《重组DNA技术的基本工具》课件

第1节重组DNA技术的基本工具第3章基因工程番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。

在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。非转基因番木瓜转基因番木瓜

实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”。“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”

一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1．作用切割DNA分子。

2．来源主要从原核生物中分离纯化。

/////////你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？/////////

原核生物中的限制酶可以切割外源DNA，但对自身的DNA不起作用，起到保护自身的作用。？

3．作用特点能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键（如右图）断开。

大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。TGAGTCATCA3'5'3'5'磷酸二酯键CGCCGGGCGGCCGCCG3'5'3'5'CCGGCGCGGTCATAAATTCG

一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”4．作用结果DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。EcoRⅠ：识别GAATTC序列，在G与A之间切割。SmaⅠ：识别CCCGGG序列，在G与C之间切割。AGATTCTCAGTA3'5'3'5'黏性末端黏性末端平末端平末端中轴线中轴线科学思维训练1．想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。5′-ACTAGT-3′3′-TGATCA-5′SpeⅠ5′-AAGCTT-3′3′-TTCGAA-5′HindⅢ5′-TCTAGA-3′3′-AGATCT-5′XbaⅠ5′-GATATC-3′3′-CTATAG-5′EcoRⅤ5′-CTCGAG-3′3′-GAGCTC-5′XhoⅠ⑴哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？

XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。⑵不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？

识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。⑶将限制酶SpeⅠ和限制酶XbaⅠ切割产生相同的黏性末端，可以用DNA连接酶“缝合”吗？若可以则重组DNA还可以用这两种限制酶再切割吗？

可以，只要两个黏性末端互补配对DNA连接酶即可对其“缝合”；不能，不存在原来的识别序列了。

二、DNA连接酶——“分子缝合针”1．作用将DNA片段拼接成新的DNA分子。

2．种类

①E·coliDNA连接酶从大肠杆菌中分离得到，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。

②T4DNA连接酶从T4噬菌体中分离出来，既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。

注意：DNA连接酶连接的是2个DNA片段之间的磷酸二酯键。

/////////DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？/////////

不是一回事。⑴DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。⑵DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。？

三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

外源基因不能进入受体细胞并复制自己，需要外力的帮助。

1．载体的作用

⑴作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中。

⑵在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2．质粒——基因工程中最常用的载体

是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。拟核DNA质粒大肠杆菌质粒

三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

阅读教材第72页相关内容，分析作为载体必须具备的条件。3．载体的要求

⑴能在受体细胞中稳定保存并复制。即携带外源DNA片段进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。质粒标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点

⑵具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA（基因）插入。⑶具有标记基因。通常是一些抗生素的抗性基因，便于重组DNA分子的筛选。⑷对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。

三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”4．载体的种类

在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。重组DNA分子

请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：5′-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3′5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3′3′-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5′3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5′

请你用EcoRⅠ限制酶对上述两DNA进行“切割”后。将右边DNA链上切下的片段重组到左边那条DNA链的切口处。思考·讨论？5′-ATAGCATGCTATCCATG

AATTCGGCATAC-3′3′-TATCGTACGATAGGTACTTAA

GCCGTATG-5′AATTCATACCGAG

GTATGGCTCTTAA练一练1．利用某目的基因（图甲）和P1噬菌体载体（图乙）构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的切割位点分别如下图所示（已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同）。下列分析错误的是（）A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体C．图乙中P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，两用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA目的基因BglⅡHindⅢEcoRⅠEcoRⅠ甲乙BglⅡHindⅢEcoRⅠD选择限制酶的方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

⑴应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

⑵为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可以使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。抗病基因↑SmaⅠ↑EcoRⅠPstⅠ↓PstⅠ↓SmaⅠ↓甲SmaⅠPstⅠEcoRⅠ标记基因乙学习方法总结选择限制酶的方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。

⑶切割质粒时通常选择与切割含目的基因的DNA片段相同的限制酶，以确保二者具有相同的末端。

⑷切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以便用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。抗病基因↑SmaⅠ↑EcoRⅠPstⅠ↓PstⅠ↓SmaⅠ↓甲SmaⅠPstⅠEcoRⅠ标记基因乙学习方法总结探究·实践DNA的粗提取与鉴定一、实验思路

DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。二、实验原理

⑴初步分离DNA和蛋白质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。

⑵溶解DNA：DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。

⑶鉴定DNA：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。三、目的要求

⑴了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。

⑵学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。探究·实践DNA的粗提取与鉴定四、方法步骤

⑴DNA粗提取研磨称取约5g菜花切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。分离将研磨液过滤后在4℃冰箱中放置几分钟或1500r/min离心5min后取上清液。提纯在上清液中加入体积相等的、预冷的95%酒精溶液，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。析出DNA时为什么必须用预冷的酒精？

预冷的酒精具有以下优点：

⑴可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。

⑵抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出。

⑶低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。探究·实践DNA的粗提取与鉴定四、方法步骤

⑵DNA鉴定

取两支20mL试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定DNA鉴定结果123456789101112131415A级必备知识基础练1.下列有关基因工程的叙述,正确的是(

)A.基因工程是细胞水平上的生物工程B.基因工程能定向改造生物的性状C.基因工程的产物对生物都有利D.基因工程引起的变异属于基因突变B解析

基因工程是分子水平上的生物工程,A项错误;基因工程育种的优点之一是目的性强,可以按照人们的意愿定向改造生物,B项正确;基因工程的产物对生物不都是有益的,也可能对生物产生危害,C项错误;基因工程产生的变异属于基因重组,D项错误。1234567891011121314152.[吉林长春高二月考]科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中,在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据不正确的是(

)A.所有生物共用一套遗传密码B.基因能控制蛋白质的合成C.兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成,都遵循相同的碱基互补配对原则D.兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先D123456789101112131415解析

题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程,目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质,说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的,相同的密码子决定相同的氨基酸,A项正确;基因是通过转录获得mRNA,进而控制蛋白质的合成,B项正确;基因通常是有遗传效应的DNA片段,只要是双链DNA,都遵循碱基互补配对原则,其组成原料都是四种脱氧核苷酸,C项正确;生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系,D项错误。1234567891011121314153.在基因工程操作过程中,DNA连接酶的作用是(

)A.将任意两个DNA片段连接起来B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来,包括DNA片段和碱基对之间的氢键C.连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段,即形成磷酸二酯键D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键C解析

DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。E.coli

DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来,不能连接具有平末端的DNA片段。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。1234567891011121314154.下图表示限制酶切割某DNA分子的过程,从图中可知,该限制酶能识别的碱基序列及切割位点是(

)A.5'-CTTAAG-3',切点在C和T之间B.5'-CTTAAG-3',切点在G和A之间C.5'-GAATTC-3',切点在G和A之间D.5'-CTTAAC-3',切点在C和T之间C解析

依图可知,该限制酶切割的位点为G与A之间,由产生的黏性末端可知该限制酶所能识别的序列为

5'-GAATTC-3'。

1234567891011121314155.下图表示三种酶分别作用于DNA分子的不同部位,①②③这三种酶依次是(

)A.DNA连接酶、限制酶、解旋酶B.限制酶、解旋酶、DNA连接酶C.解旋酶、限制酶、DNA连接酶D.限制酶、DNA连接酶、解旋酶C解析

①作用的部位是氢键,因此①是解旋酶;②作用的部位是磷酸二酯键,因此②是限制酶;③作用的部位是两个DNA片段的缺口,因此③是DNA连接酶。1234567891011121314156.[吉林省实验中学高二期中]下列关于基因工程的说法,正确的有(

)①基因工程是在DNA分子水平进行设计和施工的②重组DNA技术所用的工具包括限制酶、DNA连接酶、载体③限制酶主要是从真核生物中分离纯化出来的④E.coliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端⑤DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的⑥载体质粒可采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因⑦质粒是基因工程中唯一用作运载目的基因的载体⑧基因工程的原理为基因重组A.3项

B.4项

C.5项

D.6项B123456789101112131415解析

基因工程的操作对象是基因,因此其是在DNA分子水平进行设计和施工的,①正确;重组DNA技术所用的工具包括限制酶、DNA连接酶、载体,②正确;限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,③错误;E.coli

DNA连接酶只能连接黏性末端,④错误;DNA连接酶不都是从原核生物中分离得到的,也可以从T4噬菌体中获得,⑤错误;载体质粒可采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因,筛选含有目的基因的受体细胞,⑥正确;质粒是基因工程中运载目的基因的常用载体,此外还有动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等,⑦错误;基因工程的原理为基因重组,⑧正确。1234567891011121314157.作为基因的运输工具——载体,必须具备的条件之一及理由正确的是(

)A.能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因B.其有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因,以使目的基因能够与其结合D.对受体细胞无伤害,以便于重组DNA的鉴定和选择A123456789101112131415解析

作为载体必须具备的条件之一是能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因,A项正确;作为载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切点,以便于目的基因的插入,B项错误;作为载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因,以便重组DNA分子的筛选,C项错误;对受体细胞无伤害不是便于重组DNA的鉴定和选择的原因,D项错误。1234567891011121314158.[广东潮州高二期中]下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是(

)A.限制酶将DNA双链切割成两条单链B.同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒,因此不具有专一性C.序列5'-CTAG↓-3'和3'-G↓GATCC-5'被限制酶切出的黏性末端相同D.E.coliDNA连接酶能催化平末端和黏性末端的连接C123456789101112131415解析

DNA双链之间由氢键相连,而限制酶破坏的是磷酸二酯键,因此将DNA分子切割成两段,A项错误;同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒,是由于目的基因和质粒都具有相同的酶切位点,因此具有专一性,B项错误;序列5'-CTAG↓-3'和3'-G↓GATCC-5'被限制酶切出的黏性末端相同,均为GATC-5',C项正确;E.coli

DNA连接酶能催化黏性末端的连接,不能催化平末端连接,D项错误。1234567891011121314159.[黑龙江齐齐哈尔高二月考]下列关于如图所示黏性末端的说法,错误的是(

)A.DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键B.甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的C.切割甲的限制酶也能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子D.甲、乙黏性末端可形成重组DNA分子C123456789101112131415解析

DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键,A项正确;切割甲的限制酶的识别序列是5'-GAATTC-3',切割乙的限制酶的识别序列是5'-CAATTG-3',所以甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成,B项正确;甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列是5'-CAATTC-3',而甲酶的识别序列是5'-GAATTC-3',且在G和A之间切割,所以切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子,C项错误;甲和乙的黏性末端相同,都是AATT-3',可以被DNA连接酶连接形成重组DNA分子,D项正确。12345678910111213141510.下表关于DNA粗提取与鉴定实验的表述,不正确的是(

)选项试剂操作作用A研磨液与生物材料混合提取溶解DNAB2mol/LNaCl溶液与提取出的DNA混合溶解DNAC冷却的酒精加入离心后的上清液中溶解DNAD二苯胺试剂加入溶解有DNA的NaCl溶液中鉴定DNAC解析

DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精,利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离,C项错误。12345678910111213141511.图1和图2分别表示限制酶EcoRⅠ和Sma

Ⅰ

的作用示意图。请回答下列问题。

123456789101112131415(1)EcoRⅠ和SmaⅠ的化学本质是

,其单体是

。

(2)EcoRⅠ识别的碱基序列是

,EcoRⅠ和SmaⅠ的识别序列不相同,说明限制酶具有

性。

(3)由图2可知,当限制酶在它识别序列的

切开时,产生的末端是平末端;要将图1中的末端再连接起来,需要用________________________

酶。

(4)1970年,阿尔伯等在细菌中发现了第一个限制酶,而在该细菌中没有此限制酶的识别序列,推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是

。

蛋白质氨基酸5'-GAATTC-3'专一中轴线E.coliDNA连接酶或T4DNA连接

切割外来DNA,起到防御作用123456789101112131415解析

(1)EcoRⅠ和SmaⅠ的化学本质是蛋白质,蛋白质是生物大分子,其单体是氨基酸。(2)分析图1和图2可知,EcoR

Ⅰ识别的碱基序列是5'-GAATTC-3',SmaⅠ的识别序列是5'-CCCGGG-3',EcoRⅠ和SmaⅠ的识别序列不相同,说明限制酶具有专一性。(3)由图2可知,当限制酶在它识别序列的中轴线切开时,产生的末端是平末端;DNA连接酶可以连接两个DNA片段,要将图1中的末端再连接起来,需要用E.coliDNA连接酶或T4

DNA连接酶。(4)1970年,阿尔伯等在细菌中发现了第一个限制酶,而在该细菌中没有此限制酶的识别序列,推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是切割外来DNA,起到防御作用。123456789101112131415B级能力素养提升练12.[江西抚州高二联考]在基因工程操作中限制性内切核酸酶是不可缺少的工具。下列关于限制性内切核酸酶的叙述,错误的是(

)A.不同限制酶切割后,只能产生相同的黏性末端B.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取C.限制性内切核酸酶的活性受温度和pH等因素的影响D.一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列A123456789101112131415解析

酶具有专一性,不同的限制酶可以识别不同的脱氧核苷酸序列,产生的黏性末端通常不同,A项错误;限制性内切核酸酶主要从某些原核生物中提取,B项正确;限制性内切核酸酶具有酶的特性,其活性受温度和pH等因素的影响,C项正确;限制性内切核酸酶具有专一性,一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列,并在特定位点切割,D项正确。12345678910111213141513.[黑龙江齐齐哈尔高二期中]基因工程需要特定的工具,下列叙述正确的是(

)A.基因工程所需载体有质粒、细菌拟核等,至少要有一个限制酶识别位点B.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列C.限制酶、DNA连接酶和解旋酶作用的化学键都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键D.限制酶有数千种,而DNA连接酶只有两种B123456789101112131415解析

基因工程所需载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等,载体需有一个或多个限制酶识别位点,以便连接不同的目的基因,细菌拟核DNA不能作为载体,A项错误;限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列,并在特定位点实现切割,因此限制酶具有专一性,B项正确;限制酶、DNA连接酶作用的化学键相同,都是DNA一条链中相邻两个核苷酸之间的磷酸二酯键,而解旋酶的作用部位是氢键,C项错误;迄今为止,已从300多种不同的微生物中提取了4

000多种限制酶,而DNA连接酶根据来源不同,主要分为两类,即E.coli

DNA连接酶和T4

DNA连接酶,但DNA连接酶并非只有两种,D项错误。12345678910111213141514.[多选][黑龙江哈尔滨高二期中]下列有关限制性内切核酸酶的叙述,错误的是(

)A.用限制酶切割一个DNA分子中部,获得一个目的基因时,被水解的磷酸二酯键有2个B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大C.5'-CATG↓-3'和5'-G↓GATCC-3'序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接