T∕SHAAV 037-2025 规模化猪场气溶胶中猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的实时荧光定量PCR检测规范

ICS11.220CCSB41SHAAVSpecificationforreal-timefluorescencequantitativePCRdetectionofswinfluenzavirus,porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusacircovirustype2inaerosolsfromlarge-scaleIT/SHAAV037—2025前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂与材料 26仪器设备 27样品采集、保存及运输 28实验室检测 39生物安全要求 3 5T/SHAAV037—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所、上海市动物疫病预防控制中心、上海农林职业技术学院。本文件主要起草人：魏建超、马志永、张海龙、赵洪进、钟登科、杜波、杨德全、沈海潇、赵乾明、张春晓、林雅芳。本文件首批承诺执行单位名单：中国农业科学院上海兽医研究所、上海市动物疫病预防控制中心、上海农林职业技术学院、高邮瑞驰康农牧有限公司、高邮市三益生猪养殖有限公司、徐州万星畜牧有限公司、高邮市民顺养猪专业合作社、江苏汉世伟食品有限公司、诺达生物科技（赞皇）有限公司、河北唐碧生物科技有限公司。1T/SHAAV037—2025规模化猪场气溶胶中猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的实时荧光定量PCR检测规范本文件规定了规模化猪场气溶胶样品采集的原理、试剂与材料、仪器设备、样品采集、保存及运输、实验室检测和生物安全要求。本文件适用于规模化猪场气溶胶样品中猪流感病毒、猪繁殖障碍综合征病毒和猪圆环病毒2型病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T18090猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GB/T27539动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB/T34745猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1规模化猪场large-scalepigfarms采用现代养殖技术与设施设备，实行批次化、全进全出生产工艺，存栏基础母猪100头以上或年出栏商品猪500头以上的自繁自养场、专业母猪场、专业育肥猪场。[GB/T17824.1—2022，定义3.1]3.2气溶胶aerosols悬浮于气体介质中的粒径一般为0.001μm～100μm的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。[GB19489—2008，定义2.1]4原理液体冲击式微生物气溶胶采样器（又称：液体撞击式采样器）是一种气溶胶微生物采集设备，由采样瓶、进气弯管、喷嘴、抽气管和控制器组成。空气从进气弯管进入，该管的末端有一微孔喷嘴，气流经此速度变快，通过高速吸入空气，使其猛烈冲击到气溶胶吸收液的液面，空气中的微生物颗粒因惯性2T/SHAAV037—2025作用而被捕获在气溶胶吸收液中，随着采样时间的进行，越来越多的微生物被不断收集到固定体积的气溶胶吸收液中，从而实现气溶胶中微生物的富集。冲击完液面后的空气通过采样器的出口排出。5试剂与材料5.1试剂除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682要求。所用液体试剂均需使用无DNAase/RNAase的容器进行分装。5.1.1气溶胶吸收液为30%甘油磷酸缓冲液（pH7.4）：配制方法见附录A。5.1.2商品化DNA/RNA核酸提取试剂盒。5.2材料5.2.120mL采样瓶。。5.2.220mL离心管。6仪器设备6.1液体冲击式微生物气溶胶采样器。6.2高压蒸汽灭菌器。6.3Ⅱ级生物安全柜。6.4高速冷冻离心机，可控温至4℃,离心速度12000r/min以上。6.5实时荧光定量PCR仪。6.6移液器，量程为0.5µL～10µL、2µL～20µL、20µL～200µL和200µL～1000µL。7样品采集、保存及运输7.1布点原则7.1.1一般采集猪舍内的空气样本来评价规模化猪场空气中微生物状况。7.1.2同类型猪舍采样点设置条件应一致，同一猪舍内采样点位置应固定。7.1.3猪舍内多点采样时，应按照对角线或梅花式均匀布点，采样点离墙壁距离应大于0.5m，离门窗及风机出风口距离应大于1m。7.2采样要求7.2.1环境温度5℃≤环境温度≤26℃。7.2.2时间选择猪场活动较频繁的时间段进行采样，例如早晨、午间或傍晚喂料前后。7.2.3频次根据猪场疫病监测需要，可每天连续采样。7.2.4高度猪舍内采样点高度与猪舍内猪只呼吸高度一致，根据不同日龄猪的大小调整高度，一般距离地面0.3m～0.9m。3T/SHAAV037—20257.2.5数量猪舍内采样点数量根据猪场规模、饲养密度而适量增加，一般不少于5个（进风口、出风口、舍区7.3采样方法7.3.1将20mL气溶胶吸收液倒入采样瓶中，经121°C、30min高压灭菌后使用。7.3.2按照说明书安装液体冲击式微生物气溶胶采样器，设置空气流量为10L/min、采样时间为15min~30min，打开电源开始采样。7.3.3采样完毕后关闭电源，取下采样瓶，按照NY/T541中的要求，做好采样记录。7.4样品保存及运输样品保存和运输按照NY/T541执行。8实验室检测8.1气溶胶样品的前处理在生物安全柜中打开采样瓶，取15mL～20mL气溶胶吸收液放入离心管中，12000r/min离心10min。取上清进行核酸提取。8.2样品病毒RNA和DNA提取采用DNA/RNA核酸提取试剂盒提取样品中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取样品中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，超过2h应置于-20℃冰箱保存。8.3实时荧光定量PCR检测和结果判定8.3.1猪流感病毒核酸检测和结果判定按照GB/T27539执行。8.3.2猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测和结果判定按照GB/T18090执行。8.3.3猪圆环2型病毒核酸检测和结果判定按照GB/T34745执行。8.4结果报告8.4.1猪流感病毒经8.3.1判定为阳性，即表明该规模化猪场气溶胶内存在猪流感病毒核酸。8.4.2猪繁殖与呼吸综合征病毒经8.3.2判定为阳性，即表明该规模化猪场气溶胶内存在猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸。8.4.3猪圆环2型病毒经8.3.3判定为阳性，即表明该规模化猪场气溶胶内存在猪圆环2型病毒核酸。9生物安全要求9.1个人防护要求对采样人员进行定期培训。在现场采样时，工作人员应穿工作服和胶鞋，佩戴口罩、防护眼镜和一次性乳胶手套。9.2实验室生物安全要求4T/SHAAV037—2025应符合GB19489中的要求，所有与样品接触的工具均需提前121℃高压30min灭菌处理，并在无菌条件下保存和使用。所有气溶胶样本废弃物必须经121℃、30min高压蒸汽灭菌，确保病毒完全灭活后方可移出实验室。T/SHAAV037—2025附录A（规范性）30%甘油磷酸缓冲液（pH7.4）配制A.1pH7.4磷酸缓冲液配制a）80gNa