基于NGS的肿瘤全景变异检测探针设计专家共识总结2026

sequencing,NGS)技术凭借其高通量特性和发现未知基因变异能力的独特优势，已成为临床实践中肿瘤基因检测的变异(comprehensivegenomicprofiling,CGP)检测是一种基于NGS技术的基因检测方法，可同时评估数百个以(insertion-deletion,InDel)、拷贝数变异(copynumbervariations,CNV)和结构变异(structurevar(microsatelliteinstability,MSI)和同源重组缺陷(homologousrecombinationdeficiency,HRD)等复杂的基因组标志物，从而在单性和准确度。目前市场上涵盖全面基因组标志物的肿瘤CGP检测Oncology,CSCO)、北京市临床检验中心、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会等权威机构，联合临床专家、临床病理序技术临床规范化应用北京专家共识(第一版肿瘤部分)》、《实验室自建肿瘤全景变异检测性能确认中国专家共识(2024版)》、《肿瘤二代检测产品的临床预期用途、基因的临床价值以及证据等级是选择目标基因的主要依据。检测产品的预期用途及基因监测等方面的指导价值。目前，有多个针对的循证医学分级系统，包括2017年美国分子病理学协会(AssociationforMolecularPathology,AMP)/美国临床肿瘤学会(AmericanSocietyofClinicalOncology,ASCO)/美国病理学家协会(CoAmericanPathologists,CAP)联合制定的体细胞变异解读指南，2020ESMO)发布的ESMO分子靶点临床可操作性量表(ESMOScaClinicalActionabilityofm凯特琳癌症中心的精准医疗肿瘤数据库(PrecisionKnowledgeBase,OncoKB)证据等级规则理局(FoodandDrugAdminist无害变异四个大类(表2)。此外，2022年临床基因组资源中心、癌症基因组联盟和癌症变异解读联盟联合发布了体细胞变异致癌性分类标准，1(明确临床价值)I级(标准治疗)1(FDA获批)I类(CDx)Ⅱ级(前瞻性研究优选方案)2(指南推荐)Ⅱ类(指南级变异)RI(标准治疗耐药)Ⅱ(潜在临床意义)Ⅲ级(药物在其他癌症类型中有效)3A(有临床研究结果)IV级(临床前研究预测)V级(药物有效，但不延长PS和OS)3B(获批其他癌种)4(临床前研究)Ⅲ类(潜在临床价值)R2(非标准治疗耐药)Ⅲ(临床意义未明)V(无害或可能无害)X级(无证据证明是靶点)注：AMP为美国分子病理学协会；ASCO为美国临床肿瘤学会；CAP为美国病理学家协会；ESMO为欧洲肿瘤内科学会；ESCAT为ESM0分子靶点临床可操作性量表；OncoKB为精准医疗肿瘤数据库；FDA为美国食品药品监督管理局；CDs为伴随诊断，是一种与特定药物相关联的体外诊断技术(使用的相应药物被称为伴随药物),通过测量特定标志物以识别最佳用药人群的检测手段；PFS为无进展生存时间，是患者从治疗开始到肿瘤进展(根据影像学或临床标准判定)或发生任何原因导致的死亡(以先发生的事件为准)的时间，若未发生事件，则以末次评估时间为终点；0S为总生存时间，是患者从接受治疗(或进入研究)到因任何原因死亡的时间长度，若患者存活，则以最后1次随访时间为终点；-为无数据床意义解读证据等级体系，2017年AMP/ASCO/CAP联合制定的体细胞变异解读指南等级体系是目前国内影响范围最广的基因变异分级体系，本共识考虑了检测产品在我国推广应用的可行性，在2017年变异等级将基因分成3类：包括具有明确临床意义的I类基因(即包含I类变异的基因)、具有潜在临床意义的Ⅱ类基因(即包含Ⅱ类变异且不包含I类变异的基因)、临床意义未明的Ⅲ类基因(即不包含I、Ⅱ类变异(有潜在的临床意义)C级证据FDANMPA在其他癌种批多项已发表小型研究，获D级证据A级证据B级证据(临床意义不明)(无害或可能无害)注：AMP为美国分子病理学意见协会；ASCO为美国临床肿瘤学会；CAP为美国病理学家协会；FDA为美国食品药品监督管理局；NMPA为国家药品监督管理局图1基于AMP/ASCO/CAP指南形成的本地化的体细胞突变分类等级共识意见1polymorphism,SNP)位点的策略性提升CNV检测的性能。在融合基因检测中，探针设计的核心靶区应聚焦于断点区域多位于复杂的非编码区[通常伴随高重复序列和异常的鸟嘌呤 建议采取适应性设计策略：优先锁定高频融合伴侣基因的保守断点区域，通过规避高重复性/高同源性的基因组区间，有效平衡覆盖广度和检测性在基因组标志物检测的探针设计策略中，目标区域需依据不同标志物覆盖区域的精细化调控，既可优化检测系统合的规模，实现成本效益的最大化。检测TMB指标时，要求探针覆盖的编码区在1Mb以上，通常在具有临床价值的基因的基础上增加相应范，建议采取动态优化策略，基于算法特性筛选最佳的微卫星位点组合。微卫星位点可能导致信号噪声比下降，检测数能评估中表现出更优的灵敏度。《Bethesda传统的美国国家癌症研究所双核苷酸位点检测系统常配对样本，加之稳定性高、灵敏度高的特点，常被NGS检测产品选为计算MSI的核心检测靶区。HRD检测时，可参考《同源重组修复缺陷临床检测与应用专家共识(2021版)》的技术框架进行探针设计，SNP位0.4～0.6之间的SNP位点。同时建立三级排除机制，即排除显著偏离哈探针池的目标区域设计需系统性整合“检测模块”。质量控制区域的战略布局虽不直接参与系统可靠性的基石。探针设计中需包含4个关键质量控制维度的专属功能技术实现层面，前3项质量控制指标的计算可通过SNP基因分型实现，SNP位点及数目的确定需要满足生物信息学算法对杂合率和群体频率阈值的要求。性别鉴定模块应采用染色体特异性覆盖策略，通过在X/Y染色体异源区域设计性别特异性探针，建立高效的双盲检测体系(准确度应达99%以上)。当临床样本出现性别信息异常时，该模块可实现污染样本架构。“功能检测层”包括基因变异(包括SNV、InDel、CNV及SV)检测和/或基因组指标(如TMB、MSI、HRD等)检测的关键靶区，“质量保障层”是集成上述四位一体的质控模块。要根据CGP检测产品的预期用途进行个性化设计。该设计范式通过检测共识意见2形成了《常见实体瘤基因检测推荐列表》,见附表1、2(扫描本文首页二维码查看)。对于I类和Ⅱ类基因的推荐，不仅详细列出了基因在不同突变基因(附表2)。基于肿瘤临床及变异公共数据库(COSMIC、TCGA等)融合中国人群自建数据库(采用全基因组测序/全外显子测序技术进行肿瘤组织与正常对照样本配对分析的数据)的基因变异人群发生频率进计算公式为RI=(Np/N)×(1000/L),以此实现不同长度外显子间且覆盖至少≥5例突变患者的高复发区域，可以确保基因不仅具备较高人群突变频率，同时对TMB具有显著贡献。该筛选策略可以保障优先选择对肿瘤突变贡献度高的基因，有效控制探针池大小，在MRD监测场景中显著提升个体患者可追踪突变的数量，增强检测的临床灵敏度和可靠性。对肿瘤精准诊疗的前瞻性的认知，同时充分考虑该实体瘤基因检测推荐列表可以成为指导肿瘤CGP检测产品探针池合的过程。如何进行基因组合是本次专家共识讨论的焦点，针对该问题，专家建议可根据不同场景进行基因组合设计：(1)按照临床预期用途进测等单一场景，或者辅助诊断+药物疗效预测因检测产品的设计。(2)按照肿瘤来源的不同系统进行基因组合设计，检测产品。(3)通过某个/某些基因组指标关联不同的治疗方式或者不同用人群。通常情况下，基于后2种场景设计的多癌或泛癌CGP检测产品共识意见3本次共识形成了常见实体瘤患者基因检测推荐列表(扫描本文首页二维码查看),在CGP检测产品设计时推荐根据临床预期用途、肿瘤床应用的双重经济学效益(推荐级别：1类)。(一)探针的设计和筛选的参考基因组DNA序列外，还应该考虑因人群遗传多样性、特定的基因本原则是在确保每条探针都能对目标区域实探针的GC含量、熔解温度Tm、交叉杂交及探针长度是影响探针池含量在50%~60%时，探针池的捕获效率和均一性最优。探针设计时可以根据探针池的GC含量来调整不同探针的浓度或覆盖密度，从而提升目标区间的捕获能度及杂交反应条件等因素有关，可结合湿实验反的Tm值在一个合适的范围内，以保证探针捕获性能。交叉杂交是影响探针的存在可能会引发非特异性捕获反应，从而对基因组中与探针序列具有高度相似性(如50mer探针建议相似性阈值设定为>75%～80%)的目标区间进行全面评估，并剔除相似区域过多的探针，以有效降低探针组合整体的交叉杂交比例特异性的重要因素，在确定探针长度时，需综平均长度、测序读取模式等因素。通常而言，探降解影响更大。在实际应用中，常规探针长度在60～120nt之间，旨在确保杂交稳定性的前提下，兼顾合成的可行性血浆中的游离DNA,DNA模板片段与固定序列探针的杂交结合效杂的InDel变异，可通过野生型+突变型的探针设计策略，即在变异位点的两侧分别设计1条野生型探针，在变异位点内部设计1条突变型探针，探针设计时除了参考基因组外，还需要充分考虑人群遗传多样性、特定的基因突变等原因造成的目标区域序列多样性(推荐级别：2B类)。探针设计和筛选过程，需要充分考虑探针的GC含量、熔解温度Tm、探针位置、探针长度等因素，在保证探针灵敏度和特异度的前提下，筛选出能富集目标区域的最优探针组合(推荐级别：2A类)。探针池干粉、浓储液、配置后的工作液，可储存至-80℃±5℃条件下；用细胞系标准品或高质量的临床样本(如白细胞gDNA样本)进行NGS比对率等(表3),其中捕获效率和均一性是影响探针池检测性能的关键比对到目标区域的碱基数占总测序碱基数的百分比>10Mb时，不低于45%;≤10Mb时，不低于120%18)比对到参考基因组上的reads数占所有测序reads数的比例注：CGP为全景变异；GC为碱基鸟嘌呤和胞嘧啶；read实际合格线与探针池的目标区域、实验体系、检测样本类型以及检测产品的性能要求相关，CGP检测产品定型时需使用临床样本进行质控标准的确认域和探针设计方式有关，如果目标区间包含较多的高GC、重复序列或者计方法可以减少非特异序列的结合，提高探针基因区域捕获质量评价通则》中要求，对于目标基因区域>10Mb的探针池捕获特异性应不低于45%,≤10Mb的目标基因区域探针池捕获特异性应不低于12%。探针池的覆盖均一性是指测序过程中目标区域之间序列覆盖的均匀性，是测序读段(reads)在目标区域的测序深度均匀程度的度量。覆盖均一而降低检测产品成本，减少分析时间，缩短盖均一性的指标包括Fold-80碱基罚分(Fold-80basepenalty,简称Fold-80)和0.2倍平均深度碱基覆盖度。Fold-80是指确保80%的目标Fold-80的理想值为1,即80%的目标碱基已经达到了平均覆盖深度，无需额外测序。然而，在实际应用中，Fold-80值通常会>1,一般情况下认为Fold-80值<2的探针池的覆盖均一性较好。0.2倍平均深度碱基覆盖度是指≥20%目标区域的平均有效深度的占比，数值越高表示探针池的均一性越好。2025年国家药品监督管理局发布行业标准《肿瘤组织基因突变检测试剂盒(高通量测序法)》YY/T1946-2024建议≥20%目标区域的平均有效深度占比不低于95%。GC含量是指在测序序列中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)碱基例，探针池的目标区间、合成质量，以及实验会影响GC含量的结果。如果GC含量异常，可能会影响探针池的捕获效率和测序数据的均一性。GC含量的最佳比例尚无明确规定，2023年国中关于标准物质的选择原则指出GC占比应该在40%～60%之间，这为积产生的靶标区域GC含量影响覆盖深度的现象。通常表现为低GC或高高于均值而高GC低于均值，或低GC低于均值而高GC高于均值，或低分别计算平均覆盖深度，如果25%～75%GC区间均有超过0.5倍平均覆盖深度即可评价为没有严重的GC偏好。基因组比对率是指比对到参考基因组上的reads数占所有测序reads数的比例，一般要求达到95%以上，这一标准可以确保检测具有较高的数确认，通常要求不低于表3中提供的参考质控标准。具体的计算方法为：在保证突变检出概率≥95%前提下，利用二项分布函深度为500×,突变的阳性判断值为4条reads,LoD为2%,根据二项分布计算出的突变检出概率达到95%以上时的理论位点测序深度需达到386×,检测产品的样本平均深度标准为500×,则位点的理论深度系数应达到0.77(386×/500×)以上。可参考《实验室自建肿瘤全景变异检测性能确认中国专家共识(2024版)》CGP检测产品的基因变异的LoD是指95%的样本能够正确检出变异位点的最低等位基因百分比，基因组指标的LoD指95%的样本能够正确检出阳性所需的最低的肿瘤纯度。探针池LoD的评估需要对所有的变异agreement,PPA)和阳性预测值(positivepredictiveva的变异的PPA、NPA和PPV达到95%以上。样本数量的选择，针对每种变异类型及每个基因组指标，应在95%置信度(a=0.05)和95%可靠标准”方法，并使用获得NMPA批准的IVD试剂盒，如EGFR突变、MET扩增、MSI指标等。对于尚未有获批检测方法的基因组指标，可以采用经过性能确认的LDT方法，如MTAP基因纯合缺失、HRD指标等。效率、均一性、GC含量等)、单条探针/