2027届新高考生物精准冲刺复习基因工程常考点

2027届新高考生物精准冲刺复习基因工程常考点1.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸PCR技术中的引物：必须一对2种引物（上游+下游），缺一不可，成对协同起作用原因：分别结合两条模板链，双向延伸才能扩增目的基因一、关于引物PCR引物设计原则长度适宜：18~30bp，过短特异性差，过长扩增效率低GC含量适中：40%~60%，GC越高退火温度越高、结合越稳定自身不互补：不形成发夹结构，无法自我配对折叠引物互不补：上下游引物不配对，不形成引物二聚体目的基因①②③④5'端可修饰，3'端不能修饰5'端：加限制酶位点、荧光标记、启动子，不影响延伸3'端：是延伸起点，修饰后Taq酶无法结合、扩增失败设计PCR引物时，应在引物的

(填“3'”或“5'”)端添加限制酶的识别序列。5'子链合成：引物5'→3'延伸模板读取：模板3'→5'3`5`5`3`3`5`3`5`(特殊引物)在适宜条件的4个PCR反应体系中，均加入4种脱氧核苷酸（其中dATP的碱基被荧光标记），向①~④反应体系中，分别加入如表1所示的适量单链DNA（两条单链DNA特定区域碱基互补配对，相当于连接上引物，见配对参考）。已知本实验的温度条件下不能产生小于6个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应体系是（）A.①② B.①④ C.③④ D.②③反应体系①②③④单链DNA5'-TTATTAAT-3'5'-GAATTCTT-3'5'-CCATCGAT-3'5'-CTCTGCAG-3'配对参考5'-TTATTAAT-3'3'-TAATTATT-5'5'-GAATTCTT-3'3'-TTCTTAAG-5'5'-CCATCGAT-3'3'-TAGCTACC-5'5'-CTCTGCAG-3'3'-GACGTCTC-5'5'-TTATTAAT-3'3'-TAATTATT-5'5'-GAATTCTT-3'3'-TTCTTAAG-5'B高考真题(2024·山东卷，5)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA，已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(

)DA.①② B.②③ C.①④ D.③④二、限制酶的选择宜限制酶在目的基因上游和下游各切一次（产生两个切口），才能将它从供体DNA上完整释放出来。选用相同的酶或同尾酶切割载体和目的基因，使目的基因和质粒切割后产生相同的黏性末端或平末端保证切割位点位于载体的启动子和终止子之间（若载体为Ti质粒，还需考虑切点位于T-DNA中）不宜①不宜破坏目的基因②不宜破坏载体的必要元件（启动子、终止子、标记基因等）③不宜使用单酶切：防止目的基因、质粒的自身环化；避免目的基因与载体反向连接使用双酶切发也还需注意拼接后目的基因是否正接（看转录方向)；反义基因/RNA要反接三、启动子作用：RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动转录(1)组成型启动子特点:持续、高效、无组织特异性，几乎在所有细胞/组织中恒定表达。功能:驱动管家基因(维持细胞基本生命活动)，如呼吸酶、核糖体蛋白基因。(2)组织特异性启动子特点：仅在特定组织/细胞中激活，具时空特异性。功能：精准调控基因在目标部位表达，避免资源浪费。例子：乳腺特异性启动子/乳腺蛋白基因的启动子（乳腺生物反应器）(3)诱导型启动子特点：平时低表达/不表达，需特定外界信号（诱导剂）才激活转录，像“可控开关”。功能：时空可控表达，减少持续表达的代谢负担。例子：乳糖操纵子lac启动子、热休克启动子、光诱导启动子。四、关于目的基因的检测1.利用酶切+电泳的方法，检测基因表达载体是否构建成功提取待测质粒用构建时相同的限制酶进行酶切酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳观察电泳条带数量、条带大小若使用单酶切法，构建成功的表达载体电泳时会有_______个条带。若使用双酶切法，构建成功的表达载体电泳时会有_______个条带。12补充：单酶切法电泳时需要与酶切后的空载体片段对照双酶切法电泳时需要与酶切后的空载体片段、酶切后的目的基因片段对照（2）在将重组载体导人大肠杆菌之前，需要用

处理大肠杆菌。科研人员从培养得到的菌株中提取质粒，用图中Hind皿和NdeI双酶切后进行电泳，结果如图3所示，1号为没有导人质粒的大肠杆菌，2~5号待测菌株。结合图1、2、3分析，2~5号的待测菌株成功中导人了重组载体的有

Ca2+3号和4号四、关于目的基因的检测2.利用标记基因检测目的基因是否导入受体细胞(1)一种标记基因（最常用：抗生素抗性基因）原理：载体自带1种抗性标记（如氨苄青霉素抗性、四环素抗性）筛选逻辑：培养基加对应抗生素存活：细胞导入质粒（含标记基因）→大概率含目的基因死亡：未导入质粒缺点：无法区分空质粒和重组质粒，只能筛出导入质粒的细胞含重组质粒的细菌导入含质粒的细菌不含质粒的细菌（包括未导入的和只导入目的基因的）含氨苄青霉素抗性基因含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因不含抗性基因（2）双标记基因影印接种若载体为Ti质粒，选择保留的标记基因必须位于T-DNA内部四、关于目的基因的检测3.利用PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞（1）提取受体细胞(扣题回答）基因组DNA（若利用的是农杆菌转化法，则为提取受体细胞的染色体DNA）（2）加入目的基因特异性引物（题目若有具体引物，扣题回答）进行PCR扩增（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（4）若出现目的基因大小(与加入纯目的基因作模板的对照组对比)的条带，证明目的基因已导入受体细胞。还可设置空白对照组模板：不加任何DNA模板（加无菌水）结果：无条带→排除试剂、环境杂菌DNA污染拓展：融合基因（目的基因+荧光蛋白基因）1.目的：将目的基因与荧光蛋白基因融合，便于利用荧光蛋白的荧光特性，直观检测目的基因是否表达，同时定位目的蛋白在细胞中的分布，直观观察表达部位与表达量注意：融合后没有单独的两个基因(即表达的主语要用融合基因)2.融合基因连接前对第一个基因要进行改造，去除其终止密码子对应的碱基；目的：防止翻译在第一个蛋白合成后提前终止PCR的应用+基因编辑自主复习--一轮书P341-343cDNA：由mRNA逆转录而来，不含启动子、终止子和内含子编码区非编码区非编码区mRNA基因的一条链ＡＢＣ（1）原核生物基因（2）真核生物基因成熟mRNA对应基因的一条链编码区非编码区非编码区ＡＢＣ【补充】基因的结构DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遗传效应的DNA片段非编码区非编码区编码区（1）原核生物基因编码区上游编码区下游RNA聚合酶的识别和结合位点，开始转录终止转录能转录出mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质。启动子终止子不转录、不翻译不转录、不翻译转录mRNA加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345非编码区非编码区编码区外显子内含子12345终止子启动子（2）真核生物基因转录新课程P109（例题分析1）苯乳酸（PLA）是一种天然防腐剂，能有效抑制食源性致病菌，在食品工业中具有广阔的应用前景。乳酸脱氢酶（LDH）是催化PLA合成的一种关键酶，透明颤菌血红蛋白（VHb）是由透明颤菌诱导合成的一种可溶性血红素蛋白，能提高细胞对氧的利用率。科研人员将LDH基因与VHb基因融合，构建LDH-VH6融合基因（图1），并将其与质粒载体（图2）连接，构建重组表达载体，然后导人大肠杆菌中以高效生产PLA。回答下列问题：（1）用PCR技术扩增LDH-VH6融合基因时，可选择的两种引物是

，并在两种引物的

（填“3”或“5’"）端分别连接图中两种限制酶识别序列。引物2和引物35'（2）在将重组载体导人大肠杆菌之前，需要用

处理大肠杆菌。科研人员从培养得到的菌株中提取质粒，用图中Hind皿和NdeI双酶切后进行电泳，结果如图3所示，1号为没有导人质粒的大肠杆菌，2~5号待测菌株。结合图1、2、3分析，2~5号的待测菌株成功中导人了重组载体的有

Ca2+3号和4号(3)科研人员进一步测定大肠杆菌及PLA的相对含量（图4）。根据图4推测VHb基因表达产物的作用是

，其机理可能是

VHb能提高细胞对氧的利用率，增强细胞呼吸，为细胞的增殖和PLA的合成提供更多的能量促进大肠杆菌的生长和PLA的合成VHb作用生物量↑PLA量↑抄题目信息VHb能提高细胞对氧的利用率增强细胞呼吸，提供更多的能量（4）PLA作为天然防腐剂，可替代化学防腐剂，具有重要的应用价值。若通过发酵工程来生产PLA，除了需要解决菌株的因素，还应考虑哪些因素？

（答出1点）。发酵条件的优化（如温度、PH、溶氧量、营养成分配比等），PLA的提取与纯化工艺，原料成本与生产效率，废液处理与环保问题等（答出1点，合理即可，2分）（例题分析2）香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题：注：pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、50bp，bp表示碱基对。（1）图1过程①需要在

酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含

（答出2点）逆转录内含子、启动子和终止子等（2）为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的______（3'或5'）端添加限制酶的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶

、

的识别序列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是

个。5'XhoⅠBamHⅠ2n-2（3）图1的④过程，通常先用

将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是

。受体菌应筛选出_________（填“具有”或“不具有”）氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。Ca2+处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态具有注：pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、50bp，bp表示碱基对。（4）为了检测目的基因是否插入到pET32a质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图2。样品____最可能是插入了目的基因的重组质粒。2（例题分析3）为研究生长激素(GH)基因(603bp，起始密码子AUG，终止密码子UAG)在斑马鱼早期胚胎发育阶段的表达，研究人员以GH基因为外源基因，以增强型荧光蛋白(EGFP)基因(720bp，起始密码子AUG，终止密码子UAA)为报告基因，构建了含两个基因(GH-EGFP)的融合表达载体。操作基本流程、融合表达载体、相关基因、引物和限制酶，如下图所示。(1)载体中复制原点的作用是保证表达载体具有

的能力。将表达载体导入到斑马鱼受精卵中的方法是

。(2)在构建含有EGFP基因重组质粒时使用的限制酶是

自我复制显微注射法Clal和Xhol(3)补充引物序列:引物3为5'

ATGGCT3’;引物4为5'CCATGGCAACCAC

3’。(