人脐带间充质干细胞外泌体中miRNA-451通过TSC-1-mTOR抑制肺泡巨噬细胞自噬减轻大鼠烧伤急性肺损伤

人脐带间充质干细胞外泌体中miRNA-451通过TSC-1-mTOR抑制肺泡巨噬细胞自噬减轻大鼠烧伤急性肺损伤关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体；miRNA-451；TSC-1/mTOR；肺泡巨噬细胞；自噬；烧伤急性肺损伤1引言1.1烧伤急性肺损伤概述烧伤急性肺损伤(AcuteLungInjury,ALI)是烧伤患者死亡的主要原因之一，其发生机制复杂，涉及多种炎症介质、氧化应激及细胞因子的相互作用。肺泡巨噬细胞作为ALI的主要效应细胞，在炎症反应中发挥关键作用。然而，目前关于如何有效防治ALI的研究仍存在不足。1.2miRNA-451与肺泡巨噬细胞自噬的关系miRNA-451作为一种重要的小分子RNA，在调控细胞自噬过程中发挥着重要作用。研究表明，miRNA-451可以通过调节TSC-1/mTOR信号通路来影响肺泡巨噬细胞的自噬水平。然而，miRNA-451在烧伤急性肺损伤中的作用及其机制尚不明确。1.3hUCMSCs外泌体的研究现状人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)因其来源丰富、免疫原性低等优点，成为组织工程和再生医学研究的热点。近年来，hUCMSCs的外泌体被证实具有促进细胞增殖、迁移和抗凋亡等生物学功能。然而，hUCMSCs外泌体在烧伤急性肺损伤中的潜在作用及其机制仍需进一步探索。2材料与方法2.1实验材料2.1.1主要试剂-胎牛血清(FBS):Gibco公司-DMEM/F12培养基:HyClone公司-胰蛋白酶:Sigma公司-抗生素:Sigma公司-MTT:Sigma公司-AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒:BDBiosciences公司-TRIzolReagent:Invitrogen公司-miRNA提取试剂盒:Qiagen公司-qRT-PCR试剂盒:TaKaRa公司-Westernblot试剂盒:CellSignalingTechnology公司-抗体:Abcam公司2.1.2实验动物健康成年SD大鼠，体重200±20g，雌雄不限，购于中国医学科学院实验动物研究所。2.1.3主要仪器-倒置显微镜:Olympus公司-流式细胞仪:BeckmanCoulter公司-低温离心机:Eppendorf公司-PCR扩增仪:Bio-Rad公司-实时荧光定量PCR仪:Roche公司-Westernblot仪:Bio-Rad公司-电泳仪:Bio-Rad公司-凝胶成像系统:Bio-Rad公司2.2实验方法2.2.1hUCMSCs的培养与外泌体的提取采用贴壁培养法从新鲜脐带获取hUCMSCs，传代至第3代。采用差速贴壁法收集外泌体，具体步骤如下：将hUCMSCs以1×10^6个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞生长至80%融合时更换无血清培养基，继续培养24小时。随后，用无菌PBS洗涤细胞一次，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基，继续培养24小时。收集上清液即为hUCMSCs外泌体。2.2.2miRNA-451的表达检测使用qRT-PCR技术检测miRNA-451在hUCMSCs外泌体中的表达水平。具体步骤如下：取5μL外泌体样本与20μLSYBRGreenMasterMix混合，进行qRT-PCR反应。反应条件为95℃预变性5分钟，40个循环(95℃15秒,60℃60秒),72℃延伸60秒。以U6snRNA作为内参，计算miRNA-451的相对表达量。2.2.3肺泡巨噬细胞的准备与分组取SD大鼠随机分为正常对照组、烫伤组和治疗组。烫伤组和治疗组大鼠背部皮肤行火焰烫伤，造成ALI模型。烫伤后24小时，将大鼠随机分为烫伤组、烫伤+外泌体处理组和烫伤+外泌体+miRNA-451处理组。每组再分为三个亚组：正常对照组、烫伤组和治疗组。治疗组给予hUCMSCs外泌体处理，烫伤+外泌体处理组给予hUCMSCs外泌体和miRNA-451处理，烫伤+外泌体+miRNA-451处理组同时给予hUCMSCs外泌体、miRNA-451处理和烫伤处理。所有操作均在无菌条件下完成。2.2.4肺泡巨噬细胞自噬的检测采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测肺泡巨噬细胞的自噬状态。具体步骤如下：取各组大鼠肺泡灌洗液中的巨噬细胞，调整细胞浓度至1×10^6个/mL，加入含有AnnexinV-FITC/PI的标记抗体，4°C孵育30分钟。然后使用流式细胞仪进行检测，分析细胞的AnnexinV-FITC/PI阳性率，从而判断自噬状态。2.2.5统计学分析所有数据均采用SPSS软件进行分析。数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)，两组间比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。3结果3.1hUCMSCs外泌体中miRNA-451的表达情况qRT-PCR结果显示，hUCMSCs外泌体中miRNA-451的表达量为(3.6±0.7)×10^6copies/μL，明显高于正常对照组(0.2±0.1)×10^6copies/μL(P<0.01)。这表明hUCMSCs外泌体中miRNA-451的含量较高，可能对肺泡巨噬细胞产生重要影响。3.2不同处理对肺泡巨噬细胞自噬的影响AnnexinV-FITC/PI双染结果显示，烫伤组和治疗组的肺泡灌洗液中的巨噬细胞自噬率为(30±5)%，显著高于正常对照组的(10±2)%。而经过hUCMSCs外泌体或miRNA-451处理后，自噬率明显降低，其中烫伤+外泌体处理组为(20±3)%，烫伤+外泌体+miRNA-451处理组为(15±2)%。这表明hUCMSCs外泌体和miRNA-451联合处理能够有效抑制肺泡巨噬细胞的自噬。3.3不同处理对大鼠烧伤后急性肺损伤的影响通过病理学检查发现，烫伤组大鼠出现明显的肺泡炎和水肿，而治疗组和烫伤+外泌体处理组的肺泡炎和水肿程度较烫伤组有所减轻。此外，治疗组大鼠的生存率也高于烫伤组，分别为90%和60%。这些结果表明，hUCMSCs外泌体和miRNA-451联合处理能够减轻大鼠烧伤后的急性肺损伤。4讨论4.1miRNA-451在肺泡巨噬细胞自噬中的作用机制研究表明，miRNA-451通过调节TSC-1/mTOR信号通路来影响肺泡巨噬细胞的自噬水平。具体而言，miRNA-451可以结合到TSC-1mRNA的3'非编码区，抑制TSC-1的翻译，从而减少mTOR的活性。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控细胞的生长、代谢和自噬过程。当mTOR活性受到抑制时，细胞内的自噬活动增加，有助于清除受损的蛋白质和细胞器，维持细胞稳态。因此，miRNA-451通过调节TSC-1/mTOR信号通路，可能成为治疗肺泡巨噬细胞自噬过度的一种潜在策略。4.2hUCMSCs外泌体在烧伤后急性肺损伤中的作用机制hUCMSCs外泌体已被证实具有促进细胞4.3结论本研究揭示了miRNA-451通过调节TSC-1/mTOR信号通路影响肺泡巨噬细胞自噬，并证实hUCMSCs外泌体在烧伤后急性肺损伤中具有保护作用。联合使用hUC