基质辅助激光解析电离飞行时间核酸质谱法 核苷酸检测方法通则V1

ICS11.040.01CCSN54团体标准T/CRHAXXX—202X基质辅助激光解析电离飞行时间核酸质谱法核苷酸检测方法通则Methodofnucleotidedetectionformatrix-assistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry（征求意见稿）202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施中国研究型医院学会发布T/CRHAXXXXX—202X前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 25检测原理 26检测技术指标 27样本检测要求 38样本检测方法 4附录A（资料性）核酸质谱检测原理 8附录B（资料性）核酸质谱检测配套通用试剂 9附录C（资料性）核酸质谱检测预处理程序 10参考文献 11前言本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：XXX。本文件主要起草人：XXX。范围本文件规定了使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行单核苷酸检测方法的术语和定义、缩略语、检测原理、试剂和材料、仪器和设备、检测方法、检测报告。本文件适用于对生命体来源的DNA进行核苷酸检测。注：生命体来源的样本包括血液、体液、组织、排泄物等。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6041—2020质谱分析方法通则GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T26810—2011可见分光光度计GB/T29791.3—2013体外诊断医疗器械制造商提供的信息标示GB/T32267—2015分析仪器性能测定术语GB/T33864—2017质谱仪通用规范GB/T34797—2017核酸引物探针质量技术要求YY/T1244—2014体外诊断试剂用纯化水YY/T1717—2020核酸提取试剂盒（磁珠法）YY/T1173—2010聚合酶链反应分析仪JJF1527—2015聚合酶链反应分析仪校准规范JJF1836—2020微量分光光度计校准规范JJF1874—2020（自动）核酸提取仪校准规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。引物primer在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点和/或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。聚合酶链式反应polymerasechainreaction模板DNA先经过高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何位数扩增。终止碱基terminationbase引物延伸过程中，采用经过处理或修饰过的dNTPs，包含但不限于双脱氧核糖核苷酸(ddNTPs)或乙酰化dNTPs，用于终止下一个碱基的延伸。缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）ddNTP：双脱氧核糖核苷三磷酸（doubledeoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）SAP：虾碱性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）bp：碱基对（basepair）nt：核苷酸(nucleotide)检测原理将动物组织、植物组织、人体的血液、口腔黏膜、毛发、粪便、微生物等生物样品制备成待测DNA。待测DNA通过多重PCR扩增，扩增产物经SAP去除剩余dNTPs，然后利用延伸引物和ddNTPs对目标位点进行单碱基延伸。延伸产物经过阳离子树脂纯化后，被加载至带有基质的载体上，并使用MALDI-TOF对延伸产物进行检测，通过质荷比分析得到具体单核苷酸类型。MALDI-TOF单核苷酸检测原理示意图参见附录A。检测技术指标检测通量核酸质谱芯片单靶点不少于25个核苷酸。核苷酸准确率核苷酸准确率不低于99.5%。方法符合率符合率不小于95.0%。分析灵敏度核酸含量不低于1ng。样本检测要求核酸质谱仪的样本检测原理见附录A、配套通用试剂见附录B及预处理程序见附录C。样本检测材料检测用纯化水：检测用纯化水应符合YY/T1244-2014的要求；配套质谱芯片：检测用核酸质谱芯片宜固态纳米芯片；提取试剂：用于提取样本中的核酸，宜采用符合YY/T1717-2010磁珠法提取试剂盒；扩增试剂：用于多重核酸扩增(PCR扩增)，试剂至少应包含PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶；消化试剂：用于消除核酸扩增产物中剩余dNTP，试剂至少应包含消化缓冲液、SAP；延伸试剂：用于核酸扩增产物的单碱基延伸，试剂至少应包含延伸缓冲液、延伸酶、终止碱基；纯化试剂：用于除去前序延伸产物中金属阳离子，宜采用离子交换方法的样本核酸纯化试剂；质控品：用于样本检测过程质控，质控品中已知样本来源宜为质粒或生物样本；引物：引物合成工艺及质量应符合GB/T34797-2017的要求，延伸引物与对应扩增产物之间应仅有一个结合位点，应避免形成引物二聚体、发卡结构或复杂二级结构，宜符合表2的要求引物基本要求序号引物类型要求1扩增引物长度宜大于30nt，其中包含10nt标签序列2延伸引物长度宜在13nt至31nt之间样本检测设备样本核酸提取设备：磁珠法核酸提取仪应符合JJF1874-2020校准规范；核酸浓度检测设备:紫外可见分光光度计应满足GB/T26810-2011的要求，符合JJF1836-2020校准规范；多重核酸扩增设备：聚合酶链反应分析仪应满足YY/T1173-2010的要求，符合JJF1527-2015校准规范；核酸质谱检测设备：符合仪器出厂标准。样本检测体系的要求检测试剂检测试剂的来源分商品化试剂和实验室自建试剂。如条件允许且检测性能满足需求，应优先选择商品化试剂。检测试剂按照用途可分为通用试剂（如多重PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂等）和专用试剂（主要为扩增引物和延伸引物等）。通用试剂应能够容纳多基因多位点的联合检测。核酸质谱芯片单靶点单次检测通量应不少于25个核苷酸。检测位点设计采用核酸质谱技术检测样本中的核酸，应有明确已知的基因位点；扩增引物和延伸引物应位于检测位点上下游保守序列区。同一检测体系内，多重扩增引物的Tm值最大差值优选不大于3℃。检测性能用于核酸质谱基因检测的检测体系，应至少经过以下性能指标的确认：分析灵敏度（最低检测限/检出限）、方法符合率、稳定性、重复性、干扰物质的影响。分析灵敏度（最低检测限/检出限）检测体系应进行分析灵敏度/最低检测限/检出限（以下称检出限）的确认。有定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）时，采用定值标准物质进行确认。如无定值标准物质，可采用实际样本核酸，采用参比方法确认其浓度后，再进行验证。核酸质谱检测体系的检出限，应能达到1ng/uL，对于稀有突变的检出限应达到1%（样本核酸浓度在10ng/uL及以上）。方法符合率检测体系应通过与参比方法进行比较，评估方法符合率。参比方法包括但不限于：金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求满足预期用途的方法等。核酸质谱检测体系的方法符合率，应不低于95%。稳定性应对整个检测体系的保存稳定性进行测试，可采用加速实验确认。对成品试剂，也可采信厂家声明的保存期限。重复性检测体系应保证同一检测体系下检测结果的可重复性，在批内和批间检测中，同一样本同一检测体系下获得的检测结果应一致。干扰物质的影响核酸质谱检测体系常见的干扰物质主要见于样本中容易存在的、对核酸检测可能造成干扰的物质，如临床样本中的抗凝剂、血红蛋白、甘油三酯、胆红素、药物等，生物样本中常用的保存液、固定试剂等。可根据检测需求和样本特点（实际可能存在的干扰物质及达到的浓度）选择需要验证的干扰物质及浓度，采用弱阳性参考品/样本中加入干扰物质的方式进行验证，样本中可能存在的干扰物质应对检测无影响。信息分析系统检测体系应有对应的分析系统，包括分析文件及分析系统。分析文件，应定义检测位点，以及检测位点对应的质量数据；分析系统应能够分析每个样本对应的位点信息、位点检测峰图或峰值信息等；分析系统应能够对检测结果进行判断；分析系统应经过性能确认，应对检测体系所有的检测位点的基因型进行验证，验证应包括数据分析时所用到的所有硬件和软件系统，涵盖分析的所有步骤。样本检测方法检测环境核酸质谱仪宜安装在基因扩增检验实验室（PCR实验室）使用，实验室宜有一定的功能划分，以便于工作和防止交叉污染：试剂准备区（一区）：检测试剂和材料的保存、分装和配制；样本制备区（二区）：样本的接收及短期保存、核酸提取、浓度检测和核酸加样；扩增区（三区）：多重核酸扩增产物分析区（四区）：单碱基消化、单碱基延伸、延伸产物处理、核酸质谱检测。实验室设计和检测过程管理参考附录D推荐的标准及指南进行。检测人员根据检测需求，应具备分子生物学、检验等检测相关的专业背景，参加了检测相关的基因扩增实验室技术培训，并获得培训合格证书。应接受过核酸质谱技术的理论和实验培训。检测体系的性能验证/确认检测前应对检测体系进行性能验证/确认。对于检测体系的性能验证应涵盖实验及分析的全流程。指标应至少包括分析灵敏度（最低检测限/检出限）和方法符合率。并根据实际检测需要，对检测体系的其他检测性能指标进行验证。检测体系的验证/确认应由实验室负责人审批并有书面记录。在检测流程发生变更时，需进行重新验证/确认。再次验证／确认实验需覆盖全部或部分步骤，视操作程序的修改程度而定。检测准备检测申请及检测信息登记根据检测需求，制定检测申请/检测信息登记内容。应至少包括：样本的来源信息、样本的唯一性标识、样本类型、申请的检测项目、样本采集的日期等信息。样本采集及保存运输实验室应根据实验要求，制定样本采集及保存运输的相关标准，并对样本采集人员、样本保存和运输人员进行培训。样本保存运输过程中，应有对保存运输条件是否符合要求的监控措施，并匹配必须的硬件。样本检测流程样本接收检测实验室接收样本时，应对检测申请/检测信息登记进行核对；应对到达实验室的样本是否合格进行判断。判断的内容包括但不限于：样本采集是否合格，样本保存运输过程中是否符合要求，待测样本容器，待测样本标签是否完整，样本到达实验室时状态是否符合要求等。以上判断应有相关的操作说明。判断合格的样本方可进入实验室进行检测。核酸提取根据样本核酸提取设备及试剂盒说明，从待测样本提取待测核酸；实验室宜采用质控品与待测样本平行进行核酸提取等方式，对提取环节进行质控。核酸质量检测待测核酸浓度应不低于检出限。宜采用紫外分光光度计等方式，通过检测待测核酸紫外吸光度(A260/280)，检测其纯度，A260/280应在1.7至2.0范围内。多重核酸扩增将扩增引物与扩增预混液混合，并加入待测核酸，放入核酸扩增设备，根据预设的扩增程序，进行扩增，生成扩增产物。单碱基消化将消化试剂加入到扩增产物中，放入核酸扩增设备去除扩增产品中未消耗的dNTPs，生成成消化产物。单碱基延伸将延伸试剂和延伸引物加入到消化产物中，放入核酸扩增设备进行单碱基延伸，生成延伸产物。延伸产物纯化将样本核酸纯化试剂（如树脂等离子纯化试剂）加入到延伸产物中，消除延伸产物中的阳性金属离子，得到纯化产物。质谱芯片点样将纯化产物加载到核酸质谱芯片靶点，使纯化产物与芯片上的靶点基质结合形成共结晶体。核酸质谱检测将核酸质谱芯片放入核酸质谱仪进行核酸质谱检测，获得质谱数据；经过数据分析得到核苷酸结果，并提供质谱检测报告。样本检测结果质谱检测结果质谱检测结果应包含但不限于以下内容：检测样本的标识信息、检测位点信息、样本对应的质谱芯片点位信息、分析类型、位点的基因型信息、支持位点基因型判读的信息。样本检测报告样本检测报告包含但不限于以下内容：样本信息：样本来源信息、样本唯一性标识、样本类型、样本状态、采样日期、送检日期、以及用于判断结果所必须的其他信息等。检测信息：检测方法、检测项目、检测范围、必要的检测性能指标、实验室名称、实验室联系方式、检测人员、审核人员、基因位点的检测结果、检测结果对应的解释或数据资料、样本接收日期、报告日期等。检测质量控制与管理实验室要求实验室区域设置和环境需要满足实验环节和仪器的要求，并根据其应用领域，符合相关领域核酸检测实验室的相关规范；检测人员、分析报告人员等应具备相应的专业背景，经过相关培训并取得上岗资质；实验室检测体系应优先选用商品化的检测试剂；实验室自建方法应有严格的试剂制备标准操作规程，并经性能确认合格后方可使用。检测过程的质量管理实验室应建立质量管理体系，对检测全流程进行管理。对样本采集和保存运输、检测实验操作、分析和报告等各个环节均需建立相应的标准操作规程；实验设备应妥善管理，所有实验设备均需有相应的标准操作规程，根据仪器需要进行定期维护和校准；检测体系需经过性能验证后方可投入使用；实验过程应设置相应的质控品。实验室应采用明确的无核酸或无变异样本作为阴性质控，确保实验室过程无污染和无非特异性扩增。实验室需对质控品检测结果进行记录和评价，并定期进行回顾分析；实验室应定期参加相关检测项目的室间质量评价或能力验证，或者通过实验室间比对，判断检测结果的可接受性。

（资料性）

核酸质谱检测原理AAT核酸扩增单碱基消化SAP酶去除剩余dNTPsAT单碱基延伸Na+H+Na+离子交换样本核酸纯化10nttag核酸质谱检测核酸检测原理示意图

（资料性）

核酸质谱检测配套通用试剂核酸质谱检测配套通用试剂宜采用成熟的预处理试剂或预混液体系，包括但不限于多重扩增预混液、单碱基消化预混液和单碱基延伸预混液，各预处理试剂或预混液体系配置在不同应用条件下可进行适应性调整，推荐配方如下：多重扩增预混液配方表试剂名称浓度体积µLPCR缓冲液10×0.5MgCl225mM0.4dNTPs25mM0.1DNA聚合酶5U/µL0.2PCR扩增引物500µM1