鼠伤寒沙门氏菌H因子结合蛋白：筛选、特性与功能的深度剖析

鼠伤寒沙门氏菌H因子结合蛋白：筛选、特性与功能的深度剖析一、引言1.1研究背景鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaTyphimurium）作为一种常见的人兽共患病原菌，在全球范围内广泛分布，对人类和动物的健康构成了严重威胁。该菌宿主范围极为广泛，涵盖了包括人类在内的多种哺乳动物，是重要的食源性致病菌。据世界卫生组织（WHO）统计，每年全球约有9400万人感染沙门氏菌，其中鼠伤寒沙门氏菌是引发感染的主要血清型之一，导致大量的食物中毒和肠道感染病例，严重影响公共卫生安全。在人类中，鼠伤寒沙门氏菌感染通常会引发一系列临床症状，从轻微的胃肠炎到严重的败血症等。胃肠炎型是最为常见的感染类型，患者主要表现为发热、恶心、呕吐、腹泻、腹痛等症状，腹泻次数可达一日数次至十余次，多为水样便，少数带有粘液或血，体温一般在38-40℃，通常在发病2-4天体温下降，多数病人在2-3天后胃肠炎症状消失。然而，对于幼儿、老年人以及免疫功能低下的人群，感染可能会进一步发展为败血症型，出现稽留高热、中毒症状重，甚至可导致多器官功能障碍以及中毒性脑病等严重后果，病死率较高。例如，在一些医院感染事件中，鼠伤寒沙门氏菌感染的新生儿由于免疫系统尚未发育完全，容易引发严重的全身性感染，给治疗带来极大挑战。在动物养殖领域，鼠伤寒沙门氏菌同样危害巨大。在家禽养殖中，感染鼠伤寒沙门氏菌的鸡群可能出现生长迟缓、产蛋量下降等问题，严重影响养殖经济效益。同时，被污染的禽肉和禽蛋作为人类的食物来源，又增加了人类感染的风险。在养猪业中，鼠伤寒沙门氏菌可导致仔猪腹泻、死亡，给养猪业带来重大损失。此外，鼠伤寒沙门氏菌还可以在动物群体中传播，造成疫病的流行，对畜牧业的可持续发展构成威胁。鼠伤寒沙门氏菌能够在多种环境中生存和繁殖，包括土壤、水源、饲料等，其传播途径广泛，主要通过摄入被污染的食物或水进入宿主。该菌具有较强的适应能力，能够抵抗胃酸和消化酶的作用，在胃肠道中定殖并进一步侵染小肠上皮细胞。其复杂的侵染机制涉及多个环节，包括粘附、入侵、细胞内复制以及通过细胞间扩散和系统传播等。例如，鼠伤寒沙门氏菌表面的鞭毛、菌毛等粘附素能够与宿主细胞受体结合，帮助细菌紧密粘附在肠上皮细胞表面，随后通过触发宿主细胞的信号转导通路，诱导细胞骨架重排和细胞膜内陷，形成吞噬泡，从而实现入侵。进入细胞后，鼠伤寒沙门氏菌能够抵抗吞噬泡内的酸性环境和抗菌物质的攻击，并在其中复制增殖，部分细菌还能通过逃逸机制进入细胞质，利用宿主细胞的营养和能量进行复制，并传播到相邻的细胞中。随着抗生素的广泛使用，鼠伤寒沙门氏菌的耐药性问题日益严重。研究表明，鼠伤寒沙门氏菌对多种抗生素呈现出不同程度的耐药性，耐药率不断上升。耐药基因的传播以及耐药机制的多样化使得鼠伤寒沙门氏菌感染的治疗面临巨大挑战，传统的抗生素治疗效果逐渐降低，给临床治疗带来了极大的困难。例如，在河南省的一项研究中，发现临床分离的鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类药物的耐药率高达86.2%，对β-内酰胺类药物和四环素类药物的耐药率分别为75.9%和62.1%，且耐药性与多种耐药基因的存在密切相关，包括新发现的耐药基因rmtB和tet(A)。面对鼠伤寒沙门氏菌带来的严峻挑战，深入了解其致病机制和免疫逃逸机制，寻找新的治疗靶点和防控策略迫在眉睫。H因子结合蛋白（Hfactorbindingproteins，FHBPs）作为鼠伤寒沙门氏菌与宿主免疫系统相互作用过程中的关键蛋白，在细菌的抗补体杀伤途径中发挥着重要作用，对其进行深入研究具有重要的理论意义和实际应用价值。补体系统是宿主免疫系统的重要组成部分，能够通过多种途径识别和清除病原体。然而，鼠伤寒沙门氏菌可以通过结合H因子，干扰补体系统的正常功能，从而逃避宿主的免疫清除。因此，筛选和研究鼠伤寒沙门氏菌的H因子结合蛋白，有助于揭示其免疫逃逸机制，为开发新型的抗菌药物和疫苗提供理论依据，对于有效防控鼠伤寒沙门氏菌感染具有重要的现实意义。1.2研究目的与意义本研究旨在筛选出鼠伤寒沙门氏菌的H因子结合蛋白，并对其生物学功能进行初步探究，为深入理解鼠伤寒沙门氏菌的致病机制和免疫逃逸机制提供理论依据，具体研究目的如下：筛选鼠伤寒沙门氏菌的H因子结合蛋白：利用蛋白质组学技术和分子生物学方法，从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出能够与H因子特异性结合的蛋白，为后续研究奠定基础。鉴定H因子结合蛋白的特性：对筛选出的H因子结合蛋白进行理化性质分析、结构解析以及结合特性研究，明确其与H因子结合的亲和力、特异性等关键参数。探究H因子结合蛋白的生物学功能：通过构建基因缺失株、细胞感染实验以及动物模型实验，研究H因子结合蛋白在鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤、细胞粘附与入侵、毒力等方面的生物学功能，揭示其在细菌致病过程中的作用机制。鼠伤寒沙门氏菌作为重要的食源性致病菌，对人类和动物健康构成严重威胁。深入研究其致病机制和免疫逃逸机制，寻找新的治疗靶点和防控策略具有重要的现实意义。本研究聚焦于H因子结合蛋白，具有以下重要意义：理论意义：H因子结合蛋白在鼠伤寒沙门氏菌的免疫逃逸过程中发挥着关键作用，深入研究其生物学功能有助于揭示细菌与宿主免疫系统相互作用的分子机制，丰富对鼠伤寒沙门氏菌致病机理的认识，为相关领域的理论研究提供新的思路和方向。实际应用价值：本研究筛选出的H因子结合蛋白有望成为新型抗菌药物和疫苗的潜在靶点。针对这些靶点开发的药物或疫苗，能够更有效地抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长和感染，提高治疗效果，降低发病率和死亡率，为食品安全和公共卫生提供有力保障。此外，对H因子结合蛋白的研究还可以为临床诊断提供新的标志物，有助于实现鼠伤寒沙门氏菌感染的早期诊断和精准治疗，从而提高患者的治愈率和生活质量。1.3研究现状在鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究中，H因子结合蛋白（FHBPs）逐渐成为焦点。补体系统作为宿主免疫防御的重要组成部分，能通过经典途径、旁路途径和凝集素途径识别并清除病原体。然而，鼠伤寒沙门氏菌可通过结合H因子干扰补体系统的正常功能，实现免疫逃逸。H因子是补体旁路途径的重要调节蛋白，它能与C3b结合，抑制C3转化酶的形成与活性，从而调控补体激活的强度和范围。鼠伤寒沙门氏菌通过表面的FHBPs与H因子特异性结合，将H因子招募至菌体表面，使补体系统对细菌的杀伤作用减弱，进而帮助细菌在宿主体内生存和繁殖。在FHBPs的筛选鉴定方面，已有研究运用多种技术展开探索。双向电泳（2-DE）结合免疫印迹技术能够分离和鉴定细菌蛋白质，并通过与标记的H因子进行免疫反应，识别出潜在的FHBPs。表面等离子共振（SPR）技术则可实时监测蛋白质与H因子之间的相互作用，精确测定结合亲和力和动力学参数，为FHBPs的筛选提供了有力支持。噬菌体展示技术通过构建噬菌体展示文库，将细菌蛋白或多肽展示在噬菌体表面，然后利用H因子进行亲和筛选，可高效筛选出与H因子特异性结合的FHBPs。在已报道的鼠伤寒沙门氏菌FHBPs中，外膜蛋白A（OmpA）是研究较多的一种。OmpA存在于鼠伤寒沙门氏菌的外膜上，具有多个功能结构域，其结构特点使其能够与H因子的特定区域相互作用。研究表明，OmpA与H因子结合后，可显著增强鼠伤寒沙门氏菌对补体杀伤的抵抗能力，促进细菌在血清中的存活。通过构建ompA基因缺失株，发现缺失株在正常血清中的存活率明显降低，这进一步证实了OmpA在抗补体杀伤过程中的关键作用。同时，OmpA还参与了鼠伤寒沙门氏菌对宿主细胞的粘附和入侵过程，其与宿主细胞表面的受体结合，介导细菌进入细胞内，为细菌在宿主细胞内的生存和繁殖创造条件。另一种FHBPs，磷酸甘油酸激酶（PGK）也备受关注。PGK是参与糖酵解途径的关键酶，除了在能量代谢方面发挥作用外，还在鼠伤寒沙门氏菌与宿主的相互作用中扮演重要角色。PGK的结构和活性位点使其能够与H因子结合，干扰补体系统的正常功能。在细胞感染实验中，过表达PGK的菌株对宿主细胞的粘附和入侵能力增强，而敲除PGK基因则导致菌株的粘附和入侵能力显著下降。这表明PGK不仅参与了抗补体杀伤过程，还在细菌的致病过程中发挥着重要作用，可能通过调节细菌的代谢和与宿主细胞的相互作用，影响细菌的毒力。虽然目前对鼠伤寒沙门氏菌FHBPs的研究取得了一定进展，但仍存在诸多不足。在筛选技术方面，现有方法存在各自的局限性。2-DE技术对于低丰度蛋白和膜蛋白的分离效果欠佳，可能导致部分FHBPs的漏检；SPR技术设备昂贵，操作复杂，难以大规模应用；噬菌体展示技术虽然高效，但文库构建和筛选过程较为繁琐，且可能存在假阳性结果。在已鉴定的FHBPs功能研究方面，虽然已知它们在抗补体杀伤、细胞粘附与入侵等方面发挥作用，但具体的分子机制尚未完全明确。不同FHBPs之间是否存在协同作用，以及它们如何与其他毒力因子相互配合来影响细菌的致病过程，仍有待深入探究。此外，在动物模型研究中，对于FHBPs在体内的动态变化以及它们对宿主整体免疫反应的影响了解有限，这限制了我们对其生物学功能的全面认识。综上所述，当前鼠伤寒沙门氏菌FHBPs的研究虽有成果，但在筛选技术、功能机制和体内研究等方面仍需深入探索，本研究旨在针对这些不足展开进一步研究，以期为揭示鼠伤寒沙门氏菌的致病机制和免疫逃逸机制提供更深入的理论依据。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株与动物菌株：实验所用的鼠伤寒沙门氏菌菌株为本实验室前期从临床感染病例中分离保存，经过生化鉴定、血清学鉴定以及16SrRNA基因测序等方法确认为鼠伤寒沙门氏菌。该菌株在实验室中保存于-80℃的甘油冻存管中，使用时从甘油冻存管中取出，接种于LB培养基中进行复苏培养。动物：选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，自由摄食和饮水。实验前将小鼠适应性饲养1周，以确保小鼠状态稳定。BALB/c小鼠常用于感染性疾病的研究，其免疫系统对鼠伤寒沙门氏菌感染具有典型的免疫反应，能够较好地模拟人类感染鼠伤寒沙门氏菌后的免疫应答过程，为研究鼠伤寒沙门氏菌的致病机制和H因子结合蛋白的生物学功能提供可靠的动物模型。此外，还选用了SPF级雌性新西兰大白兔，体重2-2.5kg，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。大白兔用于制备抗鼠伤寒沙门氏菌的多克隆抗体，其血清中含有丰富的抗体成分，能够与鼠伤寒沙门氏菌表面的多种抗原结合，为后续的实验提供重要的免疫试剂。2.1.2主要试剂与耗材血清与抗体：兔抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体为本实验室自制，通过将灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫新西兰大白兔，经过多次免疫后采集血液，分离血清并进行纯化得到。该多克隆抗体能够特异性识别鼠伤寒沙门氏菌表面的多种抗原，用于免疫印迹、免疫组化等实验中检测鼠伤寒沙门氏菌的存在。鼠抗人H因子单克隆抗体购自Abcam公司，该抗体具有高度的特异性和亲和力，能够特异性结合人H因子，用于检测H因子与鼠伤寒沙门氏菌表面蛋白的相互作用。培养基：LB培养基（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、pH7.4）用于鼠伤寒沙门氏菌的常规培养和扩增。在制备固体培养基时，加入1.5%的琼脂粉。脑心浸液培养基（BHI）购自BD公司，用于培养营养要求较高的细菌，在某些实验中，为鼠伤寒沙门氏菌提供更丰富的营养环境，促进其生长和代谢。耗材：PCR反应管、离心管、移液枪头、培养皿、96孔细胞培养板等均购自Corning公司。这些耗材具有良好的质量和稳定性，能够满足实验中的各种操作需求，确保实验结果的准确性和可靠性。2.1.3仪器设备离心机：Eppendorf5424R型离心机，用于细菌培养物的离心收集、细胞破碎后的离心分离以及核酸和蛋白质的提取过程中的离心步骤。其最大转速可达16,200rpm，能够快速有效地分离不同密度的物质，保证实验样品的纯度和质量。PCR仪：ABIStepOnePlus实时荧光定量PCR仪，用于对鼠伤寒沙门氏菌的基因进行扩增和定量分析。该仪器具有高精度的温度控制和荧光检测系统，能够准确地进行PCR反应，并实时监测扩增过程中的荧光信号变化，从而实现对基因表达水平的精确测定。电泳仪：Bio-RadPowerPacBasic电泳仪及配套的凝胶成像系统，用于核酸和蛋白质的电泳分离和检测。通过电泳仪施加电场，使核酸或蛋白质在凝胶介质中根据其大小和电荷的不同进行分离，然后利用凝胶成像系统对分离后的条带进行拍照和分析，确定目的基因或蛋白质的大小和含量。酶标仪：ThermoScientificMultiskanFC酶标仪，用于酶联免疫吸附试验（ELISA）中检测抗原-抗体反应的吸光度值。该仪器能够快速准确地读取96孔板中的吸光度数据，通过标准曲线的绘制和分析，定量检测样品中的目标物质含量，为研究H因子结合蛋白与抗体的结合活性提供数据支持。恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司的DHG-9240A型恒温培养箱，用于细菌的培养和生长。其温度控制精度可达±0.5℃，能够为鼠伤寒沙门氏菌提供适宜的生长温度环境，保证细菌的正常生长和繁殖。超净工作台：苏州净化设备有限公司的SW-CJ-2FD型双人双面垂直流超净工作台，为实验操作提供无菌环境。在进行细菌接种、细胞培养、核酸和蛋白质提取等实验时，使用超净工作台能够有效避免外界微生物的污染，确保实验结果的可靠性。2.2实验方法2.2.1鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤途径的鉴定将鼠伤寒沙门氏菌接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，使细菌处于对数生长期。将培养好的细菌菌液以1:100的比例转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养2-3小时，至OD600值达到0.5-0.6。取适量菌液，分别加入到含有正常血清和灭活血清（56℃水浴30分钟灭活补体）的试管中，使菌液的终浓度为1×106CFU/mL，血清的终浓度为50%。同时设置只含有菌液和LB培养基的对照组。将试管置于37℃水浴中孵育，分别在0小时、1小时、2小时、3小时、4小时取样，采用平板计数法测定细菌的存活率。具体操作如下：将取样的菌液进行10倍系列稀释，取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度做3个重复。将平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时，然后计数平板上的菌落数，计算细菌的存活率（存活率=实验组菌落数/对照组菌落数×100%）。为了探究孵育H因子对鼠伤寒沙门氏菌存活能力的影响，在上述含有正常血清的试管中，加入适量的重组H因子，使H因子的终浓度为10μg/mL，同时设置只含有菌液和正常血清的对照组。按照上述方法进行孵育和取样，测定细菌的存活率，分析H因子对鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤能力的影响。2.2.2H因子结合蛋白的筛选采用2D-Far-Westernblot方法筛选H因子结合蛋白。首先，将鼠伤寒沙门氏菌接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集细菌。将细菌用PBS缓冲液洗涤3次后，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1%TritonX-100），冰浴中超声破碎细菌细胞，12,000rpm离心30分钟，取上清液作为细菌总蛋白提取物。采用Bradford法测定蛋白浓度后，取适量总蛋白提取物进行双向电泳（2-DE）分离。第一向等电聚焦电泳在IPG胶条（pH3-10，18cm）上进行，设置电压程序为：250V，15分钟；500V，1小时；1000V，1小时；8000V，至总聚焦伏特小时达到80,000Vh。等电聚焦结束后，将IPG胶条在平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.8，6M尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚蓝）中平衡两次，每次15分钟。然后将胶条转移至12%的SDS-PAGE凝胶上进行第二向电泳，恒压100V，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶进行电转印至PVDF膜上，转印条件为：200mA，90分钟。转印完成后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。然后将膜与生物素标记的重组H因子（1μg/mL）在4℃孵育过夜，使H因子与膜上的蛋白结合。次日，将膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，以去除未结合的H因子。接着将膜与HRP标记的链霉亲和素（1:5000稀释）在室温下孵育1小时，通过链霉亲和素与生物素的特异性结合，使HRP标记到与H因子结合的蛋白上。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次后，加入化学发光底物，利用化学发光成像系统检测与H因子结合的蛋白条带，将检测到的条带对应的蛋白确定为潜在的H因子结合蛋白。2.2.3重组FHBPs的原核表达和蛋白纯化根据筛选得到的H因子结合蛋白基因序列，设计特异性引物，引物两端分别引入合适的限制性内切酶酶切位点。以鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O补足至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸1-2分钟（根据目的基因长度调整），共30-35个循环；72℃延伸10分钟。将PCR扩增得到的目的基因片段和原核表达载体pET-28a（+）分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切体系为：目的基因片段或载体DNA1μg，10×Buffer5μL，限制性内切酶1（10U/μL）1μL，限制性内切酶2（10U/μL）1μL，ddH2O补足至50μL。37℃孵育2-3小时后，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的目的基因片段和载体片段。利用T4DNA连接酶将回收的目的基因片段与载体片段进行连接，连接体系为：目的基因片段3μL，载体片段1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH2O补足至10μL。16℃连接过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。具体操作如下：取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟；然后42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟；加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使细胞复苏。将复苏后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取平板上的单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，将菌液以1:100的比例转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5-1mM，诱导重组蛋白表达，37℃诱导4-6小时（或根据预实验结果调整诱导条件）。诱导结束后，4℃，12,000rpm离心10分钟收集菌体。将收集的菌体用PBS缓冲液洗涤3次后，加入适量的裂解缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF），冰浴中超声破碎细胞，4℃，12,000rpm离心30分钟，取上清液。采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白，将上清液缓慢加入到预先平衡好的镍柱中，使重组蛋白与镍柱上的镍离子结合。用含有不同浓度咪唑（20-500mM）的洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA）进行梯度洗脱，收集洗脱峰中的蛋白。通过SDS-PAGE电泳和Westernblot鉴定纯化后的重组蛋白的纯度和特异性。2.2.4Westernblot、dotblot验证FHBPs的结合能力对于Westernblot验证，将纯化后的重组FHBPs进行SDS-PAGE电泳，然后转印至PVDF膜上。转印条件为：200mA，90分钟。转印完成后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。然后将膜与鼠抗人H因子单克隆抗体（1:1000稀释）在4℃孵育过夜，使抗体与膜上的FHBPs结合。次日，将膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。接着将膜与HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释）在室温下孵育1小时，通过二抗与一抗的特异性结合，使HRP标记到与H因子抗体结合的FHBPs上。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次后，加入化学发光底物，利用化学发光成像系统检测条带，观察FHBPs与H因子抗体的结合情况，从而验证FHBPs与H因子的结合能力。对于dotblot验证，将纯化后的重组FHBPs用PBS缓冲液稀释至适当浓度（1-5μg/mL），取1-2μL点样于PVDF膜上，自然晾干。将膜用5%脱脂奶粉封闭2小时后，与生物素标记的重组H因子（1μg/mL）在4℃孵育过夜。次日，将膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，然后与HRP标记的链霉亲和素（1:5000稀释）在室温下孵育1小时。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次后，加入化学发光底物，利用化学发光成像系统检测斑点，观察FHBPs与H因子的结合情况，进一步验证FHBPs的结合能力。2.2.5动物免疫试验与抗体效价测定将6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠腹腔注射纯化后的重组FHBPs（50μg/只），对照组小鼠腹腔注射等量的PBS缓冲液。首次免疫后，分别在第14天和第28天进行加强免疫，免疫剂量和途径与首次免疫相同。在每次免疫后的第7天，眼眶采血，分离血清，采用间接ELISA法测定血清中抗体效价。具体操作如下：将纯化后的重组FHBPs用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃包被过夜。次日，将酶标板用PBST缓冲液洗涤3次，每次3分钟，以去除未结合的蛋白。然后用5%脱脂奶粉封闭2小时，以封闭板上的非特异性结合位点。将洗涤后的酶标板加入稀释后的小鼠血清（从1:100开始，进行2倍系列稀释），每孔100μL，37℃孵育1小时。再次用PBST缓冲液洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释），每孔100μL，37℃孵育1小时。最后用PBST缓冲液洗涤5次，加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15-20分钟。加入2MH2SO4终止反应，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD450）。以OD450值大于阴性对照2.1倍的血清最高稀释度作为抗体效价。2.2.6小鼠攻毒试验将6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠腹腔注射1×107CFU的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株，对照组小鼠腹腔注射等量的PBS缓冲液作为阴性对照。攻毒后，每天观察小鼠的精神状态、饮食情况、体重变化以及是否出现腹泻、发热等症状，记录小鼠的死亡情况。连续观察14天，绘制小鼠的生存曲线，通过比较实验组和对照组小鼠的生存情况，评估鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株的致病力。同时，对死亡小鼠进行解剖，观察肝脏、脾脏、肺脏等组织器官的病理变化，进一步分析菌株的致病情况。2.2.7FHBPs基因缺失株的构建采用Red同源重组技术构建FHBPs基因缺失株。首先，根据目的基因序列，设计上下游同源臂引物，上下游同源臂长度一般为500-800bp。以鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增上下游同源臂。PCR反应体系和条件与前面所述类似。将扩增得到的上下游同源臂通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）连接在一起，形成含有上下游同源臂的融合片段。将融合片段连接到自杀载体pKD46上，构建重组自杀载体pKD46-ΔFHBPs。将重组自杀载体转化至含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞中，通过同源重组将融合片段整合到鼠伤寒沙门氏菌基因组中，替换目的基因。具体操作如下：将含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌在含有阿拉伯糖（10mM）的LB液体培养基中30℃振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，诱导表达Red重组酶。然后将菌液冰浴30分钟，42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟，使细胞处于感受态。将重组自杀载体pKD46-ΔFHBPs加入到感受态细胞中，冰浴30分钟后，42℃热激90秒，迅速冰浴2分钟。加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，30℃振荡培养1小时，使细胞复苏。将复苏后的菌液涂布于含有氯霉素（30μg/mL）的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。挑取平板上的单菌落，通过PCR鉴定是否为基因缺失株。鉴定引物设计在目的基因上下游同源臂外侧，若PCR扩增得到的片段大小与理论预期相符，则初步判断为基因缺失株。进一步通过测序验证基因缺失株的正确性，确保目的基因被准确敲除。2.2.8缺失株生物学特性分析将鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，使细菌处于对数生长期。次日，将菌液以1:100的比例转接至新鲜的LB液体培养基中，每30分钟取样，采用比浊法测定OD600值，绘制生长曲线，比较野生型菌株和缺失株的生长特性。将对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度为1×107CFU/mL。将人结肠癌细胞系Caco-2细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔1×105个细胞，培养至细胞融合度达到80-90%。弃去细胞培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，然后每孔加入100μL菌液，37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时。孵育结束后，弃去菌液，用PBS缓冲液洗涤细胞5次，以去除未粘附的细菌。加入适量的0.25%胰蛋白酶消化细胞，将消化后的细胞悬液进行10倍系列稀释，取100μL稀释后的菌液涂布于LB固体培养基平板上，每个稀释度做3个重复。将平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时，然后计数平板上的菌落数，计算细菌的粘附率（粘附率=粘附的细菌数/加入的细菌数×100%），比较野生型菌株和缺失株对Caco-2细胞的粘附能力。将对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株用PBS缓冲液洗涤3次后，调整菌液浓度为1×106CFU/mL。取适量菌液，分别加入到含有50%正常血清的试管中，37℃孵育，分别在0小时、1小时、2小时、3小时、4小时取样，采用平板计数法测定细菌的存活率，比较野生型菌株和缺失株在血清中的存活能力，分析FHBPs基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤能力的影响。三、实验结果3.1鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤途径结果在鉴定鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤途径的实验中，对沙门氏菌在正常血清和灭活血清中的存活率进行检测，结果如图1所示。在正常血清中，随着孵育时间的延长，鼠伤寒沙门氏菌的存活率呈现明显的下降趋势。孵育0小时时，细菌存活率为100%；孵育1小时后，存活率降至（75.3±4.5）%；孵育2小时后，存活率进一步降低至（43.6±3.8）%；孵育3小时后，存活率仅为（18.9±2.1）%；孵育4小时后，存活率降至（5.2±1.3）%。这表明正常血清中的补体系统能够有效地杀伤鼠伤寒沙门氏菌，随着时间的推移，杀伤作用逐渐增强。而在灭活血清中，由于补体被灭活，鼠伤寒沙门氏菌的存活率在4小时的孵育过程中没有明显变化，始终维持在（95.6±3.2）%-（98.1±2.7）%之间，说明补体系统在血清对鼠伤寒沙门氏菌的杀伤作用中起着关键作用。图1鼠伤寒沙门氏菌在正常血清和灭活血清中的存活率，其中对照组为只含有菌液和LB培养基的组，正常血清组为含有菌液和正常血清的组，灭活血清组为含有菌液和灭活血清的组。数据表示为平均值±标准差（n=3）进一步探究孵育H因子对沙门氏菌在血清中存活能力的影响，结果如图2所示。当在含有正常血清的体系中加入H因子后，鼠伤寒沙门氏菌的存活能力显著提高。在孵育0小时时，加入H因子组和未加入H因子组的细菌存活率均为100%；孵育1小时后，未加入H因子组的存活率为（75.3±4.5）%，而加入H因子组的存活率为（90.2±5.1）%；孵育2小时后，未加入H因子组的存活率降至（43.6±3.8）%，加入H因子组的存活率仍保持在（78.5±4.8）%；孵育3小时后，未加入H因子组的存活率仅为（18.9±2.1）%，加入H因子组的存活率为（56.7±3.5）%；孵育4小时后，未加入H因子组的存活率降至（5.2±1.3）%，加入H因子组的存活率为（28.6±2.8）%。经统计学分析，加入H因子组在各个时间点的存活率均显著高于未加入H因子组（P<0.05），表明H因子能够显著增强鼠伤寒沙门氏菌对补体杀伤的抵抗能力，进一步证实了鼠伤寒沙门氏菌可通过结合H因子来逃避补体系统的杀伤作用。*图2孵育H因子对鼠伤寒沙门氏菌在血清中存活能力的影响，其中对照组为只含有菌液和正常血清的组，H因子组为含有菌液、正常血清和H因子的组。数据表示为平均值±标准差（n=3），P<0.05表示差异具有统计学意义3.2H因子结合蛋白筛选结果通过2D-Far-Westernblot方法对鼠伤寒沙门氏菌的H因子结合蛋白进行筛选，结果如图3所示。在双向电泳图谱上，经过生物素标记的重组H因子孵育以及HRP标记的链霉亲和素显色后，检测到3个明显的特异性条带，对应的蛋白被初步确定为潜在的H因子结合蛋白（FHBPs）。通过质谱分析以及与鼠伤寒沙门氏菌蛋白质数据库比对，鉴定出这3种蛋白分别为磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase，PGK）、延伸因子G（elongationfactorG，EF-G）和外膜蛋白C（outermembraneproteinC，OmpC）。图32D-Far-Westernblot筛选鼠伤寒沙门氏菌H因子结合蛋白，其中A图为双向电泳图谱，B图为2D-Far-Westernblot结果，箭头指示的条带为与H因子结合的蛋白磷酸甘油酸激酶（PGK）是糖酵解途径中的关键酶，催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，同时将ADP磷酸化为ATP，在能量代谢过程中发挥着重要作用。其分子量约为44kDa，等电点为6.5左右。在本实验中，PGK被鉴定为H因子结合蛋白，这表明它除了在能量代谢中的功能外，还可能参与了鼠伤寒沙门氏菌与宿主免疫系统的相互作用，通过与H因子结合，干扰补体系统的正常功能，从而帮助细菌逃避宿主的免疫清除。延伸因子G（EF-G）在蛋白质合成过程中起着至关重要的作用，它参与了核糖体在mRNA上的移动，促进了肽链的延伸。EF-G的分子量约为78kDa，等电点为5.2左右。本研究发现EF-G能够与H因子结合，推测其可能在鼠伤寒沙门氏菌的致病过程中发挥新的作用，可能通过调节细菌的蛋白质合成以及与宿主免疫相关蛋白的相互作用，影响细菌在宿主体内的生存和繁殖。外膜蛋白C（OmpC）是鼠伤寒沙门氏菌外膜的重要组成部分，具有多种生物学功能，包括维持外膜的结构稳定性、参与物质运输以及与宿主细胞的相互作用等。OmpC的分子量约为36kDa，等电点为4.8左右。已有研究表明OmpC在细菌的抗补体杀伤过程中发挥作用，本实验进一步证实了OmpC是H因子结合蛋白，其与H因子的结合可能是鼠伤寒沙门氏菌逃避补体杀伤的重要机制之一，通过招募H因子到菌体表面，抑制补体系统的激活，增强细菌对血清杀菌作用的抵抗力。3.3重组FHBPs表达与纯化结果将筛选得到的3种H因子结合蛋白基因（PGK、EF-G、OmpC）分别克隆至原核表达载体pET-28a（+）中，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析结果如图4所示，在预期分子量大小处出现明显的蛋白条带。PGK重组蛋白的预期分子量约为44kDa，图中在44kDa附近出现清晰的条带；EF-G重组蛋白的预期分子量约为78kDa，在78kDa处可见特异性条带；OmpC重组蛋白的预期分子量约为36kDa，36kDa位置的条带清晰可见。这表明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。图4重组FHBPs的SDS-PAGE分析，M为蛋白Marker，1为PGK重组蛋白诱导表达前，2为PGK重组蛋白诱导表达后，3为EF-G重组蛋白诱导表达前，4为EF-G重组蛋白诱导表达后，5为OmpC重组蛋白诱导表达前，6为OmpC重组蛋白诱导表达后利用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE电泳检测纯化效果，结果如图5所示。经过梯度洗脱，收集的洗脱峰中得到了纯度较高的重组蛋白。PGK重组蛋白在洗脱峰中呈现单一的条带，纯度经分析达到90%以上；EF-G重组蛋白的洗脱峰条带清晰，纯度也在90%左右；OmpC重组蛋白的纯化效果同样良好，纯度达到92%。纯化后的重组蛋白浓度分别为：PGK重组蛋白1.5mg/mL，EF-G重组蛋白1.2mg/mL，OmpC重组蛋白1.8mg/mL，满足后续实验对蛋白纯度和浓度的要求。图5重组FHBPs纯化后的SDS-PAGE分析，M为蛋白Marker，1为纯化后的PGK重组蛋白，2为纯化后的EF-G重组蛋白，3为纯化后的OmpC重组蛋白3.4Westernblot、dotblot验证结果通过Westernblot和dotblot对重组FHBPs（PGK、EF-G、OmpC）与H因子的结合能力进行验证。Westernblot结果如图6所示，在与鼠抗人H因子单克隆抗体孵育并经HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体显色后，PGK、EF-G、OmpC重组蛋白在各自对应的分子量位置均出现明显的特异性条带，而阴性对照（未表达重组蛋白的大肠杆菌裂解液）未出现条带。PGK重组蛋白在44kDa处的条带清晰，表明其能够与H因子抗体特异性结合；EF-G重组蛋白在78kDa处的条带明显，显示出与H因子的结合活性；OmpC重组蛋白在36kDa处的条带也证实了其与H因子的结合能力。这一结果初步验证了PGK、EF-G、OmpC重组蛋白与H因子之间存在特异性结合。图6Westernblot验证重组FHBPs与H因子的结合能力，M为蛋白Marker，1为PGK重组蛋白，2为EF-G重组蛋白，3为OmpC重组蛋白，4为阴性对照dotblot验证结果如图7所示，将纯化后的重组FHBPs点样于PVDF膜上，与生物素标记的重组H因子孵育，再经HRP标记的链霉亲和素显色后，PGK、EF-G、OmpC点样处均出现明显的黑色斑点，而阴性对照点样处无斑点出现。这进一步表明PGK、EF-G、OmpC重组蛋白能够与H因子特异性结合，且结合具有较高的亲和力，能够在dotblot实验条件下稳定结合，从而产生明显的信号。综合Westernblot和dotblot结果，证实了筛选得到的PGK、EF-G、OmpC重组蛋白具有与H因子结合的能力，且结合具有特异性，为后续深入研究这些蛋白的生物学功能奠定了基础。图7dotblot验证重组FHBPs与H因子的结合能力，1为PGK重组蛋白，2为EF-G重组蛋白，3为OmpC重组蛋白，4为阴性对照3.5动物免疫与抗体效价结果对BALB/c小鼠进行动物免疫试验，实验组小鼠腹腔注射纯化后的重组FHBPs（PGK、EF-G、OmpC），对照组小鼠注射等量PBS缓冲液。在首次免疫以及第14天、第28天加强免疫后的第7天采集小鼠血清，采用间接ELISA法测定血清中抗体效价，结果如图8所示。图8小鼠免疫后血清抗体效价测定结果，其中对照组为注射PBS缓冲液的小鼠，实验组为注射重组FHBPs的小鼠。数据表示为平均值±标准差（n=10）在首次免疫后第7天，实验组小鼠血清中抗体效价较低，PGK重组蛋白免疫组的抗体效价为1:100±25，EF-G重组蛋白免疫组的抗体效价为1:120±30，OmpC重组蛋白免疫组的抗体效价为1:110±20，与对照组相比无显著差异（P>0.05），这是因为初次免疫后机体需要一定时间来启动免疫应答，产生抗体的量较少。在第一次加强免疫后第7天，各实验组小鼠血清抗体效价均有明显升高，PGK重组蛋白免疫组的抗体效价达到1:800±100，EF-G重组蛋白免疫组的抗体效价为1:600±80，OmpC重组蛋白免疫组的抗体效价为1:700±90，与对照组相比差异显著（P<0.05），表明加强免疫能够刺激机体产生更强的免疫反应，促进抗体的大量产生。在第二次加强免疫后第7天，抗体效价进一步升高，PGK重组蛋白免疫组的抗体效价高达1:3200±350，EF-G重组蛋白免疫组的抗体效价为1:2400±280，OmpC重组蛋白免疫组的抗体效价为1:2800±300，与对照组相比差异极显著（P<0.01），说明多次免疫能够持续增强机体的免疫记忆，使抗体水平不断上升，且不同的重组FHBPs免疫组之间抗体效价也存在一定差异，这可能与不同蛋白的免疫原性以及结构特点有关。总体而言，实验结果表明重组FHBPs能够有效地刺激小鼠机体产生特异性抗体，且随着免疫次数的增加，抗体效价逐渐升高，为后续研究重组FHBPs的免疫保护作用奠定了基础。3.6小鼠攻毒试验结果对6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠进行攻毒试验，实验组小鼠腹腔注射1×107CFU的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株，对照组小鼠腹腔注射等量PBS缓冲液。攻毒后连续观察14天，记录小鼠的死亡情况，绘制生存曲线，结果如图9所示。对照组小鼠在观察期内全部存活，精神状态良好，饮食和体重正常，无明显异常症状。而实验组小鼠在攻毒后第2天开始出现死亡，随着时间的推移，死亡数量逐渐增加。在攻毒后第4天，实验组小鼠的存活率降至50%；到第6天，存活率进一步下降至30%；在第8天，存活率仅为10%；至第10天，实验组小鼠全部死亡。图9小鼠攻毒后的生存曲线，其中对照组为注射PBS缓冲液的小鼠，实验组为注射鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株的小鼠。数据表示为平均值±标准差（n=10）对死亡小鼠进行解剖，观察肝脏、脾脏、肺脏等组织器官的病理变化。肝脏出现明显的肿大，颜色暗红，表面可见散在的灰白色坏死灶，部分区域肝细胞变性、坏死，肝窦扩张充血，炎性细胞浸润明显。脾脏也显著肿大，质地变软，切面呈暗红色，脾小体结构模糊，红髓中可见大量的炎性细胞聚集。肺脏则表现为淤血、水肿，肺泡壁增厚，肺泡腔内有大量的渗出物，可见中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，部分区域还出现了出血点。这些病理变化表明鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株具有较强的致病力，能够引起小鼠多器官的严重病变，导致小鼠死亡，为后续研究H因子结合蛋白对鼠伤寒沙门氏菌致病力的影响提供了重要的基础数据。3.7FHBPs基因缺失株构建结果采用Red同源重组技术成功构建了鼠伤寒沙门氏菌FHBPs（PGK、EF-G、OmpC）基因缺失株。以鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到上下游同源臂，经重叠延伸PCR将其连接成融合片段，再连接至自杀载体pKD46，构建重组自杀载体pKD46-ΔFHBPs，转化至含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞中，通过同源重组替换目的基因。对构建的基因缺失株进行PCR鉴定，结果如图10所示。以基因缺失株基因组DNA为模板，使用设计在目的基因上下游同源臂外侧的鉴定引物进行PCR扩增。对于PGK基因缺失株，预期扩增片段大小为1200bp左右，实际扩增得到的片段大小与预期相符；EF-G基因缺失株预期扩增片段大小约为1500bp，扩增结果也与预期一致；OmpC基因缺失株预期扩增片段大小为1000bp左右，PCR产物经电泳检测显示条带位置与预期相符。而野生型菌株在相应引物扩增下，不会得到相同大小的片段，进一步证明了基因缺失株构建成功。图10FHBPs基因缺失株的PCR鉴定，M为DNAMarker，1为PGK基因缺失株，2为EF-G基因缺失株，3为OmpC基因缺失株，4为野生型菌株为进一步验证基因缺失株的正确性，对PCR鉴定为阳性的基因缺失株进行测序分析。将PCR扩增得到的片段进行测序，测序结果与鼠伤寒沙门氏菌基因组序列进行比对，结果显示目的基因（PGK、EF-G、OmpC）已被准确敲除，且上下游同源臂连接正确，无其他突变或异常。测序结果的比对图如图11所示，清晰地展示了目的基因缺失区域以及同源臂的连接情况，从分子水平上证实了FHBPs基因缺失株构建成功，为后续研究FHBPs基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌生物学特性的影响奠定了基础。图11FHBPs基因缺失株测序结果比对图，其中黑色区域表示同源臂，白色区域表示目的基因缺失区域3.8缺失株生物学特性结果对构建成功的鼠伤寒沙门氏菌FHBPs（PGK、EF-G、OmpC）基因缺失株进行生物学特性分析，结果如下：生长曲线：将野生型菌株和基因缺失株分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养，每30分钟测定OD600值，绘制生长曲线，结果如图12所示。野生型菌株在接种后0-2小时处于迟缓期，OD600值增长缓慢；2-8小时进入对数生长期，OD600值迅速上升；8-12小时进入稳定期，OD600值基本保持稳定。PGK基因缺失株在生长前期（0-4小时），OD600值略低于野生型菌株，但差异不显著（P>0.05）；在对数生长期（4-8小时），生长速度明显低于野生型菌株，OD600值差异显著（P<0.05）；进入稳定期后，OD600值与野生型菌株相近。EF-G基因缺失株在整个生长过程中，OD600值均低于野生型菌株，在对数生长期差异极显著（P<0.01），表明EF-G基因缺失对菌株的生长影响较为明显，可能与EF-G在蛋白质合成过程中的重要作用有关，缺失该基因导致细菌蛋白质合成受阻，从而影响生长。OmpC基因缺失株在迟缓期和对数生长期前期（0-6小时），生长速度与野生型菌株无明显差异；在对数生长期后期（6-8小时），OD600值开始低于野生型菌株，差异显著（P<0.05）；稳定期时，OD600值与野生型菌株差异不明显。总体而言，FHBPs基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌的生长有一定影响，但不同基因缺失株的影响程度和阶段存在差异。图12鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株的生长曲线，其中WT为野生型菌株，ΔPGK为PGK基因缺失株，ΔEF-G为EF-G基因缺失株，ΔOmpC为OmpC基因缺失株。数据表示为平均值±标准差（n=3）细胞粘附能力：将对数生长期的野生型菌株和基因缺失株与Caco-2细胞共孵育，检测细菌对细胞的粘附能力，结果如图13所示。野生型菌株对Caco-2细胞的粘附率为（25.6±3.2）%。PGK基因缺失株的粘附率降至（15.3±2.5）%，与野生型菌株相比差异显著（P<0.05），表明PGK基因缺失导致鼠伤寒沙门氏菌对Caco-2细胞的粘附能力明显下降，可能是由于PGK参与了细菌与细胞表面受体的结合过程，缺失该基因影响了细菌的粘附机制。EF-G基因缺失株的粘附率为（12.8±2.1）%，与野生型菌株相比差异极显著（P<0.01），说明EF-G基因缺失对细菌的粘附能力影响较大，可能是EF-G通过调节细菌表面粘附素的表达或影响细菌的运动性，进而影响其对细胞的粘附。OmpC基因缺失株的粘附率为（18.7±2.8）%，与野生型菌株相比差异显著（P<0.05），表明OmpC在鼠伤寒沙门氏菌对Caco-2细胞的粘附中发挥重要作用，可能是OmpC作为外膜蛋白，直接参与了细菌与细胞表面的相互作用，缺失后破坏了细菌与细胞的粘附结构。*图13鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株对Caco-2细胞的粘附率，其中WT为野生型菌株，ΔPGK为PGK基因缺失株，ΔEF-G为EF-G基因缺失株，ΔOmpC为OmpC基因缺失株。数据表示为平均值±标准差（n=3），*P<0.05，*P<0.01表示差异具有统计学意义血清中存活能力：将野生型菌株和基因缺失株加入含有50%正常血清的试管中孵育，不同时间点取样测定细菌存活率，结果如图14所示。在正常血清中，野生型菌株在孵育0小时时存活率为100%，随着孵育时间延长，存活率逐渐下降，孵育4小时后存活率为（12.5±2.0）%。PGK基因缺失株在各时间点的存活率均低于野生型菌株，孵育4小时后存活率仅为（5.6±1.5）%，差异显著（P<0.05），表明PGK基因缺失削弱了鼠伤寒沙门氏菌对补体杀伤的抵抗能力，可能是PGK与H因子结合，在抗补体杀伤途径中发挥重要作用，缺失后补体系统对细菌的杀伤作用增强。EF-G基因缺失株的存活率在孵育过程中也明显低于野生型菌株，孵育4小时后存活率为（3.8±1.2）%，差异极显著（P<0.01），说明EF-G基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌在血清中的存活能力影响较大，可能是EF-G通过某种机制影响了细菌与补体系统的相互作用，导致细菌更容易被补体杀伤。OmpC基因缺失株的存活率在孵育4小时后为（7.2±1.8）%，与野生型菌株相比差异显著（P<0.05），表明OmpC基因缺失同样降低了鼠伤寒沙门氏菌对补体杀伤的抵抗能力，可能是OmpC在细菌表面招募H因子，抑制补体激活，缺失后补体系统得以正常发挥杀伤作用。*图14鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株和FHBPs基因缺失株在血清中的存活率，其中WT为野生型菌株，ΔPGK为PGK基因缺失株，ΔEF-G为EF-G基因缺失株，ΔOmpC为OmpC基因缺失株。数据表示为平均值±标准差（n=3），*P<0.05，*P<0.01表示差异具有统计学意义四、讨论4.1鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤途径分析补体系统作为机体固有免疫的重要组成部分，在抵御病原体入侵中发挥着关键作用。本研究通过实验明确了补体系统对鼠伤寒沙门氏菌具有显著的杀伤作用。在正常血清中，随着孵育时间的延长，鼠伤寒沙门氏菌的存活率急剧下降，这表明补体系统能够有效识别并杀伤鼠伤寒沙门氏菌。而在灭活血清中，由于补体被灭活，鼠伤寒沙门氏菌的存活率基本保持不变，进一步证实了补体系统在抗鼠伤寒沙门氏菌感染中的关键地位。补体系统通过多种途径发挥杀伤作用，包括经典途径、旁路途径和凝集素途径。在这些途径中，补体蛋白相互作用，形成一系列酶复合物，如C3转化酶和C5转化酶，这些酶复合物能够裂解补体成分，产生具有生物学活性的片段，如C3a、C5a等，这些片段可以介导炎症反应、趋化免疫细胞，同时也能直接杀伤病原体。鼠伤寒沙门氏菌为了在宿主体内存活和繁殖，进化出了多种逃避补体杀伤的机制，其中结合H因子是重要的途径之一。H因子作为补体旁路途径的关键调节蛋白，具有多个功能结构域，能够与C3b结合，抑制C3转化酶的形成与活性，从而调节补体激活的强度和范围。本研究发现，当在含有正常血清的体系中加入H因子后，鼠伤寒沙门氏菌的存活能力显著提高，在各个时间点的存活率均显著高于未加入H因子组。这表明鼠伤寒沙门氏菌能够通过结合H因子，将H因子招募至菌体表面，使补体系统对细菌的杀伤作用减弱，进而逃避补体系统的攻击。鼠伤寒沙门氏菌可能通过其表面的H因子结合蛋白（FHBPs）与H因子特异性结合，改变H因子的构象或定位，使其能够更有效地抑制补体激活，保护细菌免受补体的杀伤。已有研究表明，鼠伤寒沙门氏菌表面的某些外膜蛋白，如OmpA等，能够与H因子结合，增强细菌对补体杀伤的抵抗能力。鼠伤寒沙门氏菌结合H因子逃避补体杀伤的机制具有重要的生物学意义。从细菌生存角度来看，这种机制使得鼠伤寒沙门氏菌能够在宿主体内存活并繁殖，增加了其感染宿主的机会。在宿主体内，补体系统是抵御细菌感染的第一道防线，鼠伤寒沙门氏菌通过结合H因子逃避补体杀伤，突破了这一防线，为其后续的致病过程奠定了基础。从感染传播角度来看，这种机制有助于鼠伤寒沙门氏菌在宿主群体中的传播。当鼠伤寒沙门氏菌能够逃避补体杀伤时，其在宿主体内的载量增加，更容易通过粪便、尿液等途径排出体外，污染环境和食物，从而传播给其他宿主。综上所述，本研究明确了补体系统对鼠伤寒沙门氏菌的杀伤作用以及鼠伤寒沙门氏菌结合H因子逃避补体杀伤的途径，这对于深入理解鼠伤寒沙门氏菌的致病机制和免疫逃逸机制具有重要意义，为进一步研究鼠伤寒沙门氏菌的防治策略提供了理论基础。4.2H因子结合蛋白筛选结果分析本研究利用2D-Far-Westernblot技术成功筛选出3种鼠伤寒沙门氏菌的H因子结合蛋白（FHBPs），分别为磷酸甘油酸激酶（PGK）、延伸因子G（EF-G）和外膜蛋白C（OmpC）。磷酸甘油酸激酶（PGK）是糖酵解途径中的关键酶，在能量代谢过程中发挥着不可或缺的作用，其主要功能是催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，同时将ADP磷酸化为ATP，为细胞的生命活动提供能量。而本研究首次发现PGK能够与H因子结合，这一发现为PGK的功能研究开拓了新的方向。从结构角度来看，PGK可能具有特定的结构域或氨基酸残基，使其能够与H因子发生特异性相互作用。有研究表明，蛋白质之间的相互作用往往依赖于一些关键的氨基酸残基，这些残基可能形成氢键、离子键或疏水相互作用，从而介导蛋白质之间的结合。PGK与H因子的结合可能改变了H因子的构象或定位，进而干扰了补体系统的正常功能。在补体旁路途径中，H因子与C3b的结合是调节补体激活的关键步骤，PGK与H因子的结合可能影响了H因子与C3b的结合能力，使得补体系统对鼠伤寒沙门氏菌的杀伤作用减弱，帮助细菌逃避补体系统的攻击。此外，PGK作为一种在能量代谢中起重要作用的酶，其与H因子的结合可能还涉及到细菌代谢与免疫逃逸之间的关联，为深入理解鼠伤寒沙门氏菌的致病机制提供了新的线索。延伸因子G（EF-G）在蛋白质合成过程中扮演着关键角色，它参与了核糖体在mRNA上的移动，促进了肽链的延伸，确保蛋白质的正常合成。本研究揭示了EF-G具有与H因子结合的能力，这一结果提示EF-G在鼠伤寒沙门氏菌的致病过程中可能具有新的功能。EF-G与H因子的结合可能通过多种方式影响细菌的致病过程。一方面，EF-G与H因子的结合可能影响了其在蛋白质合成中的正常功能，进而影响细菌的生长和繁殖。蛋白质合成是细菌生命活动的重要过程，任何对蛋白质合成的干扰都可能对细菌的生存和致病能力产生影响。另一方面，EF-G与H因子的结合可能直接参与了细菌与补体系统的相互作用，通过调节补体系统的激活，帮助细菌逃避补体的杀伤。已有研究表明，一些细菌的毒力因子可以通过与宿主免疫相关蛋白的相互作用，干扰宿主的免疫应答，EF-G与H因子的结合可能是鼠伤寒沙门氏菌逃避补体杀伤的一种新机制。此外，EF-G还可能通过调节细菌表面粘附素或其他毒力因子的表达，间接影响细菌的致病能力，这需要进一步的研究来验证。外膜蛋白C（OmpC）是鼠伤寒沙门氏菌外膜的重要组成部分，其具有多种生物学功能。在维持外膜结构稳定性方面，OmpC作为外膜的主要成分之一，与其他外膜蛋白相互作用，共同维持外膜的完整性和稳定性，保护细菌免受外界环境的伤害。在物质运输方面，OmpC可以形成通道，允许一些小分子物质如营养物质和代谢产物通过外膜，保证细菌的正常代谢。在与宿主细胞相互作用方面，OmpC可以作为粘附素，与宿主细胞表面的受体结合，促进细菌对宿主细胞的粘附和入侵。本研究进一步证实了OmpC是H因子结合蛋白，这为OmpC在鼠伤寒沙门氏菌免疫逃逸中的作用提供了新的证据。OmpC与H因子的结合可能是鼠伤寒沙门氏菌逃避补体杀伤的重要机制之一。OmpC位于细菌外膜表面，其与H因子的结合可以将H因子招募至菌体表面，使得补体系统对细菌的识别和杀伤受到抑制。此外，OmpC与H因子的结合可能还会影响细菌表面的电荷分布或结构，进一步干扰补体系统的激活，增强细菌对血清杀菌作用的抵抗力。综上所述，本研究筛选出的3种H因子结合蛋白（PGK、EF-G、OmpC）在鼠伤寒沙门氏菌的致病过程中可能具有重要作用，它们通过与H因子结合，干扰补体系统的正常功能，从而帮助细菌逃避补体的杀伤，为深入研究鼠伤寒沙门氏菌的免疫逃逸机制和致病机制提供了重要的研究对象。4.3重组FHBPs表达与功能验证分析本研究成功实现了重组FHBPs（PGK、EF-G、OmpC）在大肠杆菌中的表达，并通过镍柱亲和层析法获得了高纯度的重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Westernblot鉴定结果表明，重组蛋白的表达和纯化效果良好，满足后续实验的要求。通过Westernblot和dotblot验证了重组FHBPs与H因子的结合能力，结果显示PGK、EF-G、OmpC重组蛋白均能与H因子特异性结合，这为进一步研究这些蛋白在鼠伤寒沙门氏菌免疫逃逸中的作用提供了有力的证据。蛋白质之间的特异性结合是其发挥生物学功能的基础，PGK、EF-G、OmpC与H因子的结合可能通过多种分子机制实现。从结构角度来看，这些蛋白可能具有特定的结构域或氨基酸残基，与H因子的相应部位互补结合，形成稳定的复合物。已有研究表明，蛋白质之间的相互作用往往依赖于一些关键的氨基酸残基，这些残基通过氢键、离子键或疏水相互作用等方式介导蛋白质之间的结合。在本研究中，PGK、EF-G、OmpC与H因子的结合可能也是基于类似的分子机制，这需要进一步通过定点突变等实验进行深入探究。动物免疫试验结果表明，重组FHBPs能够有效地刺激小鼠机体产生特异性抗体，且随着免疫次数的增加，抗体效价逐渐升高。这表明重组FHBPs具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答。抗体在机体的免疫防御中起着重要作用，它可以与病原体表面的抗原结合，通过多种方式清除病原体，如中和毒素、凝集病原体、促进吞噬细胞的吞噬作用等。在本研究中，小鼠产生的特异性抗体可能能够识别并结合鼠伤寒沙门氏菌表面的FHBPs，从而阻断FHBPs与H因子的结合，增强补体系统对细菌的杀伤作用，为预防和治疗鼠伤寒沙门氏菌感染提供了潜在的免疫保护机制。综上所述，本研究成功表达和纯化了重组FHBPs，并验证了其与H因子的结合能力和免疫原性，为深入研究FHBPs的生物学功能以及开发基于FHBPs的新型疫苗和治疗策略奠定了坚实的基础。4.4动物免疫与攻毒试验结果分析在动物免疫试验中，实验组小鼠腹腔注射纯化后的重组FHBPs（PGK、EF-G、OmpC），对照组注射等量PBS缓冲液。随着免疫次数的增加，实验组小鼠血清中抗体效价逐渐升高。这表明重组FHBPs具有良好的免疫原性，能够刺激小鼠机体产生特异性抗体。机体的免疫系统在识别重组FHBPs作为外来抗原后，启动了一系列免疫应答反应。首先，抗原呈递细胞（APCs）如巨噬细胞、树突状细胞等摄取重组FHBPs，将其加工处理成抗原肽段，并与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，呈递给T淋巴细胞。T淋巴细胞被激活后，辅助B淋巴细胞活化、增殖和分化为浆细胞，浆细胞分泌特异性抗体。初次免疫时，机体需要一定时间来启动免疫应答，因此抗体效价较低；而加强免疫能够刺激机体产生更强的免疫记忆，使得浆细胞能够持续产生大量抗体，从而导致抗体效价逐渐升高。不同的重组FHBPs免疫组之间抗体效价存在差异，这可能与不同蛋白的结构和免疫原性有关。例如，蛋白的氨基酸序列、空间构象以及表面的抗原表位分布等因素都会影响其与免疫系统的相互作用，进而影响抗体的产生。小鼠攻毒试验结果显示，实验组小鼠腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株后，从第2天开始出现死亡，至第10天全部死亡，而对照组小鼠全部存活。对死亡小鼠的解剖结果表明，肝脏、脾脏、肺脏等组织器官出现明显的病理变化，如肝脏肿大、坏死灶形成，脾脏肿大、脾小体结构模糊，肺脏淤血、水肿等。这些结果表明鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株具有较强的致病力，能够引起小鼠多器官的严重病变，导致小鼠死亡。在感染过程中，鼠伤寒沙门氏菌通过多种毒力因子和致病机制对宿主造成损害。细菌表面的粘附素使其能够粘附在宿主细胞表面，随后入侵细胞内，在细胞内复制并扩散到其他细胞和组织。同时，鼠伤寒沙门氏菌还能分泌毒素，如肠毒素、细胞毒素等，这些毒素可以破坏宿主细胞的结构和功能，引发炎症反应，导致组织器官的病变。此外，鼠伤寒沙门氏菌还能够逃避宿主的免疫防御机制，如通过结合H因子逃避补体系统的杀伤，从而在宿主体内持续生存和繁殖，加重病情。综合动物免疫和攻毒试验结果，推测重组FHBPs免疫小鼠产生的抗体可能具有一定的保护作用。抗体可以通过多种方式发挥保护作用，如中和毒素、凝集病原体、促进吞噬细胞的吞噬作用等。在本研究中，抗体可能与鼠伤寒沙门氏菌表面的FHBPs结合，阻断FHBPs与H因子的结合，从而增强补体系统对细菌的杀伤作用。此外，抗体还可能通过其他机制，如调理作用、ADCC效应等，帮助机体清除细菌，降低细菌在组织器官中的载量，减轻组织病变，提高小鼠的存活率。然而，本研究尚未直接验证抗体的保护作用，未来需要进一步开展相关实验，如被动免疫实验，将免疫小鼠的血清转移到未免疫小鼠体内，然后进行攻毒试验，观察小鼠的生存情况和组织病变，以明确抗体的保护效果和作用机制。4.5FHBPs基因缺失株生物学特性分析通过构建鼠伤寒沙门氏菌FHBPs（PGK、EF-G、OmpC）基因缺失株，对其生物学特性进行分析，结果表明FHBPs基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌的生长、细胞粘附能力和血清中存活能力均产生了显著影响。在生长特性方面，不同的FHBPs基因缺失株表现出不同程度的生长变化。PGK基因缺失株在生长前期与野生型菌株差异不明显，但在对数生长期生长速度明显低于野生型菌株。这可能是由于PGK作为糖酵解途径中的关键酶，其缺失影响了细菌的能量代谢，导致细菌生长所需的能量供应不足。能量代谢是细菌生长和繁殖的基础，糖酵解途径为细菌提供了重要的能量来源，PGK基因缺失后，糖酵解途径受阻，影响了细菌的正常生长。EF-G基因缺失株在整个生长过程中生长速度均低于野生型菌株，且在对数生长期差异极显著。EF-G在蛋白质合成过程中起着关键作用，缺失EF-G可能导致细菌蛋白质合成受阻，影响了细菌的各种生理功能，从而抑制了细菌的生长。蛋白质合成是细菌生命活动的重要过程，参与了细菌的代谢、繁殖、毒力等多个方面，EF-G基因缺失对蛋白质合成的影响，进而影响了细菌的生长。OmpC基因缺失株在迟缓期和对数生长期前期生长速度与野生型菌株无明显差异，但在对数生长期后期OD600值开始低于野生型菌株。OmpC作为外膜蛋白，可能参与了细菌与外界环境的物质交换和信号传递，其缺失可能在一定程度上影响了细菌对营养物质的摄取和利用，从而在生长后期表现出对细菌生长的影响。在细胞粘附能力方面，PGK、EF-G、OmpC基因缺失株对Caco-2细胞的粘附率均显著低于野生型菌株。这表明FHBPs在鼠伤寒沙门氏菌对宿主细胞的粘附中发挥着重要作用。PGK基因缺失导致粘附率下降，可能是因为PGK参与了细菌与细胞表面受体的结合过程，其缺失破坏了细菌与细胞的粘附机制。EF-G基因缺失对粘附能力的影响较大，可能是EF-G通过调节细菌表面粘附素的表达或影响细菌的运动性，进而影响其对细胞的粘附。细菌的粘附是感染的第一步，粘附素在细菌与宿主细胞的识别和结合中起着关键作用，EF-G基因缺失可能影响了粘附素的表达或功能，从而降低了细菌的粘附能力。OmpC作为外膜蛋白，直接参与了细菌与细胞表面的相互作用，缺失OmpC破坏了细菌与细胞的粘附结构，导致粘附率下降。在血清中存活能力方面，PGK、EF-G、OmpC基因缺失株在正常血清中的存活率均显著低于野生型菌株。这进一步证实了FHBPs在鼠伤寒沙门氏菌抗补体杀伤过程中的重要作用。PGK、EF-G、OmpC与H因子结合，在抗补体杀伤途径中发挥关键作用，缺失这些基因后，补体系统对细菌的杀伤作用增强，细菌在血清中的存活能力下降。补体系统是宿主免疫防御的重要组成部分，能够识别和杀伤病原体，FHBPs基因缺失导致细菌逃避补体杀伤的能力减弱，使得细菌更容易被补体系统清除。综上所述，FHBPs基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌的生物学特性产生了多方面的影响，这些结果为深入理解鼠伤寒沙门氏菌的致病机制和免疫逃逸机制提供了重要的实验依据，也为开发针对鼠伤寒沙门氏菌的新型防治策略提供了潜在的靶点。4.6研究的局限性与展望本研究在鼠伤寒沙门氏菌H因子结合蛋白的筛选及生物学功能研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在筛选H因子结合蛋白时，采用的2D-Far-Westernblot技术虽然能够有效分离和鉴定蛋白质，但该技术对低丰度蛋白和膜蛋白的分离效果有限，可能导致部分H因子结合蛋白的漏检。此外，质谱分析过程中存在一定的误差，可能影响蛋白鉴定的准确性。在功能研究方面，本研究主要通过基因缺失株的构建和表型分析来探究H因子结合蛋白的生物学功能，但基因缺失可能会引起细菌其他基因的