通过添加WPRE和ITRs增加重组杆状病毒载体的表达效果

摘要来源于土拨鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus,WHV),是一段位于病毒基因组3'非翻译区(3'UTR)的顺式作用元件，长度约为600-700bp,它有特别的二级结构，有基排列顺序的DNA序列，一般长度在几十到几百碱基对不等，不同转座子的ITRs序构建成重组转移载体“pLM-ITRs”,用酶切法分别去切割载体pLM和片段“ITR-L”、“ITR-R”,最后转移到重组杆状病毒表达载体去表达。已经有研究证明，把这两个元件加入到重组杆状病毒表达载体里可以提高重组杆状病毒的转化效率。关键词Baculovirusisatypeofarthropodvirusnamedafter'untranslatedregion(3'UTR)ofthevirusgenome.Itisapproximately60andhasauniquesecotransposonsandarespecialDNAsequencesatbothendsofthetrahundredsofbasepairsinlength.TheITRssequencesofdifferenttransbuttheyusuallyhavethecharacteristicofreverseprimersweredesignedforPCRamplificationofthetargetfragments"WPRE","ITRs",a"pA",andarecombinanttransfervector"pbaculovirus;WPRE;ITRs;conversionef摘要 I 11.1杆状病毒表达载体系统 11.1.1杆状病毒表达载体系统生物学特性 11.1.2杆状病毒表达载体系统工作原理 21.1.3杆状病毒表达载体系统的应用领域 21.2WPRE增强基因表达的机制 3 31.2.2WPRE增强基因表达的分子机制 31.3ITRs增强基因表达的机制 4 41.3.2ITRs增强基因表达的分子机制 41.4添加WPRE和ITRs增强重组杆状病毒载体表达效果的研究现状 1.4.1单独添加WPRE对重组杆状病毒载体表达的影响 51.4.2单独添加ITRs对重组杆状病毒载体表达的影响 51.4.3同时添加WPRE和ITRs对重组杆状病毒载体表达的协同作用 51.5研究背景、目的和意义 6 61.5.2研究目的 61.5.3研究意义 72.材料与方法 82.1实验材料 82.1.1供试菌种 82.1.2扩增引物 82.1.4主要分子生物学及生化试剂 92.1.5主要缓冲液、试剂及培养基的配制 2.2.1构建含有片段WPRE的重组载体 2.2.2重组转移载体pLM-ITRs的构建 13 3.1重组中间质粒pFB/LM-PH的构建 3.1.1片段WPRE和pA的PCR扩增 3.1.2片段WPRE与pA的融合 3.1.3重组子pT-soe2的鉴定 3.1.4片段ITR-L和ITR-R的PCR扩增 3.1.5带有粘性末端的载体pLM和片段ITR-L的制备 3.1.6菌液PCR法筛选含有pLM-ITR-L的阳性菌液 3.1.7重组中间质粒pLM-ITR-L的鉴定 3.1.8带有粘性末端的载体pLM-ITR-L和片段ITR-R的制备 3.1.9菌液PCR法筛选含有pLM-ITRs的阳性菌液 3.1.10重组转移载体pLM-ITRs的鉴定 参考文献 2致谢 错误!未定义书签。11.前言杆状病毒(Baculovirus)专门感染大型双链环状结构。因为病毒外形像小杆子，所以叫杆状病毒，它的基因大小一般在80到180kb。这种病毒结构很特别，最里面是核衣壳，外面还裹着一层囊膜。核衣壳杆状病毒表面，形成刺猬状“伪病毒”[1,这样的伪病毒与野生杆状病毒比起来，对哺够感染包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目的600多种昆虫。其主要种类有苜蓿银纹2为外源基因插入留出空间，并添加合适调控元件，如多角体蛋胞里。在细胞内部，这两种DNA会像拼图一样，通过同源重组的方式结合，把外来基核里。在polh启动子的“启动”下，外来基因变成mRNA,1.1.3杆状病毒表达载体系统的应用领域通过体外培养获得重组蛋白在药物研发和疫苗制备中具有较高的安一昆虫细胞表达系统作为一种VLPs的生产平台，已广泛用于VLPs的生产，并已开发3毒基因组3'非翻译区(3'UTR)的顺式作用元件，长度约为600-700bp。WPRE作为可分为这几个区域，包括与RNA结合蛋白相互作用的区域，能招募相关蛋白来调控mRNA的转运、稳定性和翻译；还有一些区域可影响mRNA的折叠和空间构象，进而间接影响其在细胞内的命运。WPRE在研究WHV病毒复制和基因表达调控过程中被有WPRE的mRNA更快、更顺利地从细胞核运到细胞质里。可以通过多种方式提高mRNA的稳定性。一方面，WPRE形成的茎环结构可以阻碍核酸外切酶对mRNA的降解，保护mRNA的3'末端。另一方面，WPRE可能招募一些与mRNA稳定性相关的蛋白因子，如HuR(人抗原R)等，这些蛋白因子与41.3.1ITRs的来源和结构其ITRs是位于转座子两端的反向末端重复序列，转座酶能识别ITRs,将转座区域从载基因组中。以AAV的ITRs为例，它的发夹结构可以与宿主细胞的DNA修复机制的一些固定的序列片段能够与宿主细胞内的转录因子一起形成转录起始复合物，帮助中基因组的突变和缺失。同时，ITRs能够与5已有多项研究报道了在重组杆状病毒载体中单独添加WPRE对基因表达的增强分别构建含有和不含有WPRE的载体，转染昆虫细胞后发现，含有WPRE的载体组GFP蛋白的表达量显著高于对照组，通过Westernblot检测和荧光定量分析，发现表达量可提高2-3倍。进一步研究表明，WPRE的存在使GFPmRNA在细胞质中的含量增加，半衰期延长，证明了WPRE通过促进mRNA核输出和提高稳定性来增强基因表达。有研究在慢病毒载体骨架上加入了WPRE,它增强mRNA转录的稳定性，提高第三代载体的表达[26]-[281。在生产药用蛋白方面，如重组人胰岛素样生长因子-1 (rhIGF-1),利用添加WPRE的重组杆状病毒载体在昆虫细胞中表达，rhIGF-1的产单独添加ITRs也被证明能够改善重组杆状病毒载体的性能。研究发现，将AAV表达持续时间更长，且表达水平在后期明显高于对照组。这是由于ITRs促进了Luciferase基因整合到昆虫细近年来，一些研究尝试同时在重组杆状病毒载体中添加WPRE和ITRs,探索二6于单独添加WPRE组提高了约1.5倍，相较于单独添加ITRs组提高了约2倍。通过分析发现，WPRE和ITRs分别从转录后水平和转录水平以及基因整合等方面协同作用，促进了rhIFN-y基因的高效表达。这种协同作用为进一步优化重组杆状病毒载1.5研究背景、目的和意义现有杆状病毒表达系统的局限性：尽管杆状病毒表达系统优势显著,但重组蛋白表本与时间。其原因包括转录后调控机制不完善，mRNA稳定性、转运及翻译效率等影WPRE的研究现状：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件可增强mRNA稳定性与转运促进mRNA从细胞核转运至细胞质，增加mRNA翻译模板量。但在杆状病毒表达系统ITRs的研究现状：反向末端重复序列存在于多种病毒基因组末于起步阶段，能否像在AAV中发挥作用，需进一步研究验证。1.5.2研究目的7和ITRs单独用、一起用，分别会对重组杆状病毒载体产生什么影响，以及它们能不能和ITRs最佳应用方式，优化重组杆状病毒表达系统，提高重组蛋白表达水平与生产效82.材料与方法1.E.coliDH5α:用途是质粒转化宿主菌株，菌株来源用DNAstar软件设计了用来扩增目标基因片段的引物。设计时，特意把引物和模板配对部分的解链温度(Tm值)控制在58℃-62℃之间。这些引物由金思特科技有限引物方向fCGGAATTCACGCATGCTTGTCGACGTTrTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTG5'端添加pA的3'序列(无义链)frfATGTCTGGATCTCCGGACACrATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAG9型号制造商美国Ultralum公司高速离心机贝尔曼库尔特公司密理博中国有限公司蒸汽压力灭菌锅日本三洋电子有限公司生物安全柜上海力新实业有限公司哈东联电子技术开发公司电子天平梅特勒一托利多公司梅特勒一托利多公司常州国华电器有限公司常州国华电器有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司2.1.4主要分子生物学及生化试剂2.1.4.3生化试剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)氯仿宝生物工程有限公司Sigma公司酵母提取物OXOID公司2.1.5主要缓冲液、试剂及培养基的配制2.1.5.1常用试剂或贮存液的配制1酚/异戊醇(25/1,V/V)按体积比配制按体积比配制3溶解，冰醋酸调pH至5.2,补足水至121℃高压灭菌15min75mL乙醇，补足水至100mLCaCl2,250mMKCl。除了MnCl2,将所有的成分混合，用KOH调pH至6.7,然后再将MnCl2溶解，0.45μm细菌滤器过滤除菌于4℃保存末存取5mL灭菌ddH2O充分溶解1gIPTG除菌，分装于EP管，1820×SSCNaCl175.30g,柠檬酸钠88.20ddH2O800mL,NaOH调pH至7.0,补水至1000mL121℃高压灭菌15min(1)溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0),121℃(2)溶液Ⅱ:0.2mol/L氢氧化钠，1%SDS,使用前再配制；(3)溶液Ⅲ:5mol/L醋酸钾60mL,冰醋酸11.5mL,ddH₂O28.5mL,混匀后4℃2.1.5.3琼脂糖凝胶电泳试剂EDTA(pH8.0),利用磁力搅拌器剧烈搅拌，加水至至1L,121℃高压灭菌15min;(2)10mg/mL溴化乙锭EB:100mgEB加入到10mLddH₂O中，充分搅拌到左右时加入5μLEB贮液(10mg/mL),混匀。2.1.5.4抗生素类氨苄青霉素(Amp):配置浓度为100mg/ml,要称量1g氨苄青霉素，加到10ml灭菌过的ddH₂O中溶解，再用0.22微米的细菌滤器过滤分装到EP管中，零下二十度保存。胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,溶在800mLddH20中，用10mol/mLNaOH调pH至7.0,补足水至1000mL大肠杆菌的摇菌1000mLLB液体培养基中加入琼脂粉12~15g胰蛋白胨20g,酵母提取物5g,NaCl0.5g,溶在95中，加入250mmol/LKCI溶液10mL,用5mol/mLNaOH调大肠杆菌的平板涂布培养感受态细胞制备过程中的摇菌培节pH至7.0,补足水至1000mLSOB培养基经高压灭菌后，加入20mL过滤除菌的1mol/L养质粒转化过程中葡萄糖溶液，按每100mLSOB加入1mL2mol/LMg2+的比感受态细胞的复2.2实验方法加入体积终浓度dNTPMixture(各2.5mM)各0.2mmol/μLTemplate(重组Bacmid)PrimerSTARTMDNAPolymerase步骤时间温度1延伸终延伸1应用上海华舜生物工程有限公司的柱式小量胶回收试剂盒(GelExtractionMini(1)把剩下的45微升PCR反应产物和5微升10倍浓缩的上样缓冲液充分混合，然后把混合液加到1%的大孔琼脂糖凝胶上，准备做电泳。(2)在紫外灯下面，把含有目标DNA的琼脂糖凝胶块切下来，尽量把它弄碎，然后放到1.5毫升的离心管里。把离心管放在50摄氏度的水浴里加热10分钟，每2分钟把离心糖块完全融化。(4)把融化后的琼脂糖溶液转移到吸附柱里，放到离心机里，用9000转每分离心30秒，把上面液体倒掉，再把吸附柱放回收集管。(5)500微升W1液加在吸附柱里，让它静置1分钟，接着把吸附柱放在离心机里，用9000转每分离心30秒，把上面液体倒掉，再把吸附柱放回收集管。(6)500微升W1液再加在吸附柱里，还是静置1分钟，再用9000转每分离心30秒，上面液体倒掉，把吸附柱放回收集管。(7)9000转每分离心1分钟。以LM-8和LM-9为两端的终引物，应用SOE-PCR将WPRE与pA两个片段连接在一加入体积终浓度dNTPMixture(各2.5mM)各0.2mmol/μLPrimerSTARTMDNAPoly(2)PCR反应程序设置同2.2.1.1的(2)。2.2.1.6片段soe2的测序条件是一样的。最后把PCR扩增得到的产物，放到1%的琼脂糖凝胶里，用电泳的方法检测。(1)制备带粘性末端的载体和片段：要准备带有粘性末端的载体pLM(Xba1)和片段ITR-L(XbaI)。具体做法是，分别用XbaI这种酶去切割载体pLM和片段ITR-L。切割完得到的产物pLM(XbaI)和ITR-L(XbaI),放到1%的琼脂糖凝胶里进行电泳，看看切得对不对。鉴定完后，把我们想要的(2)去磷酸化处理：在离心管中加入反应组分，如表2-15,37℃反应30分钟，混匀；加入125μL冰乙醇，零下20℃下保存1小时；离心收集沉淀，用200μL的70%去磷酸化反应体系组分体积单酶切产物(5)找阳性菌：挑白色单菌落，加氨苄青霉素的LB培养液里，37℃摇一整晚。(6)提重组质粒：用试剂盒从阳性菌液里提出重组质粒。(7)验质粒：用PstI和EcoRI两种酶切开质粒，检查是不是要的重组质粒。(1)切载体和片段：用RsrⅡ酶分别切开pLM载体和ITR-R片段，切完跑1%琼脂糖(2)去磷酸化：按之前的操作步骤处理。(4)转化：按之前的方法把连好的产物导入细胞。(5)筛阳性菌：拿菌液当原料，用LM-8和LM-14引物做PCR,按之前的方法找出(6)提质粒：用碱裂解法从阳性菌液里提取重组质粒，步骤和之前一样。(7)验质粒：用双酶切的老办法，检查重组质粒是不是对的。3.结果与分析3.1重组中间质粒pFB/LM-PH的构建片段WPRE和pA进行PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物分别在650bp、250bp左右有明显条带，与预期大小相符，结果如图3-1。MDNAMarkerDL2000;1片段WPRE的PCR产物；2片段PA的PCR产物.soe2在850bp左右有明显条带，与预期大小相符，结果如图3-2。p3.1.3重组子pT-soe2的鉴定将胶回收产物做加“A”处理，与pMD18-T载体连接，再转入E.coliDH5α感受态细胞，提取出12个质粒。经1%琼脂糖凝胶电泳后，挑出6个电泳慢的质粒，用RsrⅡ和EcoRI两种酶切割。酶切后，泳道1、2、4、5、6出现两条条带，大小分别对载体(2692bp)和soe2(850bp)。测序确认泳道5的质粒是“pT-soe2”,存放在零下片段ITR-L和ITR-R进行PC在222bp、214bp左右有明显条带，与各个片段预期大小相符，结果如图3-4。用XbaI这种酶分别切割载体pLM和片段ITR-L。切割后，载体pLM放到1%琼脂糖凝胶里电泳，只出现一条条带，大小和线性化的pLM(6.6kb)一致；ITR-L电泳后出现一条约220bp的条带，和预想的大小一样，结果如图3-5所示。最后把6.6kb和3.1.6菌液PCR法筛选含有pLM-ITR-L的阳性菌液ITR-L插入方向正确，PCR产物会出现一条大概750bp大小的条带。把PCR产物放到1%83.1.7重组中间质粒pLM-ITR-L的鉴定是反方向插入。酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，果然出现两条条带，3.1.8带有粘性末端的载体pLM-ITR-L和片段ITR-R的制备电泳后出现一条约214bp的条带，和预想的大小相符，结果见图3-8。最后把6.8kb和3.1.9菌液PCR法筛选含有pLM-ITRs的阳性菌液拿6管转化后的菌液做PCR,要是菌液里有重组质粒pLM-ITR,而且ITR-R插对了方向，PCR产物会有条1000bp左右的条带。跑1%琼脂糖凝胶电泳后，每管都出现了这条现三条条带，大小和ITR-L正向插入时一样，说明确MDNAMarkerDL2000p结论先扩增了WPRE元件和ITRs元件及pA片段，然后构建了重组中间质粒和重组转骤电泳之后跑出来的结果和预想的一样，所以有望增加重组杆状病毒表达载体表达效参考文献[1]沈佳，吕正兵，陈健等.杆状病毒表面展示系统研究进展[J].微生物学通报，2008,35(3):[4]张逸驰，李媛媛.昆虫细胞G杆状病毒表达系统的研究进展[J].中国生物制品学杂[6]梁振普，陈阳光，杜俊阳，等.昆虫杆状病毒及其应用研究进展[J].河南农业大学学报，2023,57(6):916-923.andmammaliancells.NatureBiotDrugTargets,2007,8:1126-1131.[11]ChenHC,SungLY,LoWH,etal[13]SungLY,LoWH,ChiuHY,etal.Modulationofchondrgrowth