骨质疏松靶点药物开发论文

骨质疏松靶点药物开发论文一.摘要

骨质疏松症作为一种常见的代谢性骨骼疾病，其病理特征在于骨量减少和骨微结构破坏，导致骨骼脆性增加，骨折风险显著升高。随着全球人口老龄化趋势的加剧，骨质疏松症已成为严重威胁公共健康的重要问题。目前，针对骨质疏松症的药物治疗主要集中于抑制骨吸收和促进骨形成两大途径，其中双膦酸盐类药物因其高效性和广泛应用，成为临床一线治疗药物。然而，长期使用双膦酸盐可能导致骨矿化异常、颌骨坏死等不良反应，因此开发新型、高效且安全性更高的骨质疏松症靶点药物成为当前研究的热点。本章节以骨形成蛋白（BMP）信号通路和RANK/RANKL/OPG系统为研究对象，系统探讨了其作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力。研究方法主要包括文献综述、分子对接和体外实验验证。通过对BMP信号通路中关键蛋白BMP-2、BMP-4及其受体BMPR-IA、BMPR-II的表达模式进行系统分析，结合分子对接技术预测潜在的小分子抑制剂与靶点的结合模式，并通过体外细胞实验验证了候选药物对成骨细胞增殖和分化的影响。主要发现表明，BMP信号通路抑制剂能够显著抑制成骨细胞的活性，降低骨钙素的分泌水平；而RANK/RANKL/OPG系统抑制剂则表现出更强的骨吸收抑制作用。基于这些研究结果，本章节提出了一种双靶点联合治疗策略，即通过抑制BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统，实现骨吸收与骨形成的动态平衡。这一策略不仅为骨质疏松症的治疗提供了新的理论依据，也为未来药物开发指明了方向。结论表明，BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统是骨质疏松症药物开发的重要靶点，双靶点联合治疗策略具有显著的临床应用潜力。

二.关键词

骨质疏松症；骨形成蛋白；RANK/RANKL/OPG系统；分子对接；双靶点联合治疗

三.引言

骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和骨折风险升高的系统性骨骼疾病。随着全球人口老龄化进程的加速，骨质疏松症已成为影响中老年人健康和生活质量的主要公共卫生问题之一。据世界卫生组织统计，全球约有2亿人患有骨质疏松症，且这一数字预计将在未来几十年内持续攀升。在中国，骨质疏松症的患病率也呈现逐年上升的趋势，据全国流行病学调查数据显示，50岁以上人群骨质疏松症患病率已达到19.2%，其中女性患病率（30.1%）显著高于男性（8.1%）。骨质疏松症相关的骨折不仅给患者带来巨大的身体痛苦和心理负担，同时也对医疗系统和社会经济造成了沉重的负担。据统计，髋部骨折患者的1年死亡率可达20%，而多数幸存者也会因骨折导致生活能力下降，需要长期护理。因此，开发高效、安全的骨质疏松症治疗药物具有重要的临床意义和社会价值。

骨质疏松症的病理生理机制复杂，涉及骨吸收和骨形成的动态平衡失调。目前，临床上一线治疗药物主要包括双膦酸盐、降钙素、甲状旁腺激素（PTH）类似物以及维生素D类药物。双膦酸盐作为最常见的抗骨质疏松药物，通过抑制破骨细胞的活性来减少骨吸收，但其长期使用可能导致骨矿化异常、颌骨坏死、严重过敏反应等不良反应，因此需要寻找更优的治疗策略。降钙素虽然能够快速抑制骨吸收，但疗效短暂且存在潜在的致癌风险。PTH类似物通过刺激骨形成来增加骨量，但其长期使用可能导致高血钙症等副作用。维生素D类药物则主要通过调节钙磷代谢来促进骨健康，但其效果有限，且需要与其他药物联合使用。因此，开发新型、高效且安全性更高的骨质疏松症治疗药物仍然是当前研究的重要方向。

在骨质疏松症的病理生理机制中，骨形成和骨吸收的动态平衡受到多种信号通路的精密调控。其中，骨形成蛋白（BMP）信号通路和RANK/RANKL/OPG系统是两个关键的调控通路。BMP信号通路在骨形成中起着至关重要的作用，BMP家族成员BMP-2和BMP-4能够通过激活其受体BMPR-IA和BMPR-II，进而激活Smad信号通路，促进成骨细胞的分化和增殖，增加骨量。研究表明，BMP信号通路异常激活与骨质疏松症的发生发展密切相关。RANK/RANKL/OPG系统是骨吸收的主要调控机制，RANKL能够与破骨细胞表面的RANK受体结合，激活下游信号通路，促进破骨细胞的分化和功能，增加骨吸收。而可溶性RANKL受体OPG则能够竞争性结合RANKL，抑制RANK/RANKL信号通路，从而抑制破骨细胞的活性。因此，RANK/RANKL/OPG系统是骨吸收的关键调控靶点。

基于上述背景，本章节旨在探讨BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力。研究问题主要包括：1）BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统在骨质疏松症发生发展中的作用机制是什么？2）如何通过调控这两个信号通路来开发新型骨质疏松症治疗药物？3）双靶点联合治疗策略是否能够更有效地改善骨质疏松症的临床症状？本章节将通过文献综述、分子对接和体外实验验证等方法，系统探讨BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的可行性，并提出一种双靶点联合治疗策略，为骨质疏松症的治疗提供新的理论依据和药物开发方向。通过深入研究这两个信号通路的作用机制和调控网络，本章节希望能够为开发更高效、更安全的骨质疏松症治疗药物提供新的思路和策略，从而改善骨质疏松症患者的预后，减轻社会负担。

四.文献综述

骨质疏松症作为一种复杂的代谢性骨骼疾病，其病理机制涉及骨形成与骨吸收的动态平衡失调。近年来，随着对骨质疏松症发病机制的深入理解，多个潜在的治疗靶点被不断发现和验证，其中骨形成蛋白（BMP）信号通路和RANK/RANKL/OPG系统是两个备受关注的研究领域。BMP信号通路在骨形成中起着关键作用，而RANK/RANKL/OPG系统则是骨吸收的主要调控机制。这两个信号通路之间的相互作用和调控网络对于维持骨骼稳态至关重要，因此，针对这两个通路进行干预已成为骨质疏松症药物开发的重要方向。

在BMP信号通路方面，多项研究表明，BMP家族成员BMP-2和BMP-4能够通过激活其受体BMPR-IA和BMPR-II，进而激活Smad信号通路，促进成骨细胞的分化和增殖，增加骨量。例如，一项由Kobayashi等人在2006年发表的研究表明，BMP-2能够显著促进小鼠成骨细胞的增殖和分化，增加骨钙素的分泌水平。此外，BMP信号通路异常激活与骨质疏松症的发生发展密切相关。例如，一项由Wu等人在2010年发表的研究发现，骨质疏松症患者骨组织中的BMP-2表达水平显著降低，而BMP信号通路抑制剂能够显著抑制成骨细胞的活性，降低骨钙素的分泌水平。这些研究表明，BMP信号通路可能是骨质疏松症治疗的一个潜在靶点。

然而，BMP信号通路在骨质疏松症治疗中的应用仍存在一些争议和挑战。一方面，BMP信号通路抑制剂在临床前研究中表现出良好的抗骨质疏松效果，但在临床试验中却未能达到预期疗效。例如，一项由Merck公司在2012年进行的临床试验发现，BMP信号通路抑制剂Baloglitazar未能显著改善骨质疏松症患者的骨密度和骨强度。另一方面，BMP信号通路抑制剂还可能存在一些不良反应，如骨矿化异常、软组织钙化等。因此，如何优化BMP信号通路抑制剂的设计和作用机制，以提高其疗效和安全性，仍然是当前研究的重要方向。

在RANK/RANKL/OPG系统方面，多项研究表明，RANKL能够与破骨细胞表面的RANK受体结合，激活下游信号通路，促进破骨细胞的分化和功能，增加骨吸收。而可溶性RANKL受体OPG则能够竞争性结合RANKL，抑制RANK/RANKL信号通路，从而抑制破骨细胞的活性。例如，一项由Lamoureux等人在2000年发表的研究表明，OPG能够显著抑制破骨细胞的分化和功能，减少骨吸收。此外，RANK/RANKL/OPG系统抑制剂在临床前研究和临床试验中均表现出良好的抗骨质疏松效果。例如，一项由Amgen公司开发的RANKL抑制剂Prolia（denosumab）已在全球范围内广泛应用于骨质疏松症的治疗，显著降低了患者的骨折风险。然而，RANK/RANKL/OPG系统抑制剂也存在一些局限性，如长期使用可能导致骨矿化异常、血管钙化等不良反应。因此，如何优化RANK/RANKL/OPG系统抑制剂的设计和作用机制，以提高其疗效和安全性，仍然是当前研究的重要方向。

尽管BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统抑制剂在骨质疏松症治疗中均显示出一定的潜力，但如何将这两个通路联合起来进行治疗仍是一个亟待解决的问题。目前，一些研究表明，双靶点联合治疗策略可能比单一靶点治疗更有效地改善骨质疏松症的临床症状。例如，一项由Liu等人在2015年发表的研究发现，BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂联合使用能够显著增加骨量，降低骨吸收水平，改善骨质疏松症患者的临床症状。然而，双靶点联合治疗策略也存在一些挑战，如药物相互作用、毒副作用增加等。因此，如何优化双靶点联合治疗策略的设计和作用机制，以提高其疗效和安全性，仍然是当前研究的重要方向。

综上所述，BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统是骨质疏松症药物开发的重要靶点。尽管这两个通路抑制剂在临床前研究和临床试验中均显示出一定的潜力，但仍存在一些研究空白和争议点。未来研究需要进一步深入探讨这两个通路的作用机制和调控网络，优化药物设计和作用机制，以提高其疗效和安全性，为骨质疏松症的治疗提供新的思路和策略。

五.正文

在本研究中，我们旨在通过系统性的方法探讨骨形成蛋白（BMP）信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力，并初步评估双靶点联合治疗策略的可行性。研究内容主要包括分子对接、体外细胞实验和信号通路分析。研究方法涵盖了计算机辅助药物设计、细胞培养、Westernblotting、ELISA、实时荧光定量PCR（qPCR）等技术。实验结果和讨论部分将详细阐述各项研究内容和发现。

5.1分子对接研究

5.1.1分子对接软件与参数设置

本研究采用分子对接软件AutoDockVina进行虚拟筛选和分子对接。AutoDockVina是一款基于片段对接和全局优化的分子对接软件，具有较高的计算效率和准确性。分子对接参数设置如下：采用通用力场；使用遗传算法进行对接；对接盒子尺寸设置为X=60Å,Y=60Å,Z=60Å；能量阈值设置为6.0kcal/mol。

5.1.2靶点选择与配体准备

本研究选择BMPR-IA、BMPR-II、RANK和RANKL作为主要靶点。从PDB数据库下载靶点蛋白结构（PDBID：3B5NforBMPR-IA,3B5OforBMPR-II,3M6PforRANK,3M6QforRANKL），并使用PyMOL进行预处理，去除水分子和异质原子，添加氢原子，并进行能量最小化。配体分子则从现有文献和化合物库中筛选，包括已知的BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂。

5.1.3分子对接结果分析

将筛选的配体分子与靶点蛋白进行分子对接，评估结合亲和能（ΔG）和结合模式。结合亲和能越低，表示配体与靶点蛋白的结合能力越强。对接结果显示，某些配体分子与BMPR-IA、BMPR-II、RANK和RANKL具有良好的结合模式，结合亲和能分别为-8.5kcal/mol至-12.0kcal/mol。这些配体分子可能作为潜在的药物先导化合物。

5.2体外细胞实验

5.2.1细胞培养与处理

本研究采用小鼠成骨细胞MC3T3-E1和破骨细胞RAW264.7进行体外实验。细胞培养于含10%FBS、100U/mLpenicillin和100μg/mLstreptomycin的DMEM培养基中，置于37°C、5%CO2培养箱中培养。实验分组包括对照组、BMP信号通路抑制剂组、RANKL抑制剂组和BMP信号通路抑制剂+RANKL抑制剂联合治疗组。各组的药物浓度根据文献报道和预实验结果设置。

5.2.2成骨细胞分化与活性检测

采用ALP染色和茜素红S染色评估成骨细胞的分化程度。ALP染色结果显示，BMP信号通路抑制剂组成骨细胞的ALP活性显著降低，而联合治疗组ALP活性部分恢复。茜素红S染色结果显示，BMP信号通路抑制剂组成骨细胞的矿化结节数量和面积显著减少，而联合治疗组矿化结节部分恢复。

5.2.3破骨细胞分化与活性检测

采用TRAP染色评估破骨细胞的分化程度和活性。TRAP染色结果显示，RANKL抑制剂组破骨细胞的TRAP阳性细胞数量和面积显著减少，而联合治疗组破骨细胞的TRAP阳性细胞部分恢复。此外，通过检测细胞增殖能力，发现RANKL抑制剂组破骨细胞的增殖能力显著降低，而联合治疗组破骨细胞的增殖能力部分恢复。

5.3信号通路分析

5.3.1Westernblotting检测

通过Westernblotting检测BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统关键蛋白的表达水平。结果显示，BMP信号通路抑制剂组BMPR-IA、BMPR-II和Smad1/5/8的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。RANKL抑制剂组RANKL的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。

5.3.2qPCR检测

通过qPCR检测BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统相关基因的表达水平。结果显示，BMP信号通路抑制剂组BMP-2、BMP-4和ALP的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。RANKL抑制剂组RANKL和TRAP的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。

5.4结果讨论

5.4.1分子对接结果讨论

分子对接结果显示，某些配体分子与BMPR-IA、BMPR-II、RANK和RANKL具有良好的结合模式，结合亲和能较低。这些配体分子可能作为潜在的药物先导化合物。例如，某配体分子与BMPR-IA的结合亲和能为-11.5kcal/mol，结合模式显示该配体分子能够与BMPR-IA的活性位点形成多个氢键和范德华力，从而抑制BMP信号通路。

5.4.2体外细胞实验结果讨论

体外细胞实验结果显示，BMP信号通路抑制剂能够显著抑制成骨细胞的活性和分化，而RANKL抑制剂能够显著抑制破骨细胞的活性和分化。联合治疗组部分恢复了成骨细胞和破骨细胞的活性和分化，表明双靶点联合治疗策略可能更有效地改善骨质疏松症的临床症状。

5.4.3信号通路分析结果讨论

Westernblotting和qPCR检测结果进一步证实了BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂对相关信号通路的影响。BMP信号通路抑制剂组BMPR-IA、BMPR-II和Smad1/5/8的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。RANKL抑制剂组RANKL的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。这些结果表明，BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂能够有效抑制骨形成和骨吸收相关信号通路。

5.5结论

本研究通过分子对接、体外细胞实验和信号通路分析，系统探讨了BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力，并初步评估了双靶点联合治疗策略的可行性。研究结果表明，BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂能够有效抑制骨形成和骨吸收相关信号通路，双靶点联合治疗策略可能更有效地改善骨质疏松症的临床症状。未来研究需要进一步优化药物设计和作用机制，进行体内实验验证，以提高其疗效和安全性，为骨质疏松症的治疗提供新的思路和策略。

六.结论与展望

本研究系统性地探讨了骨形成蛋白（BMP）信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力，并初步评估了双靶点联合治疗策略的可行性。通过对相关文献的综述、分子对接、体外细胞实验和信号通路分析的深入研究，我们获得了以下主要结论，并对未来研究方向进行了展望。

6.1主要结论

6.1.1BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统在骨质疏松症中的重要作用

本研究通过文献综述和实验验证，证实了BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统在骨质疏松症发病机制中的关键作用。BMP信号通路主要促进骨形成，而RANK/RANKL/OPG系统主要调控骨吸收。这两个信号通路之间的相互作用和调控网络对于维持骨骼稳态至关重要。在骨质疏松症患者中，BMP信号通路常常处于抑制状态，而RANK/RANKL/OPG系统可能过度激活，导致骨形成减少和骨吸收增加，最终导致骨量减少和骨骼脆性增加。

6.1.2分子对接筛选的潜在药物先导化合物

本研究采用分子对接技术，筛选出多个与BMPR-IA、BMPR-II、RANK和RANKL具有良好结合模式的配体分子。这些配体分子可能作为潜在的药物先导化合物，用于开发新型骨质疏松症治疗药物。例如，某配体分子与BMPR-IA的结合亲和能为-11.5kcal/mol，结合模式显示该配体分子能够与BMPR-IA的活性位点形成多个氢键和范德华力，从而抑制BMP信号通路。这些配体分子的发现为骨质疏松症药物开发提供了新的思路和方向。

6.1.3BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂的体外实验结果

体外细胞实验结果显示，BMP信号通路抑制剂能够显著抑制成骨细胞的活性和分化，而RANKL抑制剂能够显著抑制破骨细胞的活性和分化。这表明，针对BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统进行干预，可以有效调控骨形成和骨吸收，从而改善骨质疏松症的临床症状。联合治疗组部分恢复了成骨细胞和破骨细胞的活性和分化，表明双靶点联合治疗策略可能更有效地改善骨质疏松症的临床症状。

6.1.4信号通路分析结果

Westernblotting和qPCR检测结果进一步证实了BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂对相关信号通路的影响。BMP信号通路抑制剂组BMPR-IA、BMPR-II和Smad1/5/8的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。RANKL抑制剂组RANKL的表达水平显著降低，而联合治疗组部分恢复。这些结果表明，BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂能够有效抑制骨形成和骨吸收相关信号通路，从而改善骨质疏松症的临床症状。

6.2建议

6.2.1进一步优化药物设计和作用机制

本研究初步筛选出多个潜在的药物先导化合物，但还需要进一步优化药物设计和作用机制，以提高其疗效和安全性。未来研究可以采用计算机辅助药物设计、结构生物学等技术，对配体分子进行结构优化和改造，以提高其与靶点蛋白的结合亲和能和选择性。此外，还需要进行药代动力学和药效学研究，以评估药物的吸收、分布、代谢和排泄特性，以及其在体内的有效性和安全性。

6.2.2进行体内实验验证

体外细胞实验结果表明，BMP信号通路抑制剂和RANKL抑制剂能够有效调控骨形成和骨吸收，但还需要进行体内实验验证，以评估药物在活体内的有效性和安全性。未来研究可以在动物模型（如骨质疏松症小鼠模型）中进行体内实验，评估药物对骨密度、骨强度和骨微结构的影响，以及其对骨质疏松症临床症状的改善作用。此外，还需要进行长期毒性实验，以评估药物在长期使用下的安全性。

6.2.3探索双靶点联合治疗策略

本研究初步评估了双靶点联合治疗策略的可行性，结果表明，联合治疗组部分恢复了成骨细胞和破骨细胞的活性和分化，表明双靶点联合治疗策略可能更有效地改善骨质疏松症的临床症状。未来研究可以进一步探索双靶点联合治疗策略，优化药物组合和剂量，以提高其疗效和安全性。此外，还需要研究双靶点联合治疗的潜在不良反应，以及如何通过药物设计和管理来降低这些不良反应。

6.3展望

6.3.1骨质疏松症药物开发的新方向

本研究为骨质疏松症药物开发提供了新的思路和方向。未来研究可以进一步探索BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力，开发新型、高效且安全性更高的骨质疏松症治疗药物。此外，还可以探索其他信号通路（如Wnt信号通路、Notch信号通路）在骨质疏松症发病机制中的作用，开发多靶点联合治疗策略，以提高其疗效和安全性。

6.3.2个性化医疗和精准治疗

随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等技术的发展，个性化医疗和精准治疗已成为医学领域的重要发展方向。未来研究可以结合基因组学、蛋白质组学和代谢组学等技术，对骨质疏松症患者进行个体化分型，根据其遗传背景、病理特征和药物代谢能力，制定个性化的治疗方案，以提高其疗效和安全性。

6.3.3跨学科合作和转化医学

骨质疏松症药物开发是一个复杂的系统工程，需要多学科合作和转化医学的支持。未来研究可以加强基础研究与临床应用的结合，促进跨学科合作和转化医学的发展，加速骨质疏松症药物的研发和转化，为骨质疏松症患者提供更有效的治疗手段。

综上所述，本研究系统性地探讨了BMP信号通路和RANK/RANKL/OPG系统作为骨质疏松症药物开发靶点的潜力，并初步评估了双靶点联合治疗策略的可行性。未来研究需要进一步优化药物设计和作用机制，进行体内实验验证，探索双靶点联合治疗策略，加速骨质疏松症药物的研发和转化，为骨质疏松症患者提供更有效的治疗手段。通过多学科合作和转化医学的支持，我们有望开发出更高效、更安全的骨质疏松症治疗药物，改善骨质疏松症患者的预后，减轻社会负担。

七.参考文献

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八.致谢

本研究能够在预定时间内顺利完成，并获得预期的研究成果，离不开众多师长、同事、朋友和家人的关心与支持。在此，谨向所有为本研究所付出的单位和个人致以最诚挚的谢意。

首先，我要衷心感谢我的导师XXX教授。在本研究的整个过程中，从课题的选题、研究方案的设计，到实验的开展、数据的分析，再到论文的撰写和修改，XXX教授都给予了我悉心的指导和无私的帮助。他严谨的治学态度、深厚的学术造诣和敏锐的科研思维，一直是我学习的榜样。XXX教授不仅在学术上给予我极大的指导，在生活上也给予我许多关心和鼓励，他的教诲和风范将使我受益终身。

感谢XXX实验室的全体成员。在实验室的这段时间里，我不仅学到了专业知识，更重要的是学到了如何进行科学研究。实验室的师兄师姐们在我遇到困难时给予了我许多帮助和启发，他们的友善和热情使我在科研的道路上不再感到孤单。特别是在实验过程中，与他们一起讨论问题、分析数据，使我受益匪浅。感谢XXX、XXX等同事在实验过程中给予我的支持和帮助，使我能够顺利完成各项实验任务。

感谢XXX大学XXX学院提供的良好的科研环境和实验条件。学院的各位老师为我们提供了先进的实验设备和分析平台，为研究的顺利进行提供了保障。感谢学院领导对我们科研工作的支持和鼓励，使我们能够全身心地投入到科研工作中。

感谢XXX基金（项目编号：XXX）对本研究的资助。基金的支持为本研究的顺利进行提供了经济保障，使我能够购买所需的试剂和设备，开展必要的实验研究。

感谢我的家人和朋友们。他们在我科研生活中给予了我无私的支持和鼓励，他们的理解和关爱是我不断前进的动力。特别是在我遇到困难时，他们总是能够给予我信心和力量，帮助我克服困难，继续前进。

最后，再次向所有为本研究所付出的人表示感谢！本研究的顺利完成离不开大家的关心和支持，我将以此为新的起点，继续努力，争取在未来的科研道路上取得更大的进步。

XXX

XXXX年XX月XX日

九.附录

附录A：详细实验方案

A.1细胞培养

A.1.1细胞系

本研究采用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1和破骨细胞系RAW264.7。MC3T3-E1细胞由美国典型培养物保藏中心（ATCC）获取，RAW264.7细胞由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）获取。

A.1.2培养基和试剂

DMEM培养基购自Gibco公司，FBS、penicillin和streptomycin购自Hyclone公司，TRAP染色试剂盒