生物工程专业神经生物学实验指导

生物工程专业神经生物学实验指导

实验内容一：大鼠脑立体定位及帕金森病（PD）模型制作

目的要求：掌握大鼠脑立体定位仪的设计原理、基本结构、用途和正确使用；PD模型制作要点

和注意事项。

实验分组：4人/组

实验课时：5学时

实验用动物、器械和药品：

健康成年SD大鼠，体重200—250g,雌雄不拘；脑立体定位仪、水平仪、电吹风；麻醉药（0.4%

戊巴比妥钠：戊巴比妥钠0。4g,生理盐水100ml）;碘酒、酒精、生理盐水、蒸储水；5或10ul

微量注射器；手术器械，如手术刀、镶、止血钳等；大鼠脑立体定位图谱；6—羟基多巴胺

（6-0HDA）溶液（按3ug/ul配制，加Vc,即6-0HDA溶液1ml：将6-0HDA3mg,VitCO.2mg,溶于

灭菌生理盐水，在1。5ml离心管中定容至1ml,分装后一20℃保存）。实验操作及注意点：

1.根据老师的讲解和指导,认识脑立体定位仪主要部件，即主框、电极移动架及动物头部固

定装置（即固定上颌的结构和耳杆与耳杆固定柱）及用途。

2.脑立体定位仪的调试：摆稳定位仪，用水平仪测水平。检脸电极移动架上各个轴向滑尺是

否保持互相垂直，微量注射器针尖是否光滑垂直，检查定位仪各衔接部位的螺丝有无松

动.检查头部固定装置两侧是否对称.检查耳杆使两耳杆尖端相对，以此判定耳杆固定的

准确程度.然后，使两耳杆尖端相对间隔1〜2mm，前后移动固定有注射器的注射装置纵

轴，使注射器的针体向后移时，恰好通过两耳杆尖端之间的1〜2mm间隙；向前移时，

恰好与切牙固定架的正中刻线在一条直线上.

3.大鼠称重并麻醉（腹腔注射戊巴比妥钠，40mg/kg）,动物麻醉不可过深或过浅，注意呼

吸情况。抓取大鼠时要轻柔，防止抓咬伤。

4.鼠颅的固定：将麻醉大鼠置于脑立体定位仪上，鼠颅依靠两耳杆及切牙钩三点固定.在向

外耳道内插入耳杆时，鼠眼球向外凸出。一旦进入鼓膜环沟内，穿破鼓膜，则会发出轻

微的“喷”声，同时出现眨眼反射，眼球不再凸出，说明耳杆进位正确。固定左、右侧

耳杆,拧紧耳杆固定旋钮。接着，用定位伐上的切牙钩，钩住大鼠的切牙，要钩至切牙根部,

并固定之。鼠颅前固定点的正确与否，决定着鼠颅固定是否合适.脑立体定位仪坐标“0”

点的测得：按照Paxinos大鼠脑立体定位图谱，以颅骨前囱即冠矢点作为前后方向的

“0”参照点，当微量注射器的针尖对准冠矢点时，读取立体定位仪三维坐标上标尺的数

值，此数值即是“0”点坐标。

6.选定靶点：在大鼠颅顶剪毛备皮，置洞巾，碘酒、酒精消毒，纵向切开头皮，用止血钳将

皮肤左右分开，暴露手术视野，以刀片刮去颅盖骨膜，注意止血。将冠矢点定为“0”

点，对照大鼠脑立体定位图谱，计算出所定位AP、ML、DV三个方向的坐标值（零点坐标

值与靶位坐标值相加）.

7.根据所选定制作PD模型注射靶点，用记号笔在颅骨表面作好标记，用手术刀尖旋转钻

孔.用微量注射器向一侧黑质致密部（SNC:AP—4.8;ML1.8；DV8.3）;和中脑腹侧被盖区

（VTA：AP—4o8；ML1.0；DV8o3;DV注意加上颅骨、脑膜及其之间间隙的厚度，一般在1mm）

各注射9ug/3ul6—0HDA溶液（6—0HDA溶液最好新鲜配制，并加入抗氧化剂，如Vc）.注

意推药时用指头轻轻缓慢触推（0。5ul/min,停留1分钟），约10分钟将药推完，缓慢

退针0.5mm,留针1min,然后按2。0mm/min速度缓慢拔针，退出微量注射器，并将微

量注射器用蒸倚水冲洗干净凉干。

7.用手术线缝合皮肤，并田酒精棉球擦拭消毒。松动并退出耳杆和门齿杆，轻轻取下动物

置于鼠笼内，单独放置，侧卧，观察呼吸，注意保温。

8.认真记录实脸全过程。

实验内容二：大鼠灌流取脑及鼠脑大体解剖学观察

目的要求：掌握大鼠灌流取脑的基本程序和要求、操作要点和注意事项；正确辨别鼠脑的分部及

各部分形态结构特点。

实验分组：4人/组

实验课时：5学时

实验用动物器械和药品：

大鼠200-250g,雌雄不拘；阿朴吗啡（APO）溶液100ml（AP02.5mg,灭菌生理盐水100ml,4℃

保存）；麻醉药，如戊巴比妥钠（配制及剂量同前）；生理盐水;4%多聚甲醛溶液（PFA）或

30%福尔马林；蒸馈水；输液架；灌流用方盘；灌流胶管及针头；手术器械，如手术刀、镶、

止血钳、小型咬骨钳等；广口玻璃瓶（容积50或100ml,用于盛放后固定脑）。

实验操作及注意点：

1.将上周制作的PD模型大鼠腹腔内注射阿朴吗啡（APO）溶液（0.25mg/kg）,诱导动物向健

侧旋转，筛选出30分钟内旋转超过210次（7圈/分）者为成功PD大鼠模型。

2.将PD模型大鼠或正常大鼠称重并深麻（麻醉方法同前，但剂量加大），抓取大鼠时要轻

柔，防止抓咬伤。

3.将深麻大鼠仰面朝天平放在港流用方盘内，用刀沿左侧肋弓下缘、胸骨右缘外侧及左侧

腋前线纵行切开，除去皮肤和肌肉等并剪断肋骨，暴露心脏。

4.在心尖部剪一小口，将灌流用针头自心尖小口处插入（稍偏右，针尖要钝而光滑），一直

插入升主动脉，注意不要用力过猛而刺破主动脉壁，并在动脉外用丝线结扎固定，防止

针头滑脱.

5.放开灌流夹，紧接着在右心房剪一小口放流静脉血，快速灌流150nli生理盐水（约3—5

分钟）。

6.注意观察大鼠唇部变苍白，即可改灌10%福尔马林400ml,先快后慢（约40-60分钟），

头部位置稍低，一旦大鼠出现抽搐，用手轻轻固定拉伸头尾，以防动物躯体变形，不利

于取脑.

7.断头，前入路或后入路（按老师示范的方法操作）取脑并用蒸馈水冲洗干净，置于装有

灌流固定液的50或100ml广口玻璃瓶内。

8.将脑从固定液中取出，用蒸馅水冲洗干净，置于方盘中，脑下面垫一干净白纱布。用眼

科镇小心剔除脑表面脑膜及血管等，从不同的面观察脑的全貌及各部分。

9.逐一解剖分离脑的各部分（按老师示范的方法操作），并仔细观察各部分结构特点。

10.认真记录实脸全过程.

实验内容三：大鼠脊髓及脑切片的显微镜观察

目的要求：能正确使用显微镜辨认尼氏染色典型标准脊髓和脑冠状切片上的主要结构和神经元

胞体形态，如脊髓灰质、下橄榄核、三叉神经脊束核、黑质、尾壳核和大脑皮质、中脑水

管、第四脑室、海马等以及辨别依据.

实验分组：4人/组

实验课时：5学时

实验用动物器械和药品：

尼氏染色典型标准大鼠脊髓及脑冠状切片；双目显微镜（附4倍和10倍、4c信物镜）。

实验操作及注意点：

1.复习显微镜的使用方法，注意正确操作。

2.肉眼辨别所取切片的大致定位，是脊髓还是脑，是中脑还是前脑等。

3.按脊髓、延髓、脑桥、白脑和前脑的切片顺序对照Paxinos大鼠脑图谱，从低倍到高倍

仔细观察.

4.认真记录观察内容，并绘简图（2-3张切片）标注出你所观察到的主要结构.

附：有关常用液体的配制：

1.0.01MPBS

Na2HP043008g,NaH2P040o28