菌种选育技术

《菌种选育技术》安瓿管摇瓶活化12h斜面培养24h保藏分离斜面分离保藏保藏摇瓶培养基：葡萄糖2.5g，酵母膏3.0g，玉米浆2.0g，尿素0.2g，磷酸二氢钾0.15g，水100mL，pH7.0，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却，备用。固体分离培养基：葡萄糖2.0g，酵母膏2.0g，玉米浆2.0g，磷酸二氢钾0.10g，蛋白胨营养琼脂2.0~3.0g，水100mL，pH7.0。斜面培养基：葡萄糖0.1g，酵母膏1.0g，蛋白胨营养琼脂2.0~3.0g，水100mL，pH7.0。实验准备：（1）1瓶三角瓶培养基；（2）15支斜面；（3）9支试管无菌水；（4）8~10个分离平板；（5）无菌吸管若干支、无菌涂布棒若干个。菌种选育技术一、发酵工业对菌种的要求♫

①菌种在有限的发酵过程中生长繁殖快和代谢能力强。周期短产率高高产菌株生长快速♫②菌种遗传特性稳定，不易变异退化，且菌种所要求的工艺控制比较粗放，易于控制，有利于发酵生产运行和产品质量的稳定。遗传稳定工艺粗放自发突变回复突变变异多个遗传标记的菌株基因工程菌株例如♫③发酵过程中产生的副产物少，不但有利于提高底物的有效转化率，而且目的产物分离容易，有利于降低提取成本和提高产品质量。副产物少♫④抗噬菌体感染的能力强。相对于细菌而言例如曾经选育出很多抗噬菌体的菌株♫

⑤菌种不是病源菌，对人、动物、植物和环境都不具有潜在的危害性。安全性例如γ-氨基丁酸生产菌株♫

⑥菌种具备利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分波动的敏感性尽可能小。

原料粗放例如透明质酸生产菌株怎样选育谷氨酸高产菌株？二、优良菌种选育方法自然选育诱变选育杂交育种原生质体融合技术基因工程育种♫不经过人工处理，而是根据微生物的自然突变进行筛选菌种的过程，称为自然选育。自然选育自然突变筛选宇宙射线各种短波辐射环境中的诱变物质微生物产生的诱变物质自然突变♫自然选育的一般流程♫采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。♫如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。

采样♫由于酵母类、霉菌类对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸性环境，故在植物花朵、瓜果种子及腐殖质含量高的土壤等上面比较多。酵母霉菌♫所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。增殖培养纤维素酶产生菌纤维素为唯一碳源脂肪酶产生菌植物油为唯一碳源控制其它营养控制pH控制温度添加抑制剂分离放线菌添加酚液抑制霉菌与细菌纯种分离划线法分区划线适用于浓度较大的样品连续划线适用于浓度较小的样品稀释涂布法初筛定性或半定量测定如何初筛产淀粉酶菌株？筛选产α-淀粉酶的菌株琼脂培养基加0.1%可溶性淀粉

培养后喷上碘-碘化钾溶液

产生淀粉酶的菌周围就出现透明圈无活力者呈蓝色，透明圈愈大表示活力愈高。复筛将初筛选出的菌株精确地测出其性能摇瓶培养法小型发酵罐培养法固体培养法♫诱变选育♫利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变选育。诱变筛选的典型流程出发菌株菌（孢子）悬液诱变初筛分离复筛稳定性试验特性考察诱变选育的主要环节①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高。②用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。影响诱变育种的主要因素出发菌株的选择诱变因素及其剂量的选择单孢子（或单细胞）悬液的制备前培养出发菌株的选择野生菌株生产中自发突变的高产菌株经诱变获得的高产菌株一般认为诱变获得高产菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难。再作为诱变的出发菌株，这样有可能收到比较好的效果。采用连续诱变的方法，在每次诱变之后选出3～5株较好的菌株继续诱变。如果遇到高产菌株再诱变进一步提高产量效果不佳时，可以先行杂交。单孢子（或单细胞）悬液的制备达到单细胞状态，均匀接触诱变剂。一般处理细菌的营养细胞，采用生长旺盛的对数期，其变异率较高且重现性好。霉菌和放线菌都采用孢子悬液，但孢子生理活性处于休眠状态，最好采用刚成熟的孢子。一般处理真菌的孢子或酵母时，其菌悬液的浓度大约为106个／mL。细菌和放线菌的孢子的浓度大约为108个／mL。

前培养诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20～60min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。诱变因素及其剂量的选择凡是能引起生物体遗传物质发生突然或根本改变的物质。物理诱变剂化学诱变剂紫外线、X射线、r射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光、宇宙线等。碱基类似物、烷化剂（亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等）、吖啶色素等。诱变剂的剂量绝对剂量相对剂量紫外线：erg-1/mm2

电离辐射：拉德（rad）伦琴（R）

照射时间

erg（尔格）：功的单位凡是在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。诱变育种技术实例谷氨酸高产菌株的诱变选育？出发菌株前培养菌悬液制备60Co诱变平板分离斜面摇瓶初筛60Co诱变株前培养菌悬液制备NTG诱变平板分离斜面摇瓶初筛复筛稳定性试验选出菌株出发菌株天津短杆菌T6-13前培养液体培养基摇瓶培养6~8h菌悬液制备无菌水稀释108个/mL60Co诱变60Co照射致死曲线选定500Gy作为60Co诱变剂量单位物质吸收的能量称为吸收剂量。其计量单位为戈瑞（Gy）：即是每千克物质中吸收1焦耳的能量（J/kg）。Gy

是什么？平板分离稀释涂布平板培养挑取100株以上斜面培养如何挑取菌落？平板使用定性培养基如何挑取菌落？添加显色剂添加碳酸钙添加谷氨酸结构类似物添加维生素P类衍生物抗性株：细胞膜通透性好抗性株：解除反馈抑制备份斜面摇瓶初筛斜面发酵培养基摇瓶发酵检测谷氨酸浓度选出5~10株60Co诱变结果60Co诱变株NTG诱变NTG0.02%选定30min平板分离摇瓶筛选NTG诱变结果稳定性试验传代10次（三）杂交育种♫杂交育种是指将两个不同性状个体内的遗传基因通过接合、转化、转导等转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，又称基因重组或遗传重组。常规杂交育种原生质体融合育种常规杂交育种原核微生物接合体细胞间暂时沟通，部分染色体杂合。转化细胞不接触，吸附游离DNA，少数基因杂合。转导细胞不接触，质粒、噬菌体介导，少数基因杂合。常规杂交育种真核微生物有性生殖生殖细胞融合或结合，整套染色体高频率重组。准性生殖体细胞结合，整套染色体低频率重组。♫微生物杂交育种的一般程序A+B+C-D-A-B-C+D+A+B+C+D+亲本杂交重组及重组体分离亲本菌株具有遗传标记和亲和能力营养缺陷型标记抗性标记温度敏感性标记杂交常用：混合培养法检出重组体选择性培养基检出原养型重组体原生质体融合技术♫所谓原生质体融合（protoplastfusion）就是将两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使之形成原生质体，然后在高渗条件下，并加予物理、化学或生物的助融条件，使两个亲本的原生质体相互凝集和发生融合的过程。♫原生质体融合基本过程原生质体的制备原始亲株遗传标记筛选培养转到高渗溶液加酶破壁过滤、离心沉淀转入高渗溶液高渗溶液100~250g/L蔗糖溶液原生质体的鉴定低渗爆破法荧光染色法荧光增白剂荧光显微镜原生质体融合混合培养促进融合手段物理融合剂化学融合剂电融合聚乙二醇融合体再生细胞壁再生融合体的高渗悬浮液高渗平板培养基再生菌落融合体的检出与分离重组体异核体部分结合子杂合二倍体杂合体系融合体融合体检出方法利用营养缺陷型标记选择融合体利用抗药性选择融合体用灭活原生质体检出融合体利用荧光染色法选择融合体双亲对碳源利用不同而检出融合体融合重组体检出在检出融合体的基础上进一步从中分离重组体。检出和鉴别融合重组体细胞的主要依据是亲本的遗传标记，同时还要结合DNA的含量和孢子形态等遗传学和形态学方面特性加以确定。融合重组体检出方法直接法融合产物直接分离在选择性再生培养基上，同时涂布于完全培养基上，经对照，可直接检出融合细胞。间接选择法融合产物先分离到完全培养基上，再生形成菌落后，用影印法分离到各种选择性培养基上，可长出重组体菌落。钝化选择法融合前，先把供体在50℃热处理2~3h（或其它方法处理），使其某些酶钝化而不能再生和形成菌落。而受体是营养缺陷型，经融合后，两个亲株原生质体都不能在基本培养基上生长，只有融合体才能形成菌落。（四）基因工程育种♫基因工程是指将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术，又称为DNA体外重组技术。♫基因工程育种的基本过程目的基因DNA载体