CN115135339B 一种从完整的aav衣壳中分离或去除空的aav衣壳的方法 （赛多利斯比亚分离有限责任公司）

2022.08.22PCT/EP2021/0543372021.02.22WO2021/165537EN2021.08.26WO2004113494A2,2004.12.29一种从完整的AAV衣壳中分离或去除空的一种用于在包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物中，从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方法，其中该混合物在第一碱性环境中与带有伯胺基的固相表面接触，由此(i)完过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环2结合的空的AAV衣壳通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分地洗脱，其中所述第二碱性环境的pH值在pH8.0至pH3.如权利要求1所述的方法，其中在用所述第二碱5.如权利要求1所述的方法，其中所述第二碱性环境的pH值在pH8.1至pH8.9的范围6.如权利要求1所述的方法，其中所述第二碱性环境的pH值在pH8.2至pH8.8的范围7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二碱性环境的pH值在pH8.3至pH8.7的范围8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二碱性环境的pH值在pH8.4至pH8.6的范围10.如权利要求3所述的方法，其中所述第三碱性环境的pH值在pH8.5至10.0的范围浓度对应于1mM至1,000mM的碱金浓度对应于2.5mM至250mM的碱金16.如权利要求1_4任一项所述的方法，其中所述碱性环境包含浓度范围为1.0mM至17.如权利要求1_4任一项所述的方法，其中所述碱性环境包含浓度范围为1.5mM至318.如权利要求1_4任一项所述的方法，其中所述碱性环境包含浓度范围为2.0mM至20.如权利要求19所述的方法，其中所述完整的和空的AAV衣壳具有选自下组的血清4[0001]本发明涉及一种使用固相萃取从完整的AAV衣壳中分离或去除空的AAV衣壳的方[0002]重组腺相关病毒(AAV)的制剂通常由两个衣壳亚群组成。所需的衣壳适当地填充其预期的DNA负载的衣壳。这些被称为空的衣壳。一些制剂可能含有90％或更多的空的衣[0003]用于从完整的AAV衣壳中分离空的AAV衣壳的色谱方法是已知的[1_3]。使用强阴已知有达到基线分辨率的情况，意味着对应于空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的峰完全分随着完整的AAV衣壳的恢复和/或空的AAV衣壳被消除的[0006]第三个限制与在强阴离子交换剂上进行空_完整分离的极端化学条件有关。所需5[0008]衍生性较低的氨基色谱配体的例子以诸如DEAE(二乙氨基乙基)等名称广为人度洗脱阳离子交换剂能够在空的和完整的AAV衣壳之间实现一定程度的分离，但其分离程胺基修饰的固相来实现。本发明的方法能够克服与去除空的AAV衣壳的已知方法相关的几可添加到Tris缓冲液或双三丙烷(Bis_Tris_propane)缓冲液或其他缓冲液中以实现洗脱[0014]在另一个方面，本发明涉及一种用于在包含空的和完整的AAV衣壳的水性混合物或6[0016](ii)完整的和空的AAV衣壳都与固相表面结合，随后通过pH值高于第一碱性环境的pH值的第二碱性环境至少部分地洗脱空的AAV衣壳，条件是第二个碱性环境不会从固相[0018]在本发明的另一个实施方案中，第二碱性环境的pH值可以大于第一环境的pH[0025]本发明的一个有利方面是这样一个事实，即完整的和空的AAV衣壳可以是任意血7[0031]图1显示通过季氨基固相与伯胺基固相的盐洗脱，分离空的AAV衣壳与完整的AAV[0033]图3显示在空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳都结合的条件下，伯胺柱的平衡和加载[0035]图5至图10显示一系列实验的结果。将包含空的和完整的AAV8衣壳的样品应用于[0037]图12：通过比较色谱图说明了存在镁离子或缺失镁离子对空的和完整的AAV衣壳伯胺基配体描述的是一个氮原子通过单个共价键与两个氢原子中的中的每一个氢原子连过将配体的碳原子共价连接到与固相共价连接的所谓间隔臂(spacerarm)而间接连接到8/solutions/process_media_products/by_mode/ion_ex_味着它是一种通过重复伯胺亚基以共价键方式固定在固相上的聚合物。另一个例子以shop/ww/en/usd/sartobind_stic_pa/c/M_Sartobind_STIC_PA]。营销材料表明伯胺配体[0043]任何给定样品中的完整的和空的AAV衣壳可属于任意血清型，包括天然和重组血9通过伯胺的共价固定化而呈现正电性。生物产品吸附到用于色谱法的固相上最常被称为的改变可以分步进行。条件的改变也可以连续的方式进行，导致弱结合的物质在连续体壳。如上所述，完整的AAV衣壳可以通过在不存在或过量盐的情况下进一步增加pH值来洗它也可用于制备应用，但要意识到这种方法可能会将完整的AAV衣壳暴露于可能对衣壳稳色谱装置然后用线性氯化钠梯度，从20mMHepes、pH7.5±0.2的平衡缓冲液，到20mM与伯胺基固相结合。空的和完整的AAV衣壳之间的分离程度将优于在较低固定pH值下的盐[0058]在以另一种方式用pH和盐洗脱完整的AAV衣壳的实施方案中，将色谱装置形式的过将缓冲液交换为20mM双三丙烷,pH8免可能危及衣壳稳定性的更高pH值，可将盐添加到平衡缓冲液中，例如2mMNaCl、或5mM壳的结合的最低的盐浓度通常是最有利的。如果希望评估使用更高浓度来置换空的AAV衣[0062]许多使样品平衡至加载样品到色谱柱上的条件的方法是本领域技术人员已知至支持完整的衣壳最高容量结合的pH和/或盐浓度，而可将柱平衡至在完整的衣壳洗脱步[0069]任何上述实施方案可以在二价金属阳离子如镁和/或钙的存在下进行，其中任一有利的，因为金属离子有助于保持空的AAV衣壳的完整性并倾向于导致空的衣壳作为单峰洗脱。这使得测量给定样本中的空的AAV衣壳的总量以及空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳的[0071]在一些实施方案中，诸如镁和/或钙的二价金属阳离子的存在对于制备分离可能少分离效率或降低完整的衣壳回收率的非特异性相互作用，和/或在分离过程中简单地降[0074]在一些实施方案中，精氨酸或组氨酸可以直接取代NaCl或其他盐来进行梯度分[0076]在另一个实施方案中，精氨酸或组氨酸可以在基线水平跨[0077]任何上述实施方案可以在低分子量两性离子例如甘氨酸或丙氨酸或甜菜碱的存[0079]在操作pH为8.5或更低的一个实施方案中，甘[0080]在一个实施方案中，当pH小于10时，甜菜碱的浓度可高达2M或更高，或0.5M至[0081]任何上述实施方案都可以在糖存在的情况下进行，例如旨在稳定完整衣壳的[0084]本领域的技术人员将认识到，本发明的方法可以在除了伯胺基之外的配体上实[0088]通过季氨基固相与伯胺基固相的盐洗脱比较空的AAV衣壳与完整的AAV衣壳的分阳离子交换纯化的AAV8样品施加到柱上并用平衡缓冲液洗涤。然后用50床体积的线性梯方法。两种色谱柱都无法完全分离空的和完整的AAV衣壳，但伯胺固相获得了更好的结果[0091]通过升高pH洗脱的伯胺基固相分离空/完整的衣壳与使用盐梯度的强(季胺基)阴和完整的AAV衣壳的分离与用盐梯度洗脱的强阴离子交换(季胺)整体柱进行比较。用20mM[0097]在空的AAV衣壳不结合的条件下进行平衡，然后通过一个步骤洗脱完整的AAV衣换纯化的AAV8样品施加到柱子上并用平衡缓冲液洗涤(与用于实施例2和3的样品相同)。[0109]图11：该图说明了在不同pH值下洗涤步骤后梯度洗脱的完整的和空的AAV衣壳的相对量。阴影垂直条表示支持最有效地消除空的AAV衣壳和最佳回收完整的衣壳的洗涤pH优先权US201562266357P,WO2M.Bahshaveshi,X.Lu,S.Berge