(Kannan等人Amgen：描述静电转向效应)；WO2010/034605(Christensen等人_Genentech；描述卷曲螺旋)。另参见例如Pack,P.&Plückthun,A.,[0128]美国专利公开号2009/0182127(NovoNordisk,Inc.)描述了通过修饰Fc界面处和[0129]用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链_轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Natur以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨[0131]在Klein等人(2012)mAbs4:6,653_663和Spiess等人(2015)“Alternativemolecularformatsandtherapeuticapplicationsforbispecificantibodies.”Mol.Immunol.67(2015)95_106中提供了对各种双特异性和多特异性抗体形异性抗体)被重新格式化为上述任何多特异性抗体形式，以进一步确保正确的重/轻链配码HC12双特异性或多特异性抗体)进一步包括确定用于引入细胞的多核苷酸的最佳比率。在某些培养基((MEM),(Sigma)、RPMI_1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基((DMEM),用作宿主细胞的培养基。这些介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长白质浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统[0141]可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法从细胞获得根据本文所述方法制备的[0144]蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体(例如，双特异性抗体)中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上进行的SEPHAROSEM色谱、色谱聚焦、SDS_PAGE和体均包含不同的抗体重链结构域(VH)和不同的抗体轻链结构域(VL)，其中每个VH均包含不同的CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3序列，其中每个VL均包含不同的抗体重链结构域(VH)和不同的抗体轻链结构域(VL)，其中每个VH均包含不同的且其中每个VL的91位处、每个VL的94位处或每个VL的96位处的至少一个氨基酸为选自色氨体3456789101213于这些方法的更多细节在例如Abou_Nadler等人(2010)BioengineeredBugs1,337_340；Firth等人(2005)Bioinformatics21,3314_3315；Cirino等人(2003)MethodsMolBiol蛋白质_编码序列克隆至含有启动子的载体中，通过用RNA聚合酶转录克隆序列来产生经克隆的蛋白质_编码序列来产生所需的突变蛋白。许多mRNA可在小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物中有效翻译。关于体外翻译的更多细节在例如Hope等人(1985)Cell43,人(1988)Nature333,635_640；以及为本领域公知的，并且在例如MethodsofMolecularBiology,35,PeptideSynthesisOpinChemBiol14,1_15；MethodsofEnzymology,289,SolidPhasePeptideSolid_PhaseSynthesisandCombinatorialTechnologies,JohnWiley&Sons,2000；C.Tmiolo编辑)，Thieme,2Press,2005；MethodsinMolecularBiology,298,PeptideSynthesisandApplications，(J.Howl编辑)HumanaPress,2005；以及AminoAcids,PeptidesandProteinsinOrganicChemistry，第3卷，BuildingBlocks,CatalystsandCoupling经由化学合成技术产生的多特异性抗原结合蛋为本领域技术人员公知的并且在例如Molek等人(2011)Molecules16,857_887；Boder等人，(1997)NatBiotechnol15,553_557；Scott等人(1990)Science249,386_390；Brisette等人(2007)MethodsMolBiol383,203_213；Kenrick等人(2010)ProteinEng(1997)ProcNatlAcadSciUSA94,4937_4942；Lipovsek等人，(2004)JImmMethodsProcNatlAcadSciUSA101,2806_2810；以及Miller等人(2006)NatMethods3,561_[0157]在某些实施例中，本文提供的文库为例如通过Szostak等人，US6258558、US靶标的抗原结合结构域变体的结合(例如，检测(例如，靶配体或靶抗原)的亲和力的方案的影响(参见Wu等人(1998)P配体的抗原结合结构域变体的方法进一步包括：(e)诱变或随机化先前识别的抗原结合结与进一步随机化的抗原结合结构域变体的结合，和以及(h)获得特异性结合靶标的进一步ofaPotentHumanAnti_HIV_1AntibodyintothePicomolarRange,fortheGenerationofMutagenicPhageDisplayAntibodyLibrariesforAffinity[0164]在某些实施例中，该方法进一步包括(i)确定特异性结合靶标的抗原结合结构域变体的核酸序列。原结合结构域变体的亲和力一样高的亲和力文库(例如本文所述的任何文库)接触。选择技术可为例如，噬菌体展示(Smith(1985)Science228,1315_1317)、mRNA展示(Wilson等人(2001)ProcNatlAcadSciUSA98:3750_3755)细菌展示(Georgiou等人(1997)NatBiotechnol15:29_34)、酵母展示(Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15:553_5577)或核糖体展示(Hanes和Plückthun(1997)ProcNatlAcadSciUSA噬菌体颗粒的表面上的外壳蛋白融合的融合蛋白(Smith,G.P.(1985)Science,228:1315_[0169]在噬菌体上的多肽(Cwirla,S.E.等人(1990)P或蛋白质(Lowman,H.B.等人(1991)Biochemistry,30:10832；Clackson,T.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363)文库的展示已用于从数百万的多肽或寡肽筛选具有特丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来展示小随机肽和小蛋白质。(Wells和Lowman,低水平进行表达，使得噬菌体颗粒展示融合蛋白的一个拷贝或不展示融合蛋白的任何拷体，这简化了DNA操作。(Lowman和Wells,Methods:AcompaniontoMethodsin靶配体进行亲和纯化的程序以及评估结合富集的结果的手段(参见例如US5223409、US[0171]大多数噬菌体展示方法使用丝状噬菌体(例如M13噬菌体)。λ形噬菌体展示系统等人(1998)CancerResearch,58:3209_3214；Jiang等人(1997)Infection&Immunity,65:人(1995)VirusGenes,10:173)以及T7噬菌体展示系统(Smith和Scott(1993)Methodsin1998/20159)和受约束的螺旋肽本文所公开的抗原结合结构域变体的文库。金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和标签的用途也噬菌体展示文库)来区分酶特异性的底物消减文库的用途。US5498538、US5432018和WO1998/15833中描述了选择特异性结合蛋白的其他方法。US5723286、US5432018、US5723323中还公开了产生肽文库和筛选这些种、两种或更多种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP382/嗜酸性粒细胞趋化因子_2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子_3)、CCL27(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR_L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TN体)结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)_16R和TNFR1和IL_18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGMA；CTLA_4和已知的各种测定来表征其物理/化学特性和生物学功能。此类测定包括但不限于N末端测性或多特异性抗体)的抗原结合活性。本领域已知并可用于本文的抗原结合测定包括但不[0189]以下实例中的所有抗体均使用Kabat(Kabat等人，“SequencesofProteinsof基因合成(GENEWIZB)来生成，并且只要适用，将该抗体构建体亚克隆到表达质粒(pRK5)中，如先前所述(Dillon等人，“EfficientproductionofbispecificIgGof9:213_30)。本研究中的所有抗体HC均被去糖基化(N297G突变)并删除了羧基末端赖氨酸singlehostcellsbyliquidchromatography_Orbitraphigh_resolutionmassremodelingthedomaininterfaceofa[0190]对于本研究中的一些BsIgG，审慎地进行了FR突变，以在正确配对和错误配对的[0192]所有BsIgG在HEK293衍生的EXPI293FM细胞中瞬时表达，如先前所述(Dillon等人，同上)。将对应于两种LC和两种HC的四个质粒共转染至EXPI293FM细胞(Thermo物(30mL)在37℃下振荡生长7天。来自经过滤的细胞培养上清液的BsIgG通过蛋白A亲和色谱法(TOYOPEARL@AF_rProteinA,TosohBioscience)以高通量方式进行纯化。通过[0194]BsIgG样品(20μL)在等度条件下经由尺寸排阻色谱法在连接至HPLC柱(DIONEXMUltiMate3000,ThermoFisherScientific)的TSKGEL@SuperSW3000柱[0196]如先前所述，经由质谱法(ThermoFisherEXACTIVEiMPlusExtendedMassRangeoRBITRApiM)来对BsIgG产率(正确配对的LC种类相对于所有三个错误配对的IgG1种类的强度)执行定量，并且假设在不同质量峰之间没有应答偏差(参见Yin等人，下相色谱(RSLC)系统加热至80℃的反相液相色谱柱(MABPAciM,ThermoFisherScientific,2.1mm×50mm)上。使用二元梯度泵以300μL/min的速度在4.5min内递送(包含0.1％甲酸和0.02％三氟乙酸的99.88％水)和溶剂B(包含9.88％水加上0.1％甲酸和加热至30℃的AcquityupLCMBEH尺寸排阻色谱柱(Waters,4.6mm×150mm)上。等度色谱[0200]使用ProteinMetricsIntactMassM软件和ThermoFisherBIOPHARMAFINDERM3.0软件来分析所采集的质谱数据。来自每个样品的去卷积频谱的正确配对的LC种类的信号强度用于相对于三个错误配对的IgG1种类的定量。HC同源二聚体和半IgG[0204]在BIAcoreT200仪器(GEHealthcare)上使用表面等离子体共振来执行动力学结75、300nMHER2_ECD(内部)和VEGF_C(Cys156Ser)(R&DSystems，目录号752_VC)；0、productionofbispecificIgGofdifferentisotypesandspeciesoforigininmixturesofbispecificIgGproducedinsinglehostcellsbyliquidchromatography_Orbitraphigh_resolutionmass产率。三分之一的抗体对显示出高(>65％)BsIgG产率，与强固有同源HC/LC链配对偏好一致。对于此类抗体对，在两个CH1/CL结构域界面处安装先前确定的电荷突变(Dillon等人，“EfficientproductionofbispecificIgGofdifferentisotypesandspeciesof识别CDRH3和L3中有助于高BsIgG产率的特异性残基。然后将CDRH3和L3以及所识别的特(n＝99)以产生BsIgG。为简单起见，表A中，通过使用专有比对工具将LC和HC序列与人抗体种系基因谱系进行比较来识别种系onartuzumab,aMETantagonistwithanti_tumoractivityasatherapeuticWongA,LeeCV,StawickiS等人，Atwo_in_oneantibodyagainstsuperiorinhibitoryactivitycomparedwithmonospecificantibodies.Cancer[0216]5.UltschM,BeversJ,NakamuraG,VandlenC.Structuralbasisofsignalingblockadebyanti_IL_13antibody[0217]6.SpiessC,BeversJ,3rd,JackmanJ,ChiangN,NakamuraG,DillonM,LiuH,MolinaP,ElliottJM,ShatzW等人，DevelopmentofahumanIgG4bispecificantibodyfordualtargetingofinterleukin_4(IL_4)andinterleukin_13(IL_13)[0218]8.CarterP,PrestaL,GormanCM,RidgwayJB,HennerD,WongWL,RowlandAM,KottsC,CarverME,ShepardHM.Humanizationofananti_p185HER2antibodyforhumanizedbispecificF(ab')2fragmentforimprovedbindingtoTcells.IntJ[0220]10.BhaktaS,CrockerLM,ChenY,HazenM,SchuttenMM,LiD,KuijlC,OhriR,ZhongF,PoonKA等人，Ananti_GDNFfamilyreceptoralpha1(GFRA1)antibody_drugconjugateforthetreatmentofhormonereceptor_positivebreastEXPI293FM[0221]11.AdamsC,TotpalK,LawrenceD,MarstersS,PittiR,YeeS,RossS,DeforgeL,KoeppenH,SagollaM等人，StructuralandfunctionalanalysisoftheinteractionbetweentheagonisticmonoclonalantibodyApomabandtheEXPI293FM同分子质量)混合物中正确组装的BsIgG的产率。表B中显示的数据为来自优化的LCDNA比remodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplay注目的是，对于大多数(>80％)的抗体对率)；对于33个和48个抗体对，分别看到了BsIgG1的高(>65％)产率和中间(30％_65％)产[0229]图1A_1F显示了用于BsIgG1的低产率(<30例如抗LGR5/IL_4，参见图1A和1B)、中间产率(30％_65例如抗SIRPα/IL_4，参见图1C和1D)和高产率(>65例如抗MET/DR5，参见图1E和1F)的代表性实例的高分辨率LCMS数据。相应的抗体对被瞬时共转染至通过蛋白A色谱法和尺寸排阻色谱法进行纯化，如Dillon等人(下同)和Yin等人(下同)所应的去卷积数据并且提供了代表不同IgG1种类存在抗MET抗体的BsIgG1产率从低至约21％(当与抗IL_33配对时)变化至高达约95％(当与抗A色谱法从30mL培养物中回收的IgG种类变化超过约5倍(1.5mg至8.0[0233]先前，与杵臼结构HC突变联合的所有四个结构域/结构域界面处的突变的组合H/VL两者和CH1/CL两者)用于在单个哺乳动物宿主细胞中的不同同种型的BsIgG的近抗体对的BsIgG1产率增加了约12％_34在大多数(9/11)情况下增加至≥90％BsIgG1产率(图2)。对于图2中的电荷对变体，该对中的第一所列出的抗体包含CLV133E和CH1S1 变的单个HC(HC1)在Expi293FTM细胞中与其同源LC(LC1)和竞争性非同源LC(LC2)瞬时共表Atwell等人，“Stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofa亲和色谱法和由高分辨率LCMS评估的同源和非同源HC/LC配对的程度，从相应的细胞培养比通过定量半IgG1种类来进行计算。4HC未显示出对其同源LC的偏好(49％)。这些数据与以下观点一致，即抗EGFR/MET的高BsIgG1产率分别由抗MET和抗EGFR或两个臂中的同源HC/LC配对偏好对于在单个细胞中的BsIgG1的高产率显然是足够的，而[0240]当在单个宿主细胞中共表达时，也评估了HC与其同源轻链(LC)或非同源LC的配分析。(Labrijn等人“EfficientgenerationofstablebispecificIgG1byC等人“Bispecificantibodieswithnaturalarchitectureproducedbyco_cultureS368A:Y407V)(参见Spiess等人“Alternativemolecularformatsandtherapeutic域序列，是相同的(图4)。CDRL3和H3为在抗MET抗体的VH/VL结构域界面处参与最广泛的CDR，如与其抗原复合的抗METFab的X射线晶体学结构所证实(蛋白质数据库(PDB)识别码onartuzumab,aMETantagonistwithanti_tumoractivityasatherapeutic自抗CD3抗体的相应序列取代抗MET抗体的CDRL3和H3导致双特异性产率显著损失(约85%BsIgG产率小幅降低(约85％至75％图5A)。取代抗EGFR和抗MET臂的CDRL3和H3导致随机HC/LC配对。这些数据支持以下观点，即抗MET的CDRL3和H3对所观察到的抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率做出了主要贡献，而应的抗CD3抗体序列取代来自抗MET抗体的CDRL1和H1或CDRL2和H2对抗EGFR/METBsIgG[0246]接下来，研究了抗MET抗体的CDRL3和H3内的残基，该残基有助于抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率。抗METFab的X射线晶体学结构(PDB登录码4K3J)揭示了CDRL3和H3之间的接触残基(图7)并用于指导突变分析的残基的选择。抗METCDRL3和H3的丙氨酸扫描诱变(Cunningham等人“High_resolutionepitopemappingofhGH_receptor射有助于抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率的[0250]如上面的表E1所示，CDRL3中的VLY91A突变使所测试的12个单一丙氨酸突变体似乎对抗EGFR/METBsIgG1的高双特异性产率做出了至关重要的贡献。所有突变体的表达显示的数据代表使用优化的HC/LCDNA比率的两个[0251]表E1中的亲本抗METFab、和抗METFab变体的子集对MET的亲和力经由表面等离子体共振(SPR)来确定。缔合速率(kon)、解离速率(koff)和结合亲和力(KD)显示在表E2中L3中的其他单一丙氨酸取代在不同程度上降低了亲和力。对于在CDRL3中具有Y91A:Y94A[0255]鉴于发现抗MET抗体的CDRL3中的特异性残基对于抗EGFR/METBsIgG1的高双特[0256]用来自抗CD3抗体的相应序列取代抗IL_13抗体的CDRL3和H3导致抗IL_13/IL_[0257]抗IL_13CDRL3和H3的丙氨酸扫描突变分析(Cunningham等人，下同)用于映射有助于抗IL_13/IL_4BsIgG1的高双特异性使CDRL3和H3的所测试的九个单一丙氨酸突变体中的任一者的双特异性产率的降低幅度最大，并消除了高双特异性产率(72％至29％)。CDRH3中仅有的两个丙氨酸取代，即VH表E2.合)。CDRL3中的N92A和D94A取代均不影响抗IL_13Fab变体与IL_13的结合。CDRL3中的表E2.CD3(图10A)和抗VEGFA/ANG2(图10B)，在四分之三的CDRL3和H3募集情况中观察到BsIgG1图10A和10B中的数据表明从具有同源HC/LC配对偏好的抗体中募集CDRL3和H3可增强不具[0267]研究了将来自抗IL_13抗体的单个关键残基募集至其他抗体中对BsIgG1产率的影VEGFC抗体中的相应位置时，观察到双特异性产率有所增加，尽管小于亲本抗IL_13/IL_表使用优化的LCDNA比率的两个独立实验的平均值±SD。在95位处(D95)具有天冬氨酸残响[0273]归结起来，这些结果表明CDRL3的94位处和96位处(Kabat编号)和CDRH3的95位抗体导致结合亲和力的损失。值得注意的是，抗HER2的CDR_L3中的T94D取代使抗HER2/抗CD3BsAb的BsIgG1产率从24％增加至几乎50但仅使抗HER2对HER2的亲和力降低了20倍。类似地，VEGFACDR_L3中的V94D:W96R双取约22％增加至约52但仅使抗VEGFA对VEGF[0277]与表G1和G2中显示的结果相反，当将抗cMet的配对偏好的关键残基移植至抗表G4：将来自抗cMet抗体的关键残基募集至其他抗体响[0282]先前，假设HC与LC之间链间二硫键的形成充当防止链交换的动力学陷阱(Dillon等人，下同)。执行实验以研究HC与LC之间的二硫键是否影响具有明显同源链偏好的两种BsIgG1(抗EGFR/MET和抗IL_13/IL_4)的双特异性产率以及具有随机HC/LC配对的两个对照产生缺乏链间二硫键的BsIgG1变体：LCC2[0287]BrinkmannU,KontermannRE.Themakingofbispecificantibodies.mAbs[0288]CarterPJ,LazarGA.Nextgenerationantibodydrugs:pursuitofthe'[0290]OldenburgJ,MahlanguJN,KimB,SchmittC,CallaghanMU,YoungG,SantagostinoE,Kruse_JarresR,NegrierC,KesslerC等人，Emicizumabprophylaxis269_74.[0292]SureshMR,CuelloAC,MilsteinC.Bispecificmonoclonalantibodiesfrom[0293]FischerN,ElsonG,MagistrelliG,DheillyE,FouqueN,LaurendonA,GueneauF,RavnU,DepoisierJF,MoineV等人，Exploitinglightchainsforthescalablegenerationandplatformpurificationofnativehumanbispecific[0294]StropP,HoWH,BoustanyLM,AbdicheYN,LindquistKC,FariasSE,Rickertvilger[0295]VaksL,Litvak_GreenfeldD,DrorS,MatatovG,NaharyL,ShapiraS,HakimR,AlroyI,BenharI.DesignprinciplesforbispecificIgGs,opportunitiesandvilger[0296]SchaeferW,HR,LorenzS,Imhof_JungS,RegulaJT,KleinC,M.Heavyandlightchainpairingofbivalentquadromaandknobs_into_holes[0297]M,SellmannC,MareschD,HalbigC,BeckerS,ToleikisL,HockB,RukerF.NovelCH1:CLinterfacesthatenhancecorrectlightchainpairingin[0298]KitazawaT,IgawaT,SampeiZ,MutoA,KojimaT,SoedaT,YoshihashiK,Okuyama_NishidaY,SaitoH,TsunodaH等人，AbispecificantibodytofactorsIXaandXrestoresfactorVIIIhemostaticactivityinahemophiliaAmodel.Nature[0299]SampeiZ,IgawaT,SoedaT,FunakiM,YoshihashiK,KitazawaT,MutoA,KojimaT,NakamuraS,HattoriK.Non_antigen_contactingregionofanasymmetricbispecificantibodytofactorsIXa/XsignificantlyaffectsfactorVIII_[0300]SampeiZ,IgawaT,SoedaT,Okuyama_NishidaY,MoriyamaC,WakabayashiT,TanakaE,MutoA,KojimaT,KitazawaT等人，IdentificationandmultidimensionaloptimizationofanasymmetricbispecificIgGantibodymimickingthefunction[0301]CarterPJ.Introductiontocurrentandfutureproteintherapeutics:aproteinengineeringperspective.ExpCellRes2011.[0302]WuH,PfarrDS,JohnsonS,BrewahYA,WJF,KienerPA.Developmentofmotavizumab,anultra_potentantibodyforthepreventionofrespiratorysyncytialvirusinfectionintheupperandlower[0303]CookeHA,ArndtJ,QuanC,ShapiroRI,WenD,FoleyS,VecchiMM,PreyerM.EFabdomainsubstitutionasasolutiontothelight_chainpairingproblem[0304]TillerKE,LiL,KumarS,JulianMC,GardeS,TessierPM.Argininemutationsinantibodycomplementarity_determiningregionsdisplaycontext_[0305]DashivetsT,StrackeJ,DenglS,KnauppA,PollmannJ,BuchnerJ,Sc